향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 암시야 현미경 검사와 초분광 매핑을 통해 조직학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 나노 입자를 포함하는 양성 대조군 샘플에서 관심 영역을 식별하고 암시야 이미지를 캡처하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 초분광 카메라를 사용하여 관심 영역의 초분광 이미지 또는 데이터 큐브를 만드는 것입니다.

다음으로, positive control 데이터 큐브에서 reference spectral library가 생성되며, 이 라이브러리는 negative control에 대해 필터링되어 거짓 긍정을 제거합니다. 마지막 단계는 참조 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 실험 샘플에 대해 매핑하여 동일한 조성의 나노 입자를 식별하고 찾는 것입니다. 궁극적으로 향상된 암시야 현미경 검사와 초분광 매핑은 전자 현미경과 같은 다른 기술보다 더 빠르고 자원 집약적인 방식으로 조직학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자를 식별하는 데 사용됩니다.

이 방법은 전자 현미경과 같은 기존의 나노 물질 이미징 및 특성화 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 점에서 시료 전처리는 일반적으로 최소한이며 비파괴적입니다. 이미지 획득 및 분석은 시간과 비용이 적게 소요되며 다양한 매트릭스의 나노 입자 이미징에 적용할 수 있습니다.

개인들은 적절한 positive control 샘플과 참조 스펙트럼 라이브러리를 만드는 것이 어렵고 시간이 많이 걸리기 때문에 methodol이 때때로 어려움을 겪는다는 것을 알고 있었습니다. 그러나 이러한 초기 단계가 완료되면 실험 샘플을 매우 빠르게 평가할 수 있습니다. 이 방법은 나노 입자의 피부 침투에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 기관지 폐포 세척 및 혈액 도말과 같은 다른 생물학적 샘플뿐만 아니라 직업적 노출 평가에 사용되는 필터와 같은 비생물학적 샘플에도 적용할 수 있습니다.

이 기술을 시연하는 것은 제 연구실의 의대생인 Plar Sosa가 광원, 무대 컨트롤러, 광학 카메라, 초분광 카메라 및 컴퓨터 시스템을 연결하고 켜는 것으로 시작합니다. 그런 다음 스테이지와 콘덴서를 작동 위치로 올리고 콘덴서 렌즈에 Type A 이멀젼 오일 3-5방울을 조심스럽게 바릅니다. 거품이 생기면 오일을 닦아내고 렌즈에 다시 바릅니다.

그런 다음 샘플을 스테이지에 놓고 이멀젼 오일이 슬라이드의 아래쪽과 닿을 때까지 콘덴서를 천천히 올립니다. 이것은 오일이 슬라이드와 접촉하는 빠르게 밝아지는 조명 링을 통해 눈에 띄게 나타납니다. 콘덴서가 제자리에 있는 상태에서 10 x 대물렌즈로 전환한 다음 콘덴서를 집중하고 정렬하여 필요한 경우 밝기를 최대화하고 콘덴서 정렬 손잡이를 조정하여 밝은 점을 중앙에 배치합니다.

광학 이미징 소프트웨어를 엽니다. 미세한 대물렌즈 초점 노브를 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 관심 영역을 찾습니다.

조명을 평형화하기 위해 필요에 따라 집광기 초점을 조정합니다. 메뉴 표시줄에서 설정 탭을 클릭하고 이미지 캡처 버튼을 클릭합니다. 캡처 이벤트의 경우.

원하는 이미지 형식을 선택하고 이미지의 파일 이름을 할당합니다. 또한 기본 타임랩스 값을 선택하고 마지막으로 확인을 클릭합니다. 그런 다음 노출 메뉴로 이동하여 가장 높은 대비 이미지를 생성하는 노출 설정을 선택합니다.

여기서 레벨은 0.0%로 설정되고 게인은 2.8데시벨로 설정되고 셔터 속도는 56밀리초로 설정됩니다. 메뉴 표시줄에서 이미지 버튼을 클릭하여 이미지를 캡처합니다. 대물렌즈를 40x와 100x로 변경합니다.

더 높은 배율에서 이미지를 캡처하고, 광 가이드가 초분광 카메라로 향하는지 확인한 다음, 소프트웨어에서 HSI 데이터 큐브를 획득하기 위해 초분광 이미징 소프트웨어를 열고 메뉴 표시줄에서 초분광 현미경을 열고 HSI microscope controls를 선택합니다. 여기에서 객관적인 배율과 안전한 경로를 설정합니다. 그런 다음 설정에서 영역 캡처를 변경하고 선 수를 변경합니다.

이 연구에서는 720을 사용하여 노출 시간을 설정했습니다. 여기서는 0.25초를 사용했습니다. 다른 모든 것은 기본값으로 두고 HSI 미리보기를 클릭하여 이미지를 봅니다.

사용자가 카메라 필드 중심의 x축을 가로질러 이동할 때 가장 높은 파장의 강도를 나타내는 결과 강도 그래프를 관찰합니다. 커서를 이동하여 그래프의 정확한 윤곽선을 생성합니다. 이렇게 하면 왼쪽에 숫자 강도 표시기가 나타납니다.

이 미리보기를 기반으로 이미지의 피크를 선명하게 하기 위해 미세 대물렌즈 초점을 조정하여 이미지의 초점을 맞춥니다. 그런 다음 소스 밝기 콘덴서 초점을 조정하여 광도를 최적화하거나 사전을 취소하고 소프트웨어에서 노출 시간을 조정합니다. 캡처를 클릭하고 사용 가능한 이름이 있는 4개의 새 창을 관찰합니다.

밴드 목록. 최고의 줌. 1번, 스크롤 및 1번 RGB 밴드가 나타납니다.

번호 1의 RGB 밴드 창은 향후 모든 참조에 사용될 데이터 큐브이므로 최대화합니다. 오른쪽? 이 데이터 큐브를 클릭하여 tiff 파일로 저장하고 확인을 클릭합니다. 데이터 큐브 이미지 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Z 프로파일 스펙트럼을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.

팝업 스펙트럼 프로필 창이 왼쪽에 나타나면 데이터 큐브 대상에서 관심 있는 픽셀을 클릭합니다. 가장 밝은 것은 관심 있는 자료를 나타내는 것으로 자신 있게 식별할 수 있는 것입니다. 입자 분석 메뉴에서 입자 필터 도구를 선택하여 데이터 큐브에 존재하는 입자를 식별합니다.

새 팝업 창 세트에서 스펙트럼 최대값은 값을 초과해야 하므로 배경 픽셀보다 높지만 관심 있는 재질보다 낮습니다. 유효한 데이터 최대값은 16, 000입니다. 파티클 필터 검토 도구 창에서 모두 선택을 클릭합니다.

그런 다음 export to spectral library를 클릭하고 spectral library의 이름을 지정합니다. 음성 대조군으로 사용할 샘플을 선택한 후 샘플에서 여러 데이터 큐브를 가져옵니다. 하이퍼 스펙트럼 카메라를 사용하려면 하나 이상의 카메라가 필요하지만 더 많은 것을 캡처할 수 있습니다.

negative control data cube를 연 상태에서 선택성을 높이려면 filter spectral library(스펙트럼 라이브러리) 기본 프로그램 도구 모음에 있는 분석 메뉴에서 open new file(새 파일 열기)을 클릭하고 positive control에 대해 이전에 생성된 스펙트럼 라이브러리를 입력 파일로 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다. 필터 cyto viva spectral 라이브러리 창에서. 이미지를 클릭하고 참조 스펙트럼 라이브러리의 출력 파일 이름을 선택한 다음 확인을 클릭합니다.

그런 다음 네거티브 컨트롤 데이터 큐브의 파일 이름을 소스 이미지로 클릭합니다. 이 소프트웨어는 스펙트럼 라이브러리를 분석하고 네거티브 컨트롤 데이터 큐브의 모든 스펙트럼과 일치하는 각 스펙트럼을 제거합니다. 실험 데이터 큐브를 연 상태에서 실험 샘플에서 데이터 큐브를 가져옵니다.

mapping methods 하위 메뉴에서 spectral 메뉴를 클릭합니다: spectral angle mapper를 엽니다. 팝업 창에서 실험 데이터 큐브의 이름을 선택하고 확인을 클릭합니다. 파일 이름이 나열되지 않으면 새 파일 열기를 클릭하고 실험적 데이터 큐브를 선택합니다.

그런 다음 End Member collection, SAM이라는 팝업 창에서 확인을 클릭하고 메뉴 표시줄에서 import를 클릭합니다. 그런 다음 스펙트럼 라이브러리 파일에서 선택합니다. 이전에 생성한 참조 스펙트럼 라이브러리를 열고 확인을 클릭합니다.

Input Spectral Library라는 새 팝업 창에서 select all items(모든 항목 선택)를 클릭하고 okay(확인)를 클릭합니다. 그런 다음 색상을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택합니다. Apply default colors to all(모두에 기본 색상 적용)은 모두 선택(select all)을 클릭한 다음 적용(apply)을 클릭한 다음 출력 파일 이름을 선택하고 확인을 클릭합니다.

데이터 큐브 창에서 오버레이 메뉴를 열고 분류를 선택합니다. 그런 다음 출력 파일 이름으로 이동하여 확인을 클릭합니다. 대화형 클래스 도구 창 메뉴에서 옵션 메뉴를 열고 병합 클래스를 선택하여 통합된 색 구성표를 만듭니다.

다른 소프트웨어를 사용하여 데이터를 더 쉽게 분석할 수 있도록 기본 클래스 목록에서 단일 스펙트럼을 선택합니다. 그런 다음 unclassified를 제외한 모든 클래스를 선택하여 기본에 병합합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.

그런 다음 선택한 기본 색상을 클릭하면 일치하는 모든 스펙트럼이 해당 색상으로 표시됩니다. 검은색 배경에서 일치하는 스펙트럼을 표시하는 amatic 이미지를 얻으려면 검은색인 분류되지 않은 색상 상자를 클릭하십시오.기본적으로 이 기술의 가장 중요한 장점은 암시야 현미경 및 초분광 매핑으로 조직학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자를 식별할 수 있다는 것입니다. 이 이미지는 조직학적 피부 샘플을 사용하여 이 과정을 보여줍니다.

일부 입자는 암시야, 광학 이미지에서 쉽게 볼 수 있지만 초분광 이미징을 사용하여 추가 입자를 검출합니다. 여기에 보이는 것은 일루미나 나노 입자에 노출된 표피층의 돼지 피부 조직입니다. 나노 입자의 고대비 클러스터가 실리카 나노 입자에 노출 된 진피층의 각막층 위에 침착 된 것으로 밝혀졌습니다.

여러 개의 고대비 나노 입자가 결합 조직 위에 증착되는 것을 볼 수 있습니다. 마지막으로, 시리아 나노 입자에 노출 된 피하 조직에서. 이 방법을 사용하여 지방 세포 나노 입자 식별을 따라 여러 개의 고대비 분산 나노 입자가 증착되는 것을 볼 수 있습니다.

다른 조직 샘플에서는 폐, 간, 비장, 신장, 림프절 등이 가능하다. 이 절차에 따라 입자 수 및 입자 위치와 같은 추가 질문에 답하기 위해 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 고도로 전문화된 제어의 필요성 및 광자 이미징의 해상도에 대한 제한과 같은 특정 고려 사항 및 단점은 기존 방법과 비교해야 합니다.

특정 연구 질문을 조사하기 위해 가장 적절한 분석 기술을 선택할 때, 현재와 미래의 나노 독성학 연구를 보완할 수 있는 잠재력이 있기 때문에 이 특정 응용 프로그램을 시연하기로 선택했습니다. 또한 장기와 조직 전반에 걸친 나노 입자 흡수, 분포, 신진대사 및 배설에 관한 연구에 정보를 제공할 수 있습니다.