Name: 실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 마취 마우스 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구의 생체 내 공초점 현미경 이미징 방법을. 정상 및 염증 상태에서 백혈구 역학을 실시간으로 추적하여 면역 세포 행동과 혈관 내피 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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이 작업은 EMBO(Y.E.로), Foundation Machaon(Y.E.로) 및 SNSF(B.A.I.로)의 지원을 받았습니다. Nikon A1r 현미경의 가용성과 기술 지원에 대해 Bioimaging Core Facility에 감사드립니다. 영어 교정을 해주신 Clarissa Bartley 여사에게 감사드립니다.

참고 : 동물 절차는 스위스 제네바에서 동물 관리의 기관 윤리위원회와 분할 한 수의학 사무소에 따라 수행되었다. 인증 번호 GE / 14분의 63. 골수에서 단일 세포 현탁액 1. 준비 <ol><li> 자궁 전위에 의해 희생 마우스 (구 8-12주). 70 % 에탄올로 뒷다리를 소독. 뒷다리에서 피부를 제거합니다. </li><li> 마우스 대퇴골과 경골을 해부하고 메스와 다리에서 조직을 제거합니다. PBS로 가득 배양 접시에 90 %의 에탄올과 장소 다리를 씻어. </li><li> 무릎 관절에 메스 분리와 대퇴골과 경골의 문화 후드, 깨끗한 조직에서. 뼈의 양쪽 끝을 잘라. </li><li> 50 ㎖에 23G 바늘과 준비 매체 (페놀 레드가없는 DMEM / F12, 1 %의 쥐 혈청)로 채워진 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 뼈에서 플러시 골수 튜브 나사. 섬세 23G 북동 통해 계대에 의해 세포 집합체를 중단edle과 1 ML의 주사기. 준비 배지 25 ml의 총 부피를 가져와. </li><li> 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. 폐기 뜨는. 1 용액에 재현 탁 펠릿은 적혈구 용해 RBLC 버퍼 15 ㎖의 튜브 나사 (8.3 g NH 4 CL, 증류수 1 L에 완전한 1g의 수 NaHCO3, 1 ml의 EDTA (100 밀리미터), 0.22 μm의 필터링). 얼음에 30 초를 품어. </li><li> 준비 매체와 원심 분리기 250 XG 10 ㎖, 5 분, 4 ° C를 추가합니다. 2 ml의 준비 매체에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. </li></ol> 음의 선택 2. 호중구 심화 <ol><li> 마우스 호중구 농축 칵테일 (전지 분리 플랫폼 키트 등 EasySep 등)의 150 μl를 추가합니다. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 페놀 레드없는 DMEM의 10 ML을 추가합니다. 한 번 반전 및 원심 분리기 250 XG, 3 분, 4 ℃. </li><li> 폐기 뜨는. 바닥 튜브 라운드 5 ml의 폴리스티렌 1.75 ml의 준비 매체에 재현 탁 펠렛. 250 μL 비오 추가선택 칵테일. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 입자를 재현 탁 30 초 동안 (전지 분리 플랫폼 키트) 자성 입자를 소용돌이. 세포 현탁액 500 μL 자성 입자를 추가합니다. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 자석에 튜브를 놓습니다. 3 분을 기다립니다. </li><li> 원하는 레이블이없는 세포를 수집하기 위해 바닥 튜브 라운드 새로운 5 ml의 폴리스티렌에 자석 전환. 튜브에 매달려 마지막 한 방울을하지 마십시오. 원하지 않는 세포는 자석 내부의 튜브에 남아있게됩니다. 생물 학적 폐기물로이 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 자석에 새 튜브를 놓습니다. 3 분을 기다립니다. </li><li> 새로운 15 ml를 원하는 표지 된 세포를 수집하기 위해 관 나사에 자석을 전환. 튜브에 매달려 마지막 한 방울을하지 마십시오. </li><li> 페놀 레드없는 DMEM 5 ml의 완전한 볼륨. </li></ol> 호중구 3. 라벨링 <ol><li> 휴대 추적기 오렌지으로 오렌지 염료의 0.5 μl를 추가 (작업 농도1 μM, CMRA - 클로로 메틸 rodol 아세테이트, 주식 DMSO 10 mm)이다. 37 ℃에서 2 분을 품어. </li><li> 준비 매체의 2.​​5 ML을 추가합니다. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. </li><li> 폐기 뜨는. 1.5 ML 튜브에 1 ㎖의 준비 매체에 재현 탁 펠렛. </li><li> hematocytometer를 함께 계산하는 나누어지는 가져 가라. </li><li> 37 ℃에서 5 분을 품어. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. </li><li> 폐기 뜨는. 1 ml의 PBS에 재현 탁 펠렛. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 세척 4 ° C. </li><li> 폐기 뜨는. 100 μL PBS 당 10 × 10 6 세포 등을 Resuspend 펠렛. IV 주입까지 얼음에 보관하십시오. 참고 : 세포가 IV는 가능한 한 빨리 주입해야한다. 6-12x10 6 호중구 / 마우스는 일반적으로 얻을 수있다. </li></ol> 생체 내에 현미경 4. 마우스 준비 주 :.. 단계 4.1) 및 4.2)에 IC 표지 호중구 오랜 대기 시간을 방지하기 위해 실험의 시작에서 수행되어야이자형. <ol><li> CX 3 (CR1)의 GFP 마우스 (구 8~12주)를 달아. </li><li> (PBS에 1.75 ㎎ / ㎏ acepromazone 케타민 60 ㎎ / ㎏, 자일 라진 4.5 ㎎ / ㎏) 마취제의 800 μl를 준비합니다. </li><li> 마우스를 마취. 마우스의 200 μL / 20g와 사출 IP. 곤란 발가락으로하고 호흡을 확인하여 제어 마취. </li><li> 호중구 (100 μL PBS에 10 × 10 6 세포) 정맥 실험자의 편의에, 측면 꼬리 정맥 또는 역 궤도 동을 사용하여 주입한다. </li><li> 가열 패드에 마우스를 놓고 눈 젤 눈을 보호 할 수 있습니다. </li><li> 유리 커버 슬립 (35mm 직경)는 직경 30mm의 구멍을 갖는 10cm 조직 배양 접시에 넣고있다. 사용 된 오일과 접촉하는 커버 슬립 조직 배양 접시를 유지하는 것이다. </li><li> 복막을 노출 가위로 복부 피부를 절개. 소장을 노출 가위로 복막을 절개. </li><li> 200 ㎕의 PBS로는 P (37 ℃에서 예비 가열)를 추가eritoneal 공동. 당신의 손에 마우스를 가지고 소장은 부드러운 압력으로 복강에서 얻을 수 있도록이 아래를 향십시오. 조직 배양 접시에 마우스를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 장간막 혈관을 노출하기 위해 커버 슬립에 멸균 면봉으로 장을 deroll. </li><li> 대역에서 종이 조직을 잘라 37 ℃ 가열 PBS로 그들을 젖은. 연동 운동에 의한 운동을 감소 종이 조직의 조각을 고정 부위. </li><li> 거꾸로 현미경의 맞춤형 트레이 무대에 37 ° C 온도 조절 챔버 내부의 조직 배양 접시와 마우스를 넣습니다. 뒷다리에 마취제 사우스 캐롤라이나를 포함하는 주사기를 소개합니다. 참고 : 또한, 마우스 마스크와 산소 (0.5 L / 분)를받을 수 있습니다. </li><li> 발가락이 곤란 및 호흡마다 30 분을 확인하여 마취에 대한 제어 마우스. 필요한 경우, 적절하게 마취를 유지하기 위해 마취의 향상 (20 μl를) 제공합니다. 아니E : 혈관의 건조는 피해야한다. 따라서, 그 습도 정기적 37 ° C-PBS로 가온 부위를 고정하기 위해 사용 된 종이 조직 습윤에 의해 유지된다. </li></ol> 생체 내에 현미경을 사용하여 생체 내에서 염증 선박 5. 측정 호중구와 단핵구 행동 <ol><li> 설정 레이저는 488- 레이저에 의한 광독성을 방지하기 위해 필요한 최저 전력에서 561-합니다. 실험에서는, 0.5 % 미만이다. 호중구에서 단핵 세포에서 GFP와 오렌지 염료의 강도는 일반적으로 0.3 %가 충분 너무 밝습니다. 참고 :이 우리의 체제와 0.15 mW의 0.25의 레이저 출력을 나타냅니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 20X 건조 목표를 사용하여 오픈 핀홀 2.2 초에 512 X 512 픽셀 (즉, 635 μm의)의 이미지를 획득. 낮은 레이저 파워와 충분한 신호를 보장 20 μm의 10 ~ Z-깊이를 사용합니다. 참고 : 우리는 보통 12 ~ 16 사이의 Z-깊이 실험을 수행(56); M. 제시된 도면 및 동영상의 경우, Z-20 μm의 깊이이다. 위상차 내피 벽의 식별이 가능하고 촬상은 장간막 정맥상에서 수행된다. 순찰 세포가 관심 분야를 기록, 5-10 μm의 / 분 (6)의 속도가 매우 느리게 이동 이후 매 20 초 만족 스럽다. 설명 된 설정으로, 전동 스테이지 동시에 관심 최대 7 필드의 기록을 허용한다. </li><li> 이를 첫 번째 동영상의 획득 전에 30 분 동안 제제로부터 복구 할 수있는 마우스 및 현미경의 서모 스탯 실 장간막 혈관을 놓는다. 이 기간 동안 관심의 여러 필드를 선택합니다. 목적에 가장 가까운 혈관의 내강 표면에 초점을 맞 춥니 다. 필요한 경우, 포커스를 설정할 내피 약간 자동 형광 활용. 참고 : 마우스를 준비하는 동안 수술은 약간 내피을 강조하고있다. 결과적으로 호중구의 압연/ 또는 단핵 세포는 처음 15 분 다음 마우스 제제에서 관찰 될 수있다. </li><li> 정상 상태의 조건에서 30 분, 하나의 이미지 매 20 초 동안 첫 번째 영화를 기록합니다. 참고 :이 소프트웨어는 2.2 초에 대한 관심의 각 필드를 취득하고, 모터 단계는 자동으로 다른 하나의 필드에서 이동합니다. 그것은 영화의 기록을 30 분 동안 다시 20 초 이내에 제 1 위치로 간다. </li><li> 혈관 염증을 개시, TLR2 100㎍을 함유 PBS 20 μL의 방울을 추가 / TLR1 작용제 Pam3CSK4 12 직접 묘화 혈관 상. </li><li> 관심의 각 필드에 대해 초점을 제어 할 수 있습니다. 참고 : 인수하는 과정에서 항상 존재 z 축에 초점이 약간 변경됩니다. 10 ~ 20 μm의 z의 깊이에도 불구하고,이 형광 강도의 감소가 발생할 수 있습니다. 필요에 따라서, 수동으로 각 영화의 끝에서 관심있는 각각의 필드를 집중할. 30 분 - 기간과 3 시간까지 기록 영화탈 염증의 개시 후. </li><li> 실험의 마지막에, 경부 탈구에 의해 마취 된 마우스를 희생. </li></ol> 동영상 파일과 백혈구의 추적의 6 세대 참고 : 니콘 수집 소프트웨어는 파일을 .nd2 발생하지만 다음 절차는 다른 소프트웨어 및 브랜드와 유사하다. <ol><li> 티파니 시리즈로 내보내기 파일. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (이동 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). TIFF 시리즈를 가져옵니다. 다른 파일로 각 채널. </li><li> 배경 잡음을 줄일 수있는 녹색과 적색 채널 (공정&gt; 필터&gt; 중간 ...) 2.0 픽셀의 반경과 중간 필터를 적용합니다. </li><li> (이진 만들기&gt; 프로세스&gt; 이진) 바이너리로 파일을 변환 할 수 있습니다. 각각의 이미지에 대한 임계치를 계산하는 소프트웨어를 사용. </li><li> 하나의 이미지 시리즈 (이미지&gt; 색상&gt; ... 채널 병합)에 채널을 병합합니다. 초에서 단핵구를 선택N 채널, 적색 채널 및 채널에 회색 투과광에서 호중구. </li><li> RGB 색상에 쌓인 이미지 변환 (이미지&gt; 색상&gt; RGB로 스택). </li><li> .AVI와 같은 파일을 저장 </li><li> 데이터를 가져 와서 Imaris 소프트웨어 (비트 평면)에서 컴파일됩니다. 단핵구와 호중구의 운동은 스팟 추적 마법사를 사용하여 추적됩니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문에서 설명하는 방법을 효율적으로 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 정맥에서 단핵구와 호중구의 행동을 연구하는 일관성있는 접근 방식을 제공한다. 준비의 중요한 단계는 PBS-젖은 조직과 소장의 고정입니다. 제대로 수행 한 경우, 장간막 혈관 멋지게 이미지 수집에 대한 커버 슬립에 노출되어있다. 이는 장간막 혈관에서 백혈구의 동작을 모니터링하는 관심 여러 필드의 선택을 가능하게한다. 우리의 프로토콜은 (1) 직접 모니터링 혈관에 염증을 유도하고, (2) 자극 이후에 이른 시점을 기록하고, (3)의 반응 속도를 따를 수 있도록, 실험 시작 전 장간막 혈관 exteriorization 포함 백혈구의 모집과 전 염증의 유도 후 동일 선박에 자신의 행동. 우리는 TRANSF더 많은 셀 (0.5-2x10 6 / 6 마우스 대 6-12x10)...

<html> 호중구와 단핵구는 지속적으로 혈액 순환 선천성 면역 체계의 세포이다. 부상이나 감염되면 염증 신호는 여기에 세포 면역 반응 1-3 시작, 손상 및 감염 조직으로 백혈구 diapedesis를 유도한다. 백혈구 동원의 신속성은 면역 반응의 긍정적 인 결과를 결정한다. 이러한 복잡한 프로세스는 백혈구에 연루 분자에 대한 통찰력을 얻을 .TO 순환 백혈구와 내피 1-3 사이의 접착제 접촉의 설립을 도와 염증이 내피 세포에 존재하는 특정 분자 (예를 들어, 셀렉틴, 내피 세포 결합 된 케모카인)에 의존 모집 캐스케이드, 그것은 세포의 모집 동력학을 시각화하고, 각 셀 / 인구의 동작을 추적하는 것이 중요하다. 효과적인 방법은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다. 현재까지 콘텐츠 &quot;&gt;, 생체 내에 현미경을 사용하여 여러 가지 방식은 화상에 개발 된 맥관 4,5-. 예를 들어, 귀 진피 혈관 또는 생체 내에 공 촛점 현미경으로 장간막 정맥 촬상 뮤린 Ly6C 낮은 단핵구 및 인간의 순찰 동작을 식별하는 데 사용 하였다 CD14는 정상 상태 조건 6-8 하에서 혈관의 내강 측에 CD16 + 단핵구 희미. 마우스 cremaster의 혈관 모델은 종종 트랜스 제닉 마우스에서의 염증 또는 허혈 조건 호중구 염증 Ly6C 높은 단구의 동작을 모니터링하기 위해 사용된다. 것을 경우, cremaster이 IL1β, CCL2, TNFβ 또는 fMLP의 intrascrotal 주입을 통해 자극한다. 2-4 시간 후, 조직은 수술 표면화되고, 생체 내에 공 초점 현미경 9-11으로 분석 하였다. 다음은 프로토콜과 동시에 단핵구 및 호중구를 모니터링하는 방법을 설명거꾸로 형광 공 초점 현미경. 또한, 우리의 방법은 백혈구 모집의 역학을 수행하는 방법에 대해 이전 이미지 같은 용기 (정상 상태)과 염증 후에 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 목적을 위해, 우리는 누구의 단핵구 eGFP는 표현, IV 오렌지 염료 표지 쥐의 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스를 사용합니다. 반전 된 공 초점 현미경을 사용하여, (1) 추적하고 정상 상태 조건 및 (2) 로컬 염증 후 동일한 용기에서 두 단핵구 및 호중구의 채용을 따르지하에 순찰 Ly6C 낮은 단핵구를 분석 할 수있다. 여기에서 우리는 TLR2 / TLR1 효능 Pam3CSK4 (12)를 사용하여 염증 상태를 만듭니다. 또한, 이러한 영상은 특정 녹아웃 마우스 또는 차단 항체 6,9,13의 존재 하에서 수행하는 경우 백혈구 모집 캐스케이드의 다양한 단계에 대한 관심의 특정 분자의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI 플랜 아포크로맷 0.45&nbsp; &nbsp; DT:4mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI 플랜 아포크로맷 VC 0.75 DT:1mm&nbsp;</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 추적기 오렌지 CMRA 염료</td><td>생명 기술</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 자석</td><td>줄기 세포 기술</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 마우스 호중구 농축 키트</td><td>줄기 세포 기술</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>잠수 오일 타입 A</td><td>니콘</td><td></td><td>어떤 점성 오일&nbsp;</td></tr><tr><td>라이프 박스 온도 제어 시스템</td><td>라이프 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>니콘 A1R 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>A1R</td><td>도립 현미경, 전동 x/y/z 스테이지, NIS 요소 소프트웨어</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 프리 DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>모든 페놀 레드 프리 배지는</td></tr> PBS 쥐 혈청 줄기 세포<tr><td>에 재구성</td><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td></tr>에 적합합니다. <tr><td></td><td></td><td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>조직 배양 접시 100 TPP 93100에 포함된 기술 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

효율적인 면역 반응은 감염이나 부상의 사이트에 혈액 백혈구의 신속한 동원에 의존한다. 생체 내에서 백혈구의 이동을 조사하는 혈관 내피 세포와 백혈구의 transendothelial 마이그레이션 및 상호 작용의 분자 기초를 이해하는 데 매우 중요합니다. 하나의 강력한 접근 방식은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다. 여기에서 우리는 거꾸로 공 초점 현미경 오렌지 염료 표지 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스 IV에 영상 단핵구와 호중구을위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 영화는 모두 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 혈관에서 백혈구 행동의 분석을 허용 영상의 몇 시간이 30 분에서 모였다. 로컬 TLR2 / TLR1 효능 Pam3SK4과 혈관 염증을 유발하고 subseque을 모니터에 우리는 또한 단계를 설명호중구와 단핵구의 NT 모집. 제시된 기법은 또한 백혈구의 다른 개체군을 모니터링하고 다른 자극 또는 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 백혈구 보충 또는 거래에 관련 분자를 조사하는데 사용될 수있다.

원고를 쉽게 실시간으로 마취 된 마우스의 장간막 정맥 단구와 호중구의 동작을 모니터링하기위한 최적화 된 프로토콜을 설명한다. 37 ° C-온도 조절 챔버의 사용은, 마우스의 온도를 유지하기 위해 필수적으로 인해 또한 백혈구의 온도 의존 움직임이다. 마우스의 제조는도 1에 표시되는도 2는 현미경으로 보이는 모든 영역을 나타낸다. 전송 된 빛은 장간막 정맥 (빨간색 화살표) 및 동맥 (파란색 화살표)의 식별을 할 수 있습니다. 같은 영화 1, 영화 2와 ImageJ에 소프트웨어 생성 된 동영상 파일과 획득 된 영상의 치료. 3 표시에게 영화의 처음 지점에 대한 이미지 처리의 여러 단계를 그림 1. 영화 1은 정상 상태 조건에서 Ly6C 낮은 단핵구의 순찰을 보여줍니다 이전에 해제로모든 호중구가 혈액에서 순환되는...

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

본 생체 내 공초점 현미경 관찰 절차의 전반적인 목적은 정상 상태 및 염증 조건의 마우스 장간막 정맥 내에서 호중구와 단핵구의 동역학을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 백혈구의 이동, 모집 및 혈관 내피세포와의 상호작용에 대한 분자적 근거가 무엇인지와 같은 면역학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정상 상태 조건에서 LY 60 low 단핵구의 순찰을 추적하고 분석할 수 있다는 점과, 국소 염증 자극 후 동일한 혈관으로 모집되는 단핵구와 호중구를 모두 추적할 수 있다는 점입니다. 본 절차의 시연은 실험실 기술자인 Stefan ler가 진행합니다. 골수에서 단일 세포 부유액을 준비하려면, 8~12주령 마우스의 뒷다리를 70% ethanol로 멸균한 다음, 모든 뼈가 분리되면 메스를 사용하여 대퇴골과 경골을 채취하십시오.다리를 90% ethanol로 헹구고 뼈를 PBS가 채워진 배양 접시에 옮깁니다. 그 후 배양 후드 내에서 메스를 사용하여 대퇴골과 경골을 깨끗이 정리하고 무릎 관절 부위에서 이를 분리합니다. 다음으로 뼈의 양 끝단을 절단하고, 23 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 준비 배지를 채워 각 뼈의 골수를 50 mL 원심 분리 튜브(conical tube)로 씻어 내립니다.세포 응집체를 바늘 팁으로 다시 통과시켜 분쇄한 후, 신선한 준비 배지를 사용하여 세포 현탁액의 총 부피를 25 milliliters로 맞추고, 세포를 원심 분리한 다음 재현탁합니다. 펠렛을 1 milliliter의 적혈구 용해 버퍼에 현탁하고, 세포를 얼음 위에 놓인 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 30초 후, 10 milliliters의 준비 배지를 가하여 용해를 중단시킵니다.세포를 다시 원심 분리하고, 음성 선택(negative selection)을 통해 호중구를 농축하기 위해 펠렛을 2mL의 추가 준비 배지에 재현탁합니다. 먼저, 골수 세포를 150µL의 마우스 호중구 농축 칵테일과 함께 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.10 mL의 phenol red free DMEM을 넣고 배양을 종료합니다. 튜브를 한 번 뒤집어 섞은 후, 원심분리하여 세포를 가라앉힙니다. 펠렛을 1.75 mL의 준비 배지에 재현탁하고, 세포를 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다.그 후 세포를 250 µL의 biotin selection cocktail과 함께 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, cell isolation kit의 자기 입자를 30초 동안 볼텍싱하여 부유시킵니다. 그런 다음 세포를 500 µL의 입자와 함께 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.배양 종료 후, 튜브를 자석에 놓습니다. 3분 후, 자석을 새로운 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 뒤집어 옮깁니다. 라벨링되지 않은 세포를 수집하려면, 라벨링되지 않은 세포가 담긴 튜브를 자석에 놓습니다.3분 후, 자석을 15 mL 원추형 튜브에 뒤집어 넣어 마지막 한 방울을 제외한 나머지 표지되지 않은 세포를 옮깁니다. 그 다음, 페놀 레드 프리 dm을 사용하여 부피를 5 mL로 맞춥니다. 이제 여기에 사용된 cell tracker orange와 같은 적절한 세포질 염료 0.5 µL를 37 °C에서 세포에 첨가합니다.2분 후, 37°C에서 2.5 mL의 준비 배지로 세포를 세척하고 1.5 mL 튜브에 담긴 1 mL의 준비 배지로 펠렛을 재현탁한 후, 세포 수를 측정하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 원심 분리한 후, 펠렛을 1 mL의 PBS에 현탁하고 세포가 회전하는 동안 다시 한번 원심 분리를 수행합니다. 오일을 사용하여 30 mm 직경의 구멍이 있는 10 cm 조직 배양 접시에 35 mm 유리 커버슬립을 부착합니다.그다음 펠렛을 100 µL의 PBS당 1 x 10⁷ 개의 세포가 되도록 재현탁하고, 라벨링 직후 최대한 빨리 세포를 얼음 위에 둡니다. 라벨링된 호중구 세포를 마취된 8~12주령 CX3CR1-GFP 마우스에 정맥 주사하고, 마우스를 가열 패드 위에 올립니다. 그 후 즉시 동물의 눈에 연고를 바르고 가위를 사용하여 복부 피부를 절개하여 복막을 노출시킨 뒤, 가위로 복막을 절개하여 장을 노출시킵니다.그 다음, 37 °C PBS 200 µL를 복강 내로 투여하고, 쥐를 조직 배양 접시 위에 엎드리게 하여 부드러운 압력을 가해 복강에서 장을 제거합니다. 그런 다음 멸균 면봉을 사용하여 장을 커버슬립 위로 조심스럽게 굴려 장간막 혈관을 노출시키고, 연동 운동으로 인한 움직임을 줄이기 위해 37 °C PBS를 적신 조직지 조각으로 조직을 고정합니다. PBS를 적신 조직지로 장을 조심스럽게 고정하는 과정에 충분한 시간을 들이는 것이 매우 중요합니다.그렇지 않으면 이미지 획득 중 연동 운동으로 인한 움직임이 실험을 망칠 수 있습니다. 다음으로, 조직 배양 접시와 마우스를 도립 현미경의 맞춤형 트레이 스테이지 위에 있는 37 °C 항온 챔버로 옮기고, 뒷다리에 2차 마취제를 근육 내 투여합니다. 이제 레이저 유도 광독성을 피하기 위해 필요한 최저 출력으로 적절한 레이저를 설정하고, 마우스가 30분 동안 휴식하게 합니다.동물이 회복되면, 정상 상태(steady state) 조건에서 30분 동안 첫 번째 영상을 녹화합니다. 그 후 혈관 염증을 유도하기 위해, 100 µg의 TLR2/TLR1 작용제 PAM3-CSK4가 포함된 PBS 20 µL 한 방울을 이미징 중인 혈관 위에 직접 투여합니다. 마지막으로 두 번째 영상을 획득하는데, 염증으로 인해 내피 세포의 너비가 변하면서 Z축의 초점이 달라질 수 있으므로 작용제 투여 후 초점을 세심하게 조절해야 합니다. 방금 시연한 바와 같이, 정상 상태 조건에서 획득한 영상의 첫 번째 시점에 대한 이미지 처리의 다양한 단계가 이 영상에 제시되어 있습니다.정상 상태 조건에서 초록색 LASIK cilo 단핵구의 순찰 모습은 혈류 속을 순환하는 적색 호중구와 함께 시각화될 수 있습니다. 여기서는 PAM three CSK four를 첨가하고 90분 후에 동일한 관심 영역을 보여주며, 그 결과 호중구와 단핵구가 혈관 내피벽으로 대량 모집되었습니다. 단핵구는 적절한 소프트웨어를 사용하여 내피벽을 세밀하게 스캔하며, 염증 개시 전후로 단핵구와 호중구의 정확한 순찰 경로를 추적할 수 있습니다.장 운동으로 인해 Z축의 초점이 어긋나거나 XY축 변위가 발생하여 실험을 망칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 기술은 서로 다른 유전자 변형 마우스 모델을 사용하거나, 차단 항체 또는 약물을 주입하여 백혈구 행동에서 특정 관심 분자의 역할을 결정함으로써 더욱 수정될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 장간막 정맥에서 포화된 백혈구의 역동성을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

이 프로토콜은 장간막 허혈-재관류 손상을 유도하고 생체 내 현미경을 사용하여 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(NET)을 시각화하는 방법을 제시합니다. 상장간막동맥의 혈류를 1시간 동안 제한한 후 재관류를 수행하여 백혈구 유착 및 NETosis를 직접 정량화할 수 있었습니다.

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury)

학습하세요 마취 마우스 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구의 생체 내 공초점 현미경 이미징 방법을. 정상 및 염증 상태에서 백혈구 역학을 실시간으로 추적하여 면역 세포 행동과 혈관 내피 상호작용을 연구할 수 있습니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

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