복강 내 난소 암 전이의 정량

이 실험의 전반적인 목표는 syngeneic orthotopic xenograft murine model에서 복강내 난소암 전이의 상대적 종양 부담을 결정하는 것입니다. 상대적 종양 부담을 이미지화하고 정량화하는 이 새로운 방법은 난소암 전이 조절에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 근본적인 장점은 형광 스펙트럼의 혼합을 해제함으로써 이미지에서 조직 자동 형광을 제거하여 표준화된 상대적 종양 부담을 측정할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 인간 난소암 전이에 대한 통찰력을 제공하고 치료제의 효능을 모니터링하는 데 영향을 미칩니다. 이 방법의 시각적 시연은 이미지에서 정량적 데이터를 추출하기 위해 강력한 이미징 기술과 분석 절차를 결합하기 때문에 매우 중요합니다. 오늘 이 절차를 시연하는 사람은 Stack Lab의 실험실 프로그램 관리자인 Yueying Liu입니다.

종양 세포가 10주 동안 자란 후, 마취된 각 쥐의 시체를 한 번에 하나씩 작은 동물 광학 이미징 시스템에 넣습니다. 각 시점에서 코호트의 모든 마우스를 스캔합니다. 형광 표지된 종양 세포를 관찰하려면 멀티 스펙트럼 획득을 실행하여 총 5개의 이미지를 수집합니다.

표준 노출 15초, 2x2 비닝, 시야각 16cm, F 스톱 1.1을 선택합니다. 다음으로, 개방 여기 필터, 개방 방출 필터, 2 x 2 비닝으로 0.2초의 표준 노출, 16cm의 시야, 2.8의 F 스톱으로 백색광을 사용하여 전체 동물의 반사율 이미지를 획득합니다. 안락사 후에는 뾰족한 해부 가위를 사용하여 허벅지 위에서 흉곽 하단까지 마우스의 복부 정중선을 따라 피부를 앞쪽으로 자릅니다.

복막 조직에 구멍을 뚫지 않도록 피부와 복막 조직을 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 흉곽 바닥과 허벅지 위쪽을 따라 옆으로 잘라 두 개의 피부 덮개를 만듭니다. 스캐너에서 마우스를 복부 쪽에 놓고 피부 덮개를 당겨 열고 복막강이 아래를 향하도록 합니다.

이전에 살아있는 마우스에 사용된 것과 동일한 매개변수를 사용하여 장기가 있는 마우스를 현장에서 스캔합니다. 이제 표준 기술을 사용하여 간, 망막, 췌장, 위, 횡격막, 소장과 대장을 추출하여 마우스를 계속 해부합니다. 또한 왼쪽과 오른쪽 복막, 난소, 신장, 장간막, 마지막으로 지방 패드를 제거한다.

장기에서 보이는 각 종양을 관찰하고, 열거하고, 기록합니다. 캘리퍼를 사용하여 각 종양의 직경을 측정합니다. 직경이 2mm 미만인 종양은 작은 종양, 2mm에서 5mm 사이의 종양은 중간, 5mm 이상의 종양

다음으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 그림 4에 있는 장기 스캔 템플릿에 장기를 배치하고 이를 사용하여 다음 스캔 시 각 장기의 위치를 구성합니다.PBS를 사용하여 장기를 촉촉하게 유지합니다. 소동물 광학 이미징 시스템과 이전에 사용된 매개변수를 사용하여 각 장기의 장을 스캔합니다.

스캔 후 장기를 10%포름알데히드에 넣고 표준 기술을 사용하여 조직학을 위해 처리합니다. 각 다중 스펙트럼 스캔에서 자동 형광의 양을 줄이려면 먼저 적색 형광 단백질 생체 내 스펙트럼 파일을 로드한 다음 혼합되지 않은 이미지 창에서 자동 바닥 생체 내 빨간색 파일을 로드하고 un-mix를 선택합니다. 그런 다음 dot bip 파일을 16비트 스케일되지 않은 dot tif 형식으로 내보내고 파일로 이동하여 연 다음 올바른 16비트 dot tif 파일을 선택하여 이미지 J에 로드합니다.

그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정, 밝기 대비를 차례로 선택하고 표시되는 최소 값을 0으로 설정하고 표시되는 최대 값을 플러스 35353으로 설정합니다. 그런 다음 이미지 메뉴에서 다시 테이블 조회로 이동하여 red hot을 선택합니다. 다양한 동물 모델에는 서로 다른 밝기 수준이 필요하지만 주어진 연구 전반에 걸쳐 밝기를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.

자유형 선택 도구를 사용하여 각 장기 주위에 자유형 관심 선택 영역을 그립니다. 자유형 관심 영역은 장기 경계에 가깝게 그려야 합니다. 그런 다음 control과 M을 입력하여 측정 도구를 사용하여 각 장기의 표면적을 계산합니다.

이 데이터를 스프레드 시트에 기록합니다. 각 장기 주위에 그려진 관심 영역을 사용하여 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 복제를 선택하여 장기만 포함합니다. 그런 다음 이미지에서 조정, 임계값으로 이동하여 하한 임계값 수준을 플러스 1, 200으로 설정하고 상위 임계값 수준을 플러스 1, 700으로 설정합니다.

또한 어두운 배경을 확인한 다음 확인을 선택합니다. 이렇게 하면 가장 밝은 형광 영역만 선택됩니다. 이미지는 이미지 J의 임계값 슬라이더를 수동으로 조작하여 위와 같이 분석 단계를 위해 이전에 가장 밝은 영역이 선택되도록 해야 할 수 있습니다.

질병 모델마다 서로 다른 역치 제약이 필요하지만, 주어진 연구 전반에 걸쳐 역치 수준을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 분석에서 입자 분석을 선택하고 10으로 제곱된 픽셀의 크기를 무한대로 변경합니다. 윤곽선을 표시하도록 선택하고 결과 표시만 선택하여 선택한 다음 확인을 클릭합니다.

이것은 종양으로 간주되는 밝은 영역의 영역과 원시 통합 밀도를 모두 측정합니다. 각 종양 선택의 표면적과 원시 통합 밀도의 값을 장기 표면적을 포함하는 동일한 스프레드 시트에 함께 기록합니다. 그런 다음 분석에서 도구를 선택하고 보정 막대로 이동합니다.

장기 이미지에 보정 눈금 막대를 추가합니다. 몽타주는 주어진 연구에 의해 지시된 대로 더 많거나 더 적은 수의 기관을 포함할 수 있습니다. 그런 다음 파일에서 다른 이름으로 저장으로 이동하여 몽타주를 dot tif와 dot jpeg로 저장합니다.

그런 다음 장기의 dot jpeg 파일을 열고 삽입 메뉴로 이동하여 각 이미지에 텍스트 상자를 추가합니다. 장기의 세 행 각각 아래에 텍스트 상자를 만들어 장기 레이블을 추가합니다. 전신의 각 16비트 dot tif 파일을 마우스 번호 순서대로 이미지 J로 스캔합니다.

그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 선택한 다음 밝기 대비를 선택합니다. 표시된 최소값을 0으로 설정하고 표시된 최대값을 더하기 35353으로 설정합니다. 그런 다음 이미지 메뉴로 돌아가서 테이블을 찾은 다음 red hot을 선택합니다.

이 작업이 완료되면 몽타주를 dot tif 및 dot jpeg 파일로 저장합니다. 이미징 10주 전에 마우스에 주입된 ID8 쥐 난소암 세포주는 적색 채널에서 형광을 발하고 성장 전반에 걸쳐 형광을 계속합니다. 소동물 광학 이미징 시스템을 사용한 실시간 이미징은 마우스에서 팽창하는 ID8 세포를 볼 수 있으며 종양 부담을 평가하기 위해 단순히 마우스의 무게를 측정하는 것보다 더 정확한 접근 방식을 제공합니다.

안락사와 복부 피부층 제거 후에는 손상되지 않은 장기를 더 자세히 볼 수 있습니다. 그러나 장기 스캔 템플릿에 배치된 개별 장기는 각 장기의 종양 부담을 명확하게 표시합니다. 왼쪽에 표시된 마우스의 망막과 췌장, 난소 및 장간막의 종양 부담은 오른쪽에 표시된 마우스의 동일한 장기보다 훨씬 큽니다.

차등 종양 부담의 관찰은 종양 서비스 영역과 종양 신호 강도 측면에서 모두 정량적으로 확인됩니다. 이 기술을 마스터하면 시간당 최대 18마리의 살아있는 마우스를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다. 개별 장기의 해부 및 생체 외 이미징은 표본당 약 20분이 소요됩니다.

이 절차에 따라 2015년 암 연구 논문에서 볼 수 있듯이 비만이 난소암 전이에 미치는 영향과 같은 가설을 해결하기 위해 정량적 자기 공명(quantitative magnetic resonance)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.