Name: miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 배우세요 뇌 특정 miRNA 노크다운 방법을 생쥐 모델에서. 세포 침투 펩타이드와 LNA 수정 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용해 혈액-뇌 장벽을 극복하고 신경퇴행 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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안타고미르 설계에 도움을 준 Souvik Maiti에게 감사드립니다. 또한 실험 방법에 도움을 준 Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey 및 Bijay Pattnaik에게 감사드립니다. 이 작업은 과학 및 산업 연구 위원회(BSC0123)의 자금 지원을 받았습니다. HS, MV 및 RR은 인도 과학 및 산업 연구 위원회(Council of Scientific and Industrial Research)의 펠로우십을 인정합니다. MAS는 인도 대학 보조금 위원회(University Grants Commission)의 펠로우십을 인정합니다.

참고 : 동물 과목을 포함한 모든 절차는 기관 동물 윤리 유전체학 연구소의위원회 (IAEC)와 통합적인 생물학, 뉴 델리에 의해 승인 된 (IGIB / AEC / 2,013분의 10). 이 프로토콜은 특히은 miR-29의 뇌와 최저의 Antagomir-29의 표적 전달을 위해 조정됩니다. 1. Antagomir 디자인 전략 <ol><li> miRBase (11)의 성숙한 miRNA의 순서를 검색 ( <a href="http://www.mirbase.org/">http://www.mirbase.org/</a> ). </li><li> miRBase 레코드 &quot;유전자 패밀리&quot;링크를 사용하여 관련 miRNA의 가족 구성원의 서열을 검색 ( <a href="http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009">http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009</a> ). </li><li> 순서를 보완 역 : <a href="http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html">http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html이</a> 할 수있는 편리한 도구를 제공합니다보완 순서를 역. </li><li> 다음 지침에 따라 LNA에 의해 수정 될 수있는 위치를 표시 : <ol><li> LNA의 피리 미딘는 퓨린 (12)보다 더 안정적이기 때문에, LNA의 수정을 위해 3 ~ 4 기지 떨어져 배치 티민 잔류를 선택합니다. </li><li> 이전 단계가 5 개 미만의 수정을 생성하는 경우 3-4 잔류 물에 의해 분리 된 시토신 잔류를 선택합니다. </li><li> 이 시드 서열을 방지하기 때문에, antagomir의 5 &#39;말단에 다섯 수정 우선 순위. </li></ol></li></ol> 2. Antagomir - 신경 펩타이드 복합 준비 주 :이 프로토콜에서 가장 중요한 단계이며 표준화를 필요로한다. 임의의 형광 표지 된 올리고 뉴클레오타이드 (FLO)는 antagomir 9 대신에 사용될 수있는 프로토콜을 표준화. 펩티드 고순도이어야한다 (HPLC 등급은 98 % 순도) 및 .Sequences 펩타이드 antagomir의 전하를 표 1에 나타내었다. <ol><li> MO의 수를 결정할antagomir의 레는 마우스의 antagomir, 독성 및 무게에 몰 요금을 기준으로 주입한다. 펩티드 : 펩티드의 몰수를 계산하는 분사 antagomir 몰 투입 비율에 기초한다. 참고 : 마우스 뇌의 독성 및 효과적인 전달을위한 펩타이드 : antagomir 몰 충전 비율을 표준화. 표준화를위한 펩타이드 : 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 다른 몰 충전 비율을 사용합니다. 우리는 Antagomir-29 및 제어 마우스의 4microgram / g의 체중에서 독성이 두 사실을 발견했습니다. Antagomir-29 및 제어 2microgram / g 체중으로 사용되었지만,이 유효 농도는 각각의 마이크로 RNA에 따라 다를 가능성이있다. </li><li> 1 단계에서 계산 된 목적하는 최종 농도로 멸균 10 % D 글루코스 원액으로부터 미세 원심 분리 튜브에 펩티드 antagomir 희석. </li><li> 적당한 텍싱 속도 소용돌이에 펩타이드 용액으로 미세 원심 튜브를 유지한다. </li><li> 1/3 번째 추가이 와류 믹서에서 충분히 혼합하면서 펩티드 용액 튜브에 ntagomir 용액을 천천히, 적가. </li><li> 다음으로 1 분 동안 와동에 용액의 혼합을 계속 한 다음, 혼합물을 1 분 동안 방치한다. </li><li> 같은 미세 원심 분리 튜브에 펩타이드 솔루션 나머지 antagomir 솔루션을 혼합하는 단계 4와 5를 두 번 더 반복합니다. 느린 첨가는 형질 효과적이다 모노 - 분산 복합체의 형성에 중요하다. 빠른 추가는 단지 그들의 강수량의 집합으로 이어질 수 있습니다. </li><li> 텍싱없이 RT에서 30 분 동안 인큐베이션 복합체. 배양이 기간 동안 주사가 수행 될 실험실 쥐를 순응. </li></ol> Antagomir - 신경 펩타이드 콤플렉스 3. 꼬리 정맥 주입 <ol><li> 동물을 억제하기 위해, 적절한 크기의 제한 수단 또는 decapicone에 마우스를 놓습니다. </li><li> 면봉 홍보를 사용하여 꼬리의 표면을 청소전자 적신 따뜻한 물 (약 40 ℃)에서. 이는 혈관 확장을 촉진하고 혈관의 가시성을 증가시킬 것이다. </li><li> 15 ~ 20 ° 각도로 - (1.0 CC 0.5) 인슐린 주사기 작은 볼륨 꼬리에 접근. 주사기에있는 공기를 도입하지 않도록주의하십시오. 꼬리의 말단부에 시작한다. 단지를 주입. 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 주사 부위 (약 5 ~ 10 초)에 직접 살균 면봉을 적용합니다. </li><li> 농축과 옥수수 속대와 티슈 페이퍼로, 3-5의 그룹에서 개별적으로 환기 케이지에 마우스를 교체합니다. 같은 케이지에서 uninjected 및 주입 쥐를 보관하지 마십시오. </li></ol> 4. 행동 분석 실험 주 : 주사 후 회복을 허용하기 위해 주입 및 행동 분석 사이에서 3-4 시간의 시간 간격을 유지. 조용한 방에 마우스를 가져 오십시오. 적응의이 기간 동안 동물을 방해하지 마십시오. <ol><li> 마우스를 순응새로운 방 30 분 후 다음 행동 분석을 시작합니다. 각각의 행동 분석 사이에 10 분의 간격을 유지합니다. </li><li> 뒷다리 물림쇠 : 참고 :이 테스트는 운동 기능 장애 및 신경 손상을 나타냅니다. <ol><li> 분명 배경에 꼬리 근처에 기반을 잡고 부드럽게 마우스를 올립니다. </li><li> 10 ~ 15 초 동안 사지의 위치를​​ 확인합니다. 실조 마우스가 시간의 50 % 이상 13 현탁 복부쪽으로 한쪽 또는 양쪽 뒷다리 경향 후퇴하면서 야생형 마우스 splays 멀리 복부에서 뒷다리. </li><li> 케이지에 마우스를 반환 </li></ol></li><li> 난간에 시험 : <ol><li> 꼬리를 잡고 부드럽게 마우스를 올려 케이지의 선반에 보관하십시오. </li><li> 케이지의 모서리에 구체적으로 마우스를 관찰합니다. 야생형 마우스는 두려움과 균형을 잃지 않고 쉽게 모서리를 전달할 수 있습니다. 케이지 선반을 따라 코너에 걷는 동안 운동 실조증 마우스는 균형, 동결을 잃거나 흔들립니다. </li></ol></li><lI&gt; 마우스 발 인쇄 분석 : 참고 :이 분석은 좁은 통로의 바닥에, 준비 흡수 시트를 유지 (~ 70 센티미터 길이 ~ 5 cm 전체 ~ 5 cm의 높은 벽.) <ol><li> 한 손으로 부드럽게 마우스를 잡고 브러시에 의해 뒷다리에 잉크를 적용합니다. </li><li> 좁은 활주로 바닥에 흡수 시트를 놓습니다. </li><li> 마우스를 걷거나 다른 한 끝에서 활주로에 직선으로 흡수 시트를 통해 실행할 수 있습니다. </li><li> 신선한 흡수 시트를 사용하여 각 마우스로 과정을 두 번 더 반복합니다. </li><li> 전방 이동에 두 개의 연속 단계들 사이의 거리를 측정한다. 동물은 단지 각각 시작과 실행을 마무리된다 처음과 마지막 몇 발자국를 포함하지 마십시오. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+novel+therapeutic+targets+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases.</a> Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).</li>
<li>Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%3A+Implications+for+Alzheimer+Disease+and+other+Human+CNS+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders.</a> Current Genomics. 10, 154-168 (2009).</li>
<li>Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+Disease+and+Potential+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications.</a> Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).</li>
<li>Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promise+of+MicroRNA+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">The Promise of MicroRNA Replacement Therapy.</a> Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).</li>
<li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3, 1-17 (2012).</li>
<li>Trang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Delivery+of+Tumor+Suppressor+microRNA+Mimics+Using+a+Neutral+Lipid+Emulsion+Inhibits+Lung+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice.</a> Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).</li>
<li>Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+Injection+of+MicroRNA-expressing+Lentiviruses+to+the+Mouse+Hippocampus+CA1+Region+and+Assessment+of+the+Behavioral+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome.</a> J Vis Exp. (76), e50170(2013).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Roshan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-specific+knockdown+of+miR-29+results+in+neuronal+cell+death+and+ataxia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice.</a> RNA. 20, 1287-1297 (2014).</li>
<li>Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+DNA%E2%88%92RNA+Heteroduplex+Formation%3A+Effects+of+Locked+Nucleic+Acid+Nucleotides+Incorporated+into+the+DNA+Strand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand.</a> Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+Chemistry+and+Therapeutic+Applications+of+Locked+Nucleic+Acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA).</a> Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).</li>
<li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Composite+Phenotype+Scoring+System+for+Evaluating+Mouse+Models+of+Cerebellar+Ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia.</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Approaches+for+Neuronal+Delivery+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids.</a> Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).</li>
<li>Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptide-Mediated+Therapeutic+Molecule+Delivery+into+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System.</a> Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).</li>
<li>Hwang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brain-targeted+rabies+virus+glycoprotein-disulfide+linked+PEI+nanocarrier+for+delivery+of+neurogenic+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA.</a> Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에서 우리는 miRNA 조절의 효과를 연구하기 위해 널리 접근 가능한 방법론을 보여줍니다. 현재 miRNA 기능의 생체 내 특성화에 대한 대부분의 시도는 녹아웃 마우스 또는 miRNA 스폰지를 발현하는 형질전환의 생성을 포함합니다. 대부분의 miRNA, 심지어 세포 유형 특이적 miRNA도 둘 이상의 기관에서 발현됩니다. 예를 들어, 처음에는 조혈계에 특이적이라고 생각되었던 miRNA도 미세아교세포의 존재로 인해 뇌에서 발현됩니다. 따라서 세포 유형 특이적 프로모터의 제어 하에 miRNA에 대한 안티 센스 제제를 발현하는 세포 유형 특이적 녹다운 전략조차도 다발성 효과를 생성할 가능성이 높습니다. 예를 들어, miRNA의 miR-29 계열은 뇌, 혈액 세포 및 신체의 다른 여러 부위에서 발현됩니다. 따라서 miRNA 조절을 위한 유전 도구는 널리 적용되지 않습니다. 또한 약물 개발이나 잠재적인 치료 전략의 테스트에도 적합하지 않습니다. 
간단한 ...

마이크로 RNA에 의한 유전자 발현과 질병에의 참여에 대한 직접적인 증거의 규제에서의 보편적 인 역할에 새로운 치료 대상으로 등장했다. 약물이 1, 2를 대상으로 miRNA가 적극적으로 자신의 잠재력에 대한 탐구되고있다. 더욱이, miRNA의 발현의 변화가 여러 질환 3의 miRNA 발현의 인공 섭동에 의한 이러한 변화의 시뮬레이션과 관련된 질병의 발현에 관여하는 세포 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. miRNA의 표적 약물의 조직 특정 배달은 현재의 miRNA 기반 신약 개발의 주요 과제입니다. Antagomirs 및 miRNA의 모방은 miRNA의 레벨 4-6을 교란하기위한 유망 에이전트입니다. 그러나, 특이성 및 효능을 향상 특징들은 miRNA의 발현 생체 섭동에 사용될 수 있기 전에 antagomirs의 디자인에 혼입 될 수있다. 마이크로 RNA는 특히 관련이<html> 현재 불치의 퇴행성 신경과 신경 발달 질​​환 대상으로. 혈액 - 뇌 장벽은 뇌에 antagomirs의 전달에 제한을 포즈. 정위 주사 널리 7 뇌의 특정 위치로 분자를 전달하는 설치류 모델에서 사용된다. 그것은 기술, 계측 및 시간에 광범위한 투자를 필요로한다. 정위 주사는 적어도 경미한 부상의 원인, 수술을 포함하고 로컬 배달로 제한됩니다, 침략이다. 표적 뉴런의 설정에 셀 관통 펩티드의 사용은 트랜스 혈관 경로를 통해 전달 될 수 있기 때문에 이러한 제한에 대응하지만, 혈액 뇌 장벽을 위반할 수있다. 광견병 바이러스 당 단백질 (RVG) 유래의 펩타이드 등, 이전 쥐 8 일본 뇌염 바이러스에 대한 siRNA를 전달하기 위해 사용되었다. 우리는 antagomir 배달 펩타이드를 사용하여,의 miRNAs 효과적으로 할 수 마우스 뇌 9 무너 뜨렸다 수 있다는 것을 발견했다. ontent &quot;&gt;의 miRNA의 두 번째 주요 과제는 노크 다운의 miRNAs의 작은 크기와 밀접한 관련이 시퀀스 동종의 존재에서 발생한다. 우리는 세 밀접하게 관련 동종 구성-은 miR-29 MMU 가족의 예를 취할 미르-29A 핵산 (LNA들)이 그들은 심지어 열 안정성을 향상시키고 또 다른 장점을 제공 잠금, b와 c. Antagomirs는 일반적으로 안정성을 높이고 뉴 클레아의 공격에 저항하는 렌더링하는 백본을 따라 수정됩니다. 이상과 그 이후 저하를 대상으로지도 입체 장애 (10). 모든 백본을 따라 수정을 소개하는 것은 효과가 있지만 비용이 많이들 수 있습니다. 우리는 이전의 최적의 수를 넘어 수정이 더 효과를 강화하지 않을 수 있음을 보았다. antagomir의 디자인은 따라서 antagomir의 최적의 수정을 포함한다. 복잡한 antagomir 비공유 노나 아르기닌 확장에 neurotropic 펩타이드, 충전 헵타와 함께 사용된다. D-아르기닌그들은 단백질 분해 효소에 의해 분해에 민감하지 않은으로 높은 안정성을 부여하기 때문에 잔류 물이 사용된다. 노나 아르기닌까지 뻗어 헵타은 세포 유형 특이성을 부여하지 않지만, 효율적인 세포 침투제의 역할. 공유 노나 아르기닌 링커 neurotropic, 세포 투과 펩티드가 생성되었던 RVG 펩티드 연결함으로써. 펩티드의 양으로 하전 된 잔기가 복합체를 형성하기 위해, 음으로 하전 된 핵산 백본과 상호 작용. 이러한 착물은 효과적으로 배양 세포 내로 생체 내에서 조직 내로 DNA 또는 RNA를 형질 감염 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restrainer 또는 Decapicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>좁은 활주로</td><td></td><td></td><td>~길이 70cm, 너비 ~5cm, 벽은 ~5cm입니다.</td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 표지 올리고뉴클레오티드(siGLO)</td><td>GE Healthcare Dharmacon INC</td><td>D0016300120</td><td></td></tr><tr><td>10% 멸균 D-포도당</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-29</td><td>Exiqon</td><td>맞춤형 합성</td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-control</td><td>Exiqon</td><td>맞춤형 합성</td><td></td></tr><tr><td>Neuropeptide RVG</td><td>G.L.Biochem ( 상하이) Ltd.</td><td>주문 종합</td><td>>98% 순수성</td></tr><tr><td>Neuropeptide RVM</td><td>G.L.Biochem (Shanghai) 주식 회사.</td><td>주문 종합</td><td>>98% 순수성</td></tr><tr><td>다른</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>면</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>온난한 물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡수성 장</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>잉크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>솔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>방부제</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mirna의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs(miRNAs)는 유전자 발현의 핵심 조절자입니다. 뇌에서 신경 발달 및 신경 기능과 같은 중요한 과정은 microRNA의 올바른 발현에 달려 있습니다. 뇌에서 microRNA의 섭동은 신경 세포 사멸을 조절하여 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 정위 주사(stereotactic injection)는 miRNA 녹다운(knockdown) 제제를 뇌의 특정 위치로 전달하는 데 사용됩니다. 여기에서는 고정 뉴클레오티드 변형(LNA)이 있는 miRNA에 대해 antagomir를 설계하는 전략에 대해 논의합니다. 그런 다음 뇌의 여러 영역에 걸쳐 균일하게 antagomirs를 뇌 특이적으로 전달하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정위 주사에서 수술, 관련 부상 및 국소 전달의 한계를 극복하기 때문에 간단하고 널리 적용할 수 있습니다. 우리는 miRNA-29에 대항하여 안타고미르와 함께 신경영양성 세포 침투 펩타이드 광견병 바이러스 당단백질(RVG) 복합체를 준비하고 꼬리 정맥을 통해 주입하여 뇌에 특이적으로 전달했습니다. antagomir 설계는 miRNA의 특정 표적화와 펩타이드와의 비공유 복합체를 형성할 수 있는 기능을 통합했습니다. 신경 세포에서 miRNA의 knockdown은 apoptotic cell death 및 관련 행동 결함을 초래했습니다. 따라서, 방법은 miRNAs의 섭동을 통한 신경 퇴행의 급성 모형을 위해 이용될 수 있습니다.

여기에 제시된 절차를 이용하여 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 50microgram (FLO)와 전하 ~ 1시 15분 몰 비율의 850microgram RVG 펩타이드 복합체 (FLO : 펩티드)을 준비하고, 꼬리 정맥을 통해 한 번만 주입 하였다. 비 neurotropic 광견병 바이러스 매트릭스 (RVM) 펩티드 및 FLO의 복합체는 대인 대조군으로 사용 하였다. 다음날, 마우스 뇌 및 간을 분리 하였다 및 단일 세포 현탁액을 제조 하였다. 세포는 녹색의 형광 현미경으로 관찰 하였다. FLO-RVG 착체 성공적 아니지만 RVM 펩티드가 간뿐만 아니라 뇌 세포에서 FLO 전달하면서 간 (도 2B, 2D)에서 (뇌 세포에서의 녹색 형광 어느 날의 최단 시간에 전달하고 검출 된 도 2A, 2C). 은 miR-29 5 개의 LNA 수정 설계되었습니다에 대한 마우스의 뇌 antagomir ...

MicroRNAs는 뇌에서 중요한 역할을 하며 신경 퇴행을 모델링하기 위한 잠재적인 표적입니다. 그러나 miRNA의 길이가 짧고 뇌 조직에 접근하기 어렵기 때문에 miRNA 수치를 교란하는 것은 어렵습니다. 이 비디오는 마우스에서 뉴로펩타이드를 사용하여 antagomir 설계 및 뇌 특이적 전달 방법을 제시합니다.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

본 실험에서는 세포 투과성 펩타이드와 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 마우스 뇌의 마이크로 RNA를 특이적으로 넉다운하는 방법을 시연합니다. 이는 May 29에 대한 안티고(antigo)를 설계함으로써 달성되었습니다. 본 연구에서는 잠김 핵산(lock nucleic acid) 변형을 통해 마이크로RNA를 표적으로 하는 안티고 수컷을 사용하였습니다.즉, LNA 수식(modification)이 5가지 서로 다른 위치에 도입되었습니다. 여기서 LNA 수식의 도입은 마이크로 RNA에 대한 결합 친화도를 높여줍니다. 또한, 이는 핵산 분해 효소에 대한 저항성을 부여하여 마이크로RNA 타겟팅 효율을 향상시킵니다.ANTIGO MAR와 펩타이드의 복합체를 인비트로(in vitro)에서 준비하여 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였습니다. 마이크로 RNA의 넉다운으로 인해 행동 변화가 나타났으며, 이는 해당 마이크로RNA가 운동실조에 관여함을 시사합니다. 3회 연속 주입 시 치료 후 보행의 눈에 띄는 변화를 유도하기에 충분했습니다. 이후 뇌 조직을 수집하여 마이크로RNA의 넉다운을 확인하였습니다. CPP 또는 자기침투성 펩타이드는 최근 핵산 전달을 위한 매력적인 운반체로 주목받고 있습니다.본 연구에서는 LNA와 전하 기반의 복합체 형성이 가능한 아르기닌 풍부 신경 친화성 펩타이드를 사용하였습니다. 이 펩타이드는 전신 순환계에 투여되었을 때, 본 실험의 지정 표적 부위인 신경 세포에 도달하여 LNA가 해당 세포 내로 적절히 방출되도록 돕습니다. ME 29 가족 구성원의 서열은 mease에서 검색하였으며, 16종의 MER 안티센스는 복합체 제조를 위해 5개의 균등 간격 위치에 LNA 수식(lock nucleic acid modifications)을 가하여 합성하였습니다. 적정 농도의 펩타이드 및 안티고(antigo) 용액은 멸균된 10% glucose에서 각각 준비하였습니다.무균 조건 하에서 진행합니다. Antigo 용액을 부드럽게 교반하며 펩타이드 용액에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 크기가 펨토 규모인 단분산 복합체를 형성하기 위해서는 천천히 첨가하는 것과 부드럽게 교반하는 것이 매우 중요합니다.antigo를 매번 3등분 하여 나누어 첨가하였으며, 혼합을 위해 1분간 대기한 후 혼합 없이 1분간 배양하였습니다. 빠르게 첨가할 경우 복합체의 응집 및 침전이 발생할 수 있습니다. 이제 주입을 위한 Antigo 복합체가

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신경 튜브의 유전자 발현은 세포 유형의 특정, 추적 방식으로 downregulated 할 수있는이 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 방법을...

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

출처: Ullah, I., et.al. 중추신경계에 비강내 siRNA를 전달하는 동안 마우스를 배치하기 위한 포지셔닝 장치. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 특수 포지셔닝 장치를 사용하여 뉴런 표적 펩타이드-siRNA 복합체를 마우스 뇌에 전달하기 위한 정밀한 비강내 투여 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 폐 배액을 방지하면서 siRNA 흡입을 최적화하기 위해 머리를 아래로 향하게 하고 앞으로 고정합니다. 표적 펩타이드는 뉴런에서 수용체 매개 흡수를 촉진하여 뇌에서 표적 siRNA 전달 및 유전자 침묵을 가능하게 합니다.

포지셔닝 장치를 사용하여 마우스 뇌에 siRNA의 비강내 전달

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

이 프로토콜은 인공 예측에 관한 중재 RNA 간섭 그대로 신경 회로 내에서 선택적 gene(s)의 감소 식이 구체적으로 연 접 boutons를 자극 하는 optogenetics와 결합 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

여기서, 우리는 중추 신경계에서 효과적인 유전자 침묵이 가능하게 하는 뇌 표적화 펩티드-siRNA 제제의 비강 내 투여를 위한 마우스의 적절한 배치를 가능하게 하는 마우스 포지셔닝 장치를 이용한 프로토콜을 제시한다.

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.

교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

배우세요 뇌 특정 miRNA 노크다운 방법을 생쥐 모델에서. 세포 침투 펩타이드와 LNA 수정 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용해 혈액-뇌 장벽을 극복하고 신경퇴행 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

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