Name: 시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 포스파티딜에탄올아민 메틸트랜스퍼라아제(PEMT) 활성을 시험관내 분석으로 정량화하는 방법을 Leishmania 세포 추출물을 이용하여. 이 기술은 효소 정제 없이 지질 대사 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 NIH가 RZ에 ARRA RO3 AI078145 및 1SC3GM113743을 부여하여 지원되었습니다.

1. 세포 추출물 준비 <ol><li> 20 mM의 HEPES pH 7.4로, 100 U는 / ㎖ 페니실린, / ㎖ 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 헴 (heme) 100 μg의 보충 1X M199 만든 배지에서 26 ºC에서 기밀 캡으로 밀봉 멸균 플라스틱 병에 슈만 편모충 세포를 성장 흔들림없이, 0.35 G / L 나코 2 H, 0.1 mM의 아데닌, 2 μg의 / ㎖ biopterin. 그들은 1-2 X 107 / ml의 세포 밀도에 도달했을 때 4 ºC에서 5 분간 1,500g에서 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 피펫으로 뜨는을 취소하고 차가운 인산염 완충 식염수의 문화의 볼륨 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl의 절반에 혈청 학적 피펫으로 세포 펠렛을 재현 탁하여 세포를 씻어, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, pH 7.4로). BL2 안전 지침에 따라 세포의 상층 액을 폐기하십시오. </li><li> 원심 분리기 세포를 다시 4 ºC에서 5 분 1,500g에서. 피펫으로 상층 액을 버린다. T를 진행또는 다음 공정 o를하면 -80 ºC (최대 세 개월)에 장기 저장을 위해 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결 스냅. </li><li> 배 용해 버퍼 (0.5 M 자당, 0.1 M TrisHCl, pH7.5, 2 mM의 EDTA 및 배 프로테아제 억제제 칵테일)를 준비하고 얼음에 4 ºC에서 보관하십시오. </li><li> 배속 용해 완충액의 동일 부피 (신선하거나 냉동) 세포 펠릿을 재현 탁. 유리 구슬의 1X 볼륨을 추가합니다. 소용돌이 적극적으로 10 분 동안 4 ºC에서. </li><li> 1X 용해 버퍼의 2 볼륨을 추가하고 혼합한다. 10 분 동안 4 ºC에서 1,500 XG에 원심 분리기 세포 추출물은 끊어지지 세포와 핵 펠렛합니다. </li><li> 신선한 시원한 원심 분리기 튜브에 피펫으로 뜨는을 전송하고 실험이 완료 될 때까지 얼음에 세포 추출물을 유지합니다. </li></ol> 2. 이러한 Bicinchoninic 산 분석으로 단백질 평가 키트를 사용하여 세포 추출물의 단백질 농도를 결정 <ol><li> bicinchoninic 산을 준비 (BCA) 솔루션 (BCA)과 구리 (II)를 혼합하여 (1 ㎖ / 튜브)의(49)의 비율 ulfate : 1 (V / V). </li><li> 단백질 표준을 제조 0, 10, 20, 30, 40, 50, 및 BCA 용액 1 ml의 분취 량으로 10 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA) 원액을 희석하여 60 ㎍ / mL로. </li><li> 중복에 BCA 용액 1 ml의 세포 추출물의 2 μl를 추가합니다. 미리 예열 60 ℃ 수조에서 10 분 동안 표준 및 단백질 시료를 배양한다. </li><li> 전송 샘플은 3 분 동안 얼음. 562 nm의 파장에서 분광 광도계 표준 및 단백질 샘플의 흡광도를 측정한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 기술 된 바와 같이 참조로서 BSA 표준을 사용하여 세포 추출물의 단백질 농도를 계산한다. 1X 용해 완충 용액과 10 밀리그램 / 단백질의 농도로 세포 추출물을 희석. </li></ol> 튜브에 200 μL 3. 효소 분석 참고 : 화학 후드에서 다음 단계를 수행하십시오. <ol><li> 15 ml의 중복 각 샘플을 테스트원뿔 튜브. 튜브 당 20 μL (1) M TrisHCl pH가 7.5을 준비하고 얼음에 보관하십시오. 각각의 튜브에 대한 실온에서; (솔루션을 정지 1 (V / V) 1) 클로로포름 / 메탄올 2 ㎖를 준비합니다. </li><li> 피펫 얼음에 각 15 ML 원뿔 튜브에 1 M TrisHCl의 pH 7.5의 20 μL. </li><li> 여기에에서 방사선 안전 지침을 따르십시오. SAM의 50.06 μm의 총 튜브 당 [메틸 3 H] 아데노-L 메티오닌 50 μm의 차가운 SAM - 0.06 μM (0.2 μCi를) S에 해당하는 추가. 찬물 μL 추가 x 여기서 x = 200 - ((20) (+ 세포 추출물 20 () + 추위와 방사성 SAM의 볼륨) 버퍼) 튜브 당. </li><li> 미리 예열 30 ºC 물을 욕조에 각 원뿔 튜브를 전송합니다. 반응을 시작하기 위해 각 튜브에 세포 추출물 (단백질 200 μg의 동일)의 20 μl를 추가합니다. 원하는 시간 (0-45 분)에 대한 품어. </li><li> 클로로포름 / 메탄올 2 ㎖ 첨가하여 반응을 정지 (1 : 1, V / V, 정지 용액) 각각의 튜브를. (실온 20 ~ 25을 원뿔 튜브로 이동6; C). </li></ol> 4. 지질 추출 참고 : 화학 후드에서 다음 단계를 수행하십시오. <ol><li> 효소 반응 샘플을 포함하는 각 튜브에 물을 700 μl를 추가합니다. 적극적으로 30 초 동안 소용돌이. RT에서 5 분 동안 1,500 XG 원심 분리기는 물, 유기 상으로부터 분리한다. </li><li> 피펫 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 낮은 유기 상을 전송합니다. 30 초 동안 적극적으로 튜브와 소용돌이를 포함하는 각각의 &quot;낮은 단계&quot;에 물 1 ML을 추가합니다. 다시 원심 분리기에서 5 분 동안 1,500 XG에서 수상으로부터 유기물을 분리. </li><li> 피펫 섬광 관에 낮은 유기 상을 전송합니다. N 2의 스트림에서 건조 샘플. 비 방사성 혼입 SAM 방사선 지침에 따라 방사성 원추형 튜브를 함유하는 물 상을 폐기. </li><li> 2 ㎖ / 섬광 액체의 튜브를 추가합니다. 섬광 COU와 통합 된 방사능을 측정nter 제조 업체의 프로토콜과 기기의 사용에 따라. </li><li> 하기 일반 식을 이용을 nmol / mg의 단백질의 효소 활성을 계산한다 : CPM 값 × 10 3 × [SAM (MM)의 총 (방사성 차가운) 농도] 방사성 SAM (Cl / mmol)의 X의 X 5 특정 활동 [방사성 SAM의 농도 (MM)] 참고 : 위의 프로토콜에 의존 SAM 농도 또는 단백질에 의존 PEMT 분석을 위해 변경 될 수 있습니다. SAM 농도 의존 효소 분석을 위해, 시간 동안 단백질에 의존 PEMT 분석, SAM의 농도 분석에 추가됩니다 상수 (선형 범위에서 15 분) 차가운 SAM의 다양한 양을 유지 (우리는 mM의 0.05를 선택) 및 시간 상수 (15 분) 유지됩니다. 또한 완충액의 pH는 약 PEMT 효소는 다른 최적의 pH 값을 가질 경우, 필요에 따라 변경 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다

이 단순한 빠른 PEMT 분석은 단백질 원으로 전체 세포 추출액을 이용하여 PE 상 SAM에서 방사성 메틸기의 전달로 인한 PE의 메틸화 된 형태의 정량을 허용한다. 그것은 빠르고, 민감한, 재현성, 정제 효소 17도 적합하다. 관심 메틸화 된 오히려 PE 12,13,18,19보다 이들 기판에 특정한 경우 Monomethyl- 또는 디메틸 PE는 상기 분석에 첨가 될 수있다. 정제 PEMT 효소가 사용되는 경우, PE는 분석에 첨가 될 수있다. 이 프로토콜의 한계는 분석이 반응 제품 (모노-PE, 디메틸 PE 또는 PC)를 식별하지 않습니다. 20, 21에서 설명하지만, 반응 생성물 (모노-PE, 디메틸 PE, PC)의 아이덴티티는 또한 하나의 차원 박층 크로마토 그래피에 의해 분석 될 수있다. 또한, 이러한 S의 -adenosylhomocysteine ​​및 5&#39;- methylthioadenosine로서 SAM 분해 산물의 일부는 PEMT 활동...

포스파티딜 에탄올 아민의 메틸화 된은 (PEMT) 효소 모노-PE, 디메틸 PE 및 / 또는 제공하기 위해 PE, 모노 - PE 또는 디메틸 PE 상 메틸기 공여체로서 S의 -adenosylmethionine (SAM)을 사용하여 하나 이상의 메틸 그룹의 공유 결합을 촉진 포스파티딜콜린 (PC). 이 효소는 동물 세포와 곰팡이에 거의 어디에나 있습니다. 이들은 또한 몇몇 식물 1 세균의 약 10 %, 진핵 2와 상호 작용하는, 특히에서 찾을 수있다. PEMTs이뿐만 아니라, 다른 중요한 세포 기능을 다함으로써 동물 세포에서 주요 지질 클래스 PC의 생산에 기여함으로써 세포 생물학에 적합하다. 포유류에서 PEMTs 주로 그들은 매우 저밀도 지질 단백질의 정상적인 분비에 필요한 간에서 발현되며, 또한식이 유도 비만 (3), 동맥 경화증 (4)에 기여하고, 인슐린 저항ANCE 5. 또한, 포유류 PEMT은 비록 낮은 수준으로, 지방 세포에서 발현, 지방 침착 (6, 7)에 참여하고 있습니다. 암 발생 8, 9 사멸 및 세포 증식 10 PEMT 역할도 입증되었다. 박테리아, PEMT 효소는 숙주 식물 (11)와 정상 세포 성장 2, 2 병독성과 공생 중요한 것으로 밝혀졌다. 본 프로토콜의 목적 및 근거는 효소를 정제 할 필요없이 전체 세포 추출물로부터 PEMT 활성을 측정하는 방법이다. 두 가지 프로토콜 PEMT 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 첫 번째 가장 일반적인 하나는이 문서의 주제 PE, 상 방사성 SAM에서 삼중 메틸 그룹의 전송을 측정한다. 이 프로토콜은 원래 underst을 얻기 위해 효모 및 포유 동물 세포 (12) (간) (13)로부터 PEMT 활성을 측정하기 위해 개발되어왔다이들 세포에서 PC 생합성 AND 작업뿐만 아니라 이들 효소의 특이성을 결정한다. 나중에,이 기술 및 원생 동물 기생충 14 (15 비록 분석 용 염기성 pH 값을 이용하여) (2) 박테리아와 같은 다른 세포 유형에 적용되고있다. 이 기술은 전체 세포 추출물뿐만 아니라, 정제 된 효소로 사용할 수 있고, 잠재적으로 모든 세포 추출물 시스템에 적용 할 수있다. 비 방사성 분석도의 S -adenosylhomocysteine, SAM (16)의 transmethylation 생성물의 정량 효소에 의존하는 설계되었다. 이 방사능을 포함하지 않는 한 후자의 분석은 더 편리 할 수​​ 있지만 정제 효소에만 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>S-[메틸-3H]아데노실-L-메티오닌(5-15 Ci/mMole의 특정 활성)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>시약을 분취하고 -20°C에서 동결합니다. C; 이 시약을 사용하는 동안 방사선 안전 지침을 따르십시오</td></tr><tr>.<td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>그것을 신선하게 희석하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 구슬, 산성 세척, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic 산 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>섬광 카운터 MicroBeta2 with 1-detector</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계 Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA 재고 용액 (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>신틸레이션 액체&nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>은 시약을 20mM HCl로 희석하고 -80°C에서 부분 표본을 동결합니다. 씨&nbsp;</td></tr></tbody></table>

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

포스파티딜에탄올아민 메틸트랜스퍼라제는 S-아데노실-L-메티오닌에서 포스파티딜에탄올아민, 모노메틸-포스파티딜에탄올아민 또는 디메틸-포스파티딜에탄올아민으로 하나 이상의 메틸기를 전달하여 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 제공하는 생합성 효소입니다. 이러한 효소는 동물 세포, 곰팡이에서 흔히 볼 수 있으며 박테리아의 약 10%에서도 발견됩니다. 이들은 인슐린 저항성, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 세포 성장 또는 독성과 같은 지질 대사에서 직접적인 역할을 하는 것 외에도 세포 생리학에서 다양한 중요한 기능을 수행합니다. 본 원고는 전체 세포 추출물을 효소 공급원으로 사용하여 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 phosphatidylethanolamine으로의 삼중화 메틸기의 전달을 측정하는 간단한 cell-free 효소 분석에 대해 보고합니다. 생성된 포스파티딜에탄올아민의 메틸화 형태는 소수성이므로 유기 추출에 의해 수용성 S-[메틸-3H]아데노실-L-메티오닌으로부터 분리될 수 있습니다. 이 분석은 잠재적으로 다른 세포 유형에 적용할 수 있으며 효소를 정제할 필요 없이 관심 있는 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소에 특이적인 억제제/약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

도 1은 기판으로서 PE를 사용하여 내인성 효소 원으로서 Leishmania의 전체 세포 추출물로 행하여, 시간 종속 PEMT 분석을 보여준다. 유기 상 중의 방사능의 양을 섬광 계수에 의해 정량화 하였다. 얻어진 번호는 PE 삼중 전사 메틸기의 양을 계산하는데 이용되었다. PEMT 활성은 약 20 분 동안 선형이었다. 그런 다음, 또 다른 15 분 동안 일정한 머문 후 약 30 분에서 정체기에 도달했다. 예상대로 더 셀 추출물 분석 (그림 2)에 추가되지 때, PEMT 활동은 검출되지 않았다. 또한,이 활성의 억제제 L. 100 μM의 옥타 데실 브로마이드의 존재하에 폐지 주요 체육 methyltransferases LMJ PEM1 및 LMJ PEM2 (14). PEMT 활성은 ...

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

본 방법론의 전반적인 목표는 전체 세포 추출물로부터 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소(phosphatidylethanolamine methyltransferase) 또는 PEMT 활성을 정량화하는 것입니다. 이 방법을 통해 포스파티딜콜린 생합성에 있어 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소가 갖는 중요성과 같은 지질 대사 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜의 주요 장점은 효소 정제 과정 없이 전체 세포 추출물에서 직접 측정할 수 있다는 점입니다.따라서 이 프로토콜은 기생충이 가장 풍부한 지질인 phosphatidylcholine을 어떻게 합성하는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 포유류 세포나 박테리아와 같은 다른 세포 유형에도 적용 가능합니다. Leishmania 세포를 보충제가 첨가된 M199 배지에서 26 °C로 유지하며, 밀폐 캡으로 밀봉된 멸균 플라스틱 병에 넣어 교반 없이 배양합니다.4°C에서 1500G로 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 세포 밀도가 mL당 1,000만에서 2,000만 개에 도달했을 때 수행하십시오. 피펫으로 상층액을 제거한 후, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 배양액 부피의 절반에 해당하는 차가운 인산완충생리식염수(PBS)로 재현탁하여 세포를 세척합니다.세포를 4°C에서 1550G로 5분 동안 다시 원심분리합니다. 파이펫으로 상청액을 제거합니다. 다음 단계로 진행하거나, -80°C에서 장기 보관하기 위해 세포 펠렛을 액체 질소로 급속 냉동합니다.다음으로, 세포 펠릿을 동일한 부피의 2X lysis buffer에 다시 현탁합니다. 1X 부피의 유리 구슬(glass beads)을 추가하고 4°C에서 10분 동안 격렬하게 볼텍싱합니다. 2배 부피의 1X lysis buffer를 추가하고 혼합합니다.그 후, 파쇄되지 않은 세포와 핵을 침전시키기 위해 세포 추출물을 1500G, 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 피펫으로 새로운 냉각 원심분리 튜브에 옮기고, 실험이 완료될 때까지 세포 추출물을 얼음 위에 보관합니다. bicinchoninic acid 용액 1mL에 세포 추출물 2µL를 첨가하며, 이를 중복 수행합니다.표준물질과 단백질 샘플을 60 °C로 예열된 항온수조에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 얼음에 옮겨 3분 동안 방치합니다. 분광광도계를 사용하여 562 nm 파장에서 표준물질과 단백질 샘플의 흡광도를 측정합니다.제조업체의 프로토콜에 설명된 대로 소 혈청 알부민 표준물을 참조하여 세포 추출물의 단백질 농도를 계산합니다. 1X lysis buffer를 사용하여 세포 추출물을 단백질 농도 10 mg/mL가 되도록 희석합니다. 화학 흄 후드 내에서, 15 mL 원심분리관에 각 샘플과 중복 샘플을 넣어 테스트합니다.튜브당 1 M TrisHCL pH 7.5 20 µL를 준비하여 얼음에 보관하십시오. 또한 각 튜브를 위해 2 mL의 클로로포름-메탄올 정지 용액을 상온에서 준비하십시오. 얼음에 보관된 각 15 mL 원심 분리 튜브에 1 M TrisHCL 20 µL를 피펫팅하여 넣으십시오.그 다음 방사선 안전 지침에 따라, 튜브당 0.06 µM의 tritium 표지 SAM과 50 µM의 비표지 SAM을 추가하여 총 50.06 µM의 SAM 농도로 맞춥니다. 이 시점에서 텍스트 프로토콜에 따라 계산된 양의 냉수를 각 튜브에 첨가합니다. 각 코니컬 튜브를 30 °C로 예열된 항온수조로 옮깁니다.반응을 시작하기 위해 각 튜브에 20 µL의 세포 추출물을 첨가합니다. 원하는 시간 동안 시료를 배양합니다. 각 튜브에 2 mL의 클로로포름 메탄올을 첨가하여 반응을 중단시킵니다.원추형 튜브를 상온으로 옮깁니다. 화학 흄 후드 내에서 효소 반응 샘플이 들어 있는 각 튜브에 700 µL의 물을 첨가합니다. 30초 동안 격렬하게 볼텍싱합니다.그 다음, 유기상과 수성상을 분리하기 위해 상온에서 1500g로 5분 동안 원심분리합니다. 하층을 옮길 때 수성상이 섞이지 않도록 주의하는 것이 매우 중요한데, 이는 분석 계산에 편향을 줄 수 있기 때문입니다. 피펫을 사용하여 하층의 유기상을 새로운 15 milliliter 원심분리용 튜브로 옮깁니다.하층이 포함된 각 튜브에 1 mL의 물을 추가하고 30초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 그 다음, 1500G에서 5분 동안 다시 원심분리하여 유기층과 수층을 분리합니다. 피펫을 사용하여 하층의 유기층을 신틸레이션 튜브로 옮깁니다.질소 가스 흐름 하에서 샘플을 건조합니다. 결합되지 않은 방사성 SAM이 포함된 수층과 방사성 원추형 튜브는 방사선 관리 지침에 따라 폐기하십시오. 다음으로, 튜브당 2 mL의 신틸레이션 용액을 첨가합니다.제조업체 프로토콜 및 사용 기기에 따라 신틸레이션 카운터로 통합된 방사능을 측정하십시오. 텍스트 프로토콜에 기재된 식을 사용하여 단백질 밀리그램당 나노몰 단위로 효소 활성을 계산하십시오. 여기에서는 내인성 PE를 기질로 사용하여 Leishmania 전체 세포 추출물을 효소원으로 활용해 수행한 시간 의존적 PEMT 분석 결과가 제시되어 있습니다.유기상 내의 방사능 양을 신틸레이션 계측으로 정량화하여 PE로 전이된 트리튬 표지 메틸기의 양을 계산하는 데 활용하였습니다. PEMT 활성은 약 20분 동안 선형적으로 나타났습니다. 이후 약 30분 시점에 도달하여 정체기에 진입하였으며, 이후 15분 동안 일정하게 유지되었습니다. 예상대로 세포 추출물을 첨가하지 않았을 때는 PEMT 활성이 검출되지 않았으며, 세포 추출물을 분석법에 첨가했을 때는 활성이 검출되었습니다.또한, leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferase인 LMJ PEM One 및 LMJ PEM two의 특이적 억제제인 100 micromolar octadecyltrimethylammonium bromide 존재 하에서 이 활성은 소실되었습니다. PEMT 활성은 단백질 농도에 의존적이었으며, 이 활성은 효소 분석에 사용된 단백질 양에 선형적으로 비례하였습니다. 마지막으로 SAM 농도 의존적 PEMT 분석을 수행하여 SAM 농도를 증가시키며 테스트하였습니다.PEMT 활성은 약 0.5 mM의 SAM 농도에서 정점에 도달했습니다. 이 프로토콜은 샘플 수에 따라 3~5시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, SAM 화합물은 불안정하므로 최근에 구매한 SAM을 사용하는 것이 매우 중요합니다.병원체 및 방사성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 따라서 안전 지침을 준수하고 적절한 실험실 보호구를 착용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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