Name: 향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 배우세요 향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑을 사용하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자를 식별하는 방법입니다. 이 기술은 전자 현미경보다 빠르고 비용 효율적인 나노 입자 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 동물 연구 협력을 통해 분석을 위한 조직 샘플을 만들어준 Günter Oberdörster, DVM, PhD, Alison Elder, PhD(University of Rochester)와 Mary Frame, PhD(Stony Brook University)에게 감사를 표합니다. 또한 저자는 다음과 같이 감사드립니다: Christina Rotondi(Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD 및 Barbara Cannella, PhD(Albert Einstein College of Medicine 조직학 및 비교 병리학 시설); Leonardo Bezerra 및 Ahlam Abuawad (Brenner 연구 팀원); 레슬리 크라우스(Leslie Krauss), 바이런 치섬(Byron Cheatham), 엘리스 존슨(Elyse Johnson, CytoViva). 이 작업은 CDC-NIOSH 보조금 OH-009990-01A1과 S.B.에 수여된 뉴욕주 NanoHealth and Safety Center의 일부 지원을 받았습니다.

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종래의 조직 학적 염색법, 금속 산화물 나노 입자의 식별 및 분석을받은 조직 샘플은 EDFM, HSI 매핑, 및 영상 분석 기술들의 조합을 통해 달성 될 수있다 들어. 그것은 샘플 최적 시각화 50-10 ㎛의 두께로 절단하는 것이 중요하다; 조직학 또는 면역 조직 샘플 준비 유연성 (얼룩의 타입 등, 고정 또는 고정 된 조직을 사용하여)이 존재한다. 여기에 사용 된 시료를 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색하고 coverslipped, 유리 현미경 슬라이드에 장착, 포르말린 고정 파라핀 이전 6 ㎛의 두께로 회전하는 마이크로톰으로 절편을했다. 생체 외 피부 침투 독성 협력에서 돼지 피부 조직은 본 연구에 사용 하였다. 조직은 수성 현탁액에서 금속 산화물 나노 입자 (알루미나, 실리카, 세리아)에 노출시켰다. 관심 영역 (들)의 검출 (고 대비 eleme국세청) EDFM 후속 HSI 매핑 및 분석을 용이하게하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 양성 및 음성 대조군 샘플 이미징 및 참조 용 스펙트럼 라이브러리를 만들기 위해 먼저 분석해야한다. 양성 대조군에서 수집 된 스펙트럼은 양성 대조군 스펙트럼 라이브러리에 수출하고 있습니다. 그리고, 음의 제어 화상의 모든 스펙트럼 특이성을 개선하기 위하여 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리로부터 감산된다 (위양성을 감소). 결과 필터링 스펙트럼 라이브러리는 관심 물질의 분석을 위해 제공하는 RSL 간주됩니다. 모든 조직 샘플은 동일 화상 형성 공정을 거치며 RSL 대해 매핑된다. 결과 이미지는 검은 배경 위에 관심의 요소와 영역 만 포함됩니다. 이 이미지는 다음 ImageJ에 시야 당 매핑 입자의 영역을 획득하기 위해 임계 값과 입자 분석 기능을 사용하여 분석 될 수있다. ImageJ에 얻은 수치 데이터를 수출 할 수있다추가 분석을 위해 스프레드 시트로 에드. 이는 생물학적 시료가 서로 본질적으로 다르​​며, 염색 방법 EDFM과 HSI 통해 시각화에 영향을 미칠 수 있으므로, 노출 설정은 시료의 특정 유형에 대한 가장 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 것에 따라 결정되어야 함을 고려하는 것이 중요하다. 오탐 (false positive)의 감소가 스펙트럼 라이브러리를 여과를 통해 달성 될 수 있지만,이 오염에 대응하는 스펙트럼 잠재적 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리에서 필터링 될 수 있으므로, 그것은, 관심있는 요소의 오염을 회피 한 신뢰성있는 음성 대조군을 얻기 위해 매우 중요 , 위음성 율을 증가시킨다. SP를 생성 축적 된 입자의 수​​가 높은 영역 : 또한, 하이퍼 스펙트 럴 이미징 소프트웨어와 검출 가능한 스펙트럼 강도 범위가 특정 소프트웨어의 한계 능가 없다 (본 연구를위한, 즉 16000 단위이다)강도 한도 이상의 ectral 강도 인해 위음성의 수를 증가의 위험, 스펙트럼 라이브러리에서 제외된다. HSI 시스템은 기존의 방법에 비해 많은 장점을 부여하지만, 고려해야 할 몇 가지 단점과 한계가 있습니다. 하나는 상당한 컴퓨팅 성능을 요구할 수의 수집 된 광 데이터 다량있다. 또 다른 기준 스펙트럼 라이브러리가 생성 될 때 HSI는 특히 초기 단계에서 시간이 많이 될 수 있다는 것이다. 또한, 촬영 시간은 간단한 암시 야 영상보다가 느리게 만들고, 이미지 캡처 당 몇 분을 필요로 할 수있다 그러나, 여전히 전자 현미경에 의해 샘플 준비 및 시각화를 수행하는 것보다 더 빠르다. 또한, 복잡한 시스템은 매우 전문화 제어의 개발을 필요로하고 26 어려운 표준화 보편적 기준 라이브러리의 구축을 여러 특성 스펙트럼을 초래할 수있다. 최종적으로, 첨단개별 원자를 해결할 수있는 등의 원자력 현미경 또는 투과 전자 현미경과 같은 프로브 - 또는 전자 현미경 기법보다 낮은 해상도에서 nique 결과. 이 기술의 해상도로 인해 나노 미터 수준에서 정확하게 또는 서브 미크론 수준에서 물질을 찾기위한 입자 크기를 측정하기위한 고정밀 공구 할 수없는 성질의 광자, 제한된다. 기술은 특정 조직 구획 또는 세포 소기관 내에서 입자를 정확하게 지적 할 수 있지만 (예 : 세포 핵 등)보다 1 ㎛, 작은 세포 기관 또는 기능은이 방법으로 정확하게 시각화하기 위해 도전하고 있습니다. 또한 공간 해상도 주어진 참고,의,이 방법은 단일 나노 입자 덩어리 (11)를 구별 할 수 없습니다. 기타 고려 사항은 다음과 같습니다 (예 : 귀금속 등) 특정 재료들을 쉽게 analy 할 수 있도록 할 수있는, 훨씬 더 높은 반사율과 별개의 스펙트럼 프로파일이ZE이 도구를 사용하여 스펙트럼지도. 같은 반 금속이 연구에서 조사 산화물과 탄소 기반 나노 물질 24, 27와 같은 다른 사람들은 그들의 원소 조성, 형상에 더 도전, 그리고 매트릭스에 따라 수 있습니다. 머서 의해 외. 두 뮤린 흡입 연구에서, 본 연구에 사용 된 것과 유사한 시스템이 폐와 주위 조직과의 현저하게 높은 콘트라스트 차에 기초하여 장기에 탄소 나노 튜브를 찾기 위해 사용 하였다. 탄소 섬유의 형상은 고유 식별을위한 충분한 특성이었다 때문에, 하이퍼 스펙트 럴 매핑은, 어느 연구 것으로 입증되지 않았다. 정상적인 생물 물리학 적 과정을 통하여 특정 장기에 관심 나노 입자를 증착하는 단계 (그리고 종종 그 자체 연구 주제) 예측할 수 있기 때문에, 적용 양성 대조군의 결정이 어려울 수 있으며, 상기 제어 m의 방법 생성을 고려를 요구한다 : 또 다른 고려 사항은 조직 특이 관한관심 물질의 상태에 영향을 ight. 스펙트럼 라이브러리는 관심 깨끗한 나노 입자에서 생성되는 경우, 예를 들어, 인한 변화에 따른 예를 들어 입자 (의 변화로 인한 스펙트럼 변화에 조직 또는 세포에서와 같은 나노 입자 라이브러리를 매핑하기 어려울 수있다 산도, 용해, 응집, 단백질 결합) 및 전체 미세 또는 매트릭스. 마지막으로,이 기술은 그 반 정량적 자연 제한된다 : 그것은 단지 쉽게 그러한 재료의 전체 장기 부담을 특징으로 작업을 수행 할 수 없음을 의미 유사한 해상도, 다른 이차원 현미경 기술로 정량 할 수있다. 전반적 EDFM 및 HSI는 TEM, HAADF 및 DIC 같은 종래 나노 이미징 특성화 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. EDFM / HSI 더 집중적 편의에 비해 시간과 비용을 절약 빠른 이미지 획득 및 분석을 허용적인 기술. 또한 EDFM / HSI 용 샘플 준비 시간을 절약하고이어서 다른 기술에 사용될 수 있기 때문에, 또한 주어진 샘플의보다 유연한 분석을 허용하는 일반적으로 최소 및 비파괴 모두이다. 또한, HSI 많은 조성물의 나노 물질의 분석 및 행렬의 다양한 있도록 다재다능하다. 연구팀은이 기술의 특이성에 대한 심층적 인 평가를 포함한 기타 자료 및 샘플 유형, 여기에 기술 된 방법을 구체화하기 위해 노력하고 있습니다. 연구팀의 조사에서 중요한 다음 단계는 기존의 골드 표준에 대한 이러한 기술 검증 (예, 라만, TEM, SEM) 재료와 관심의 조직 유형.

나노 물질이 점점 산업 및 다양한 용도에 사용되는 바와 같이, 더 신속한 저렴 및 전자 현미경과 같은 기존의 양상,보다 편리 나노 이미징 및 특성화 방법이 필요하다. 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경 (1) 및 내부 전반사 (TIR) ​​또는 근 등 산장 기반 접근 방식을 포함하여 많은 광학 기술이 채용 된 세포, 조직 및 생활 시스템과 나노 입자 (NP)의 상호 작용을 시각화 필드 주사 광학 현미경 (NSOM) 2,3. 그러나 이러한 대부분의 비 전문 연구소 4의 손이 닿지 않는 곳에 하이 엔드 분석 접근 방식이다. 투과 전자 현미경 (TEM)을 포함하여 전자 현미경은 또한 세포와 5,6,7,8- NP 상호 작용을 연구하는데 사용되었다. 높은 각도 환형 암시 야 (HAADF) 주사 투과형 전자 현미경 된 NP의 상호 작용을 연구하기 위해 사용되어왔다바이러스 9. 공 초점 현미경 NP-세포 상호 작용 (10)을 연구하는 데 또 다른 인기있는 기술이다. 최근, 암시 야 계 초 분광 영상 (HSI) 기술은 생물학적 매트릭스 11 NPS를 연구하기위한 유망한 분석 도구로서 사용되어왔다. HSI 시스템 또는 하이퍼 큐브 datacube 12라고도 공간 및 스펙트럼 데이터의 3 차원 표현을 생성한다. 스펙트럼 변동 공간지도 소재 식별을 위해 사용된다. 공지 된 재료의 스펙트럼 프로파일이 생성 미지 시료에 비교 참조 라이브러리로서 사용될 수있다. HSI 시스템과 주요 이점 중 하나는 이에 의해 공지 된 유사한 조성물의 다른 기준 입자에 이들과 결합뿐만 아니라 또는 생체 생체 내 위치 알려지지 된 NP의 분포를 확립 분광법으로 촬상을 결합 할 수있는 능력이다. 여러 장점이 있습니다종래의 이미징 기술 위에 HSI 시스템을 사용 : 최소 샘플 준비가 요구된다; 시료 준비는 자연에서 일반적으로 비파괴; 이미지 수집 및 분석은 빠르다; 기술은 비용 효율적인 13이고; 혼합 된 조성물 및 / 또는 복잡한 매트릭스의 화합물의 공간 분포 분석은보다 쉽게 14 달성된다. 귀금속 나노 물질을 포함하는 샘플의 연구를위한 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 잠재적 반복 하나 이상의 방법에 의해 시료를 검사 할 수있는 비파괴 이미징 법의 유용성이다. 반복 또는 복수의 분석은 하나의 방법에서 사용하지 못할 것입니다 포괄적 인 데이터 세트를 개발하는 것이 바람직 할 수있다. 이러한 측면에, 그 광학 특성을 연구하는 샘플을 분석하는 안전한 방법이다. 향상된 암시 야 현미경 (EDFM)와 HSI 시스템을 사용하여 샘​​플의 광학 응답을 연구 - 즉 reflectance뿐만 아니라, 흡광도 및 투과율 - 기능 식별 및 특성은 15을 행할 수있다. 잠재적 인 특성 엔드 포인트는 상대적인 크기와 샘플 내에서 나노 입자 또는 덩어리와 나노 입자의 분포의 모양에 대한 평가를 포함한다. 본 논문에서는 스펙트럼 각도 맵퍼 (SAM)로 지칭 화소 스펙트럼 매치 알고리즘을 기반 HSI 시스템을 이용하여 사후 조직에서 금속 산화물 나노 입자에 대한 구체적 매핑 방법을 설명한다. 이 동물 모델은 나노 물질에 대한 노출의 건강 영향을 평가하는 데 사용되는 것을 특징으로하는 생체 나노 독성학 연구에서 현재와 미래를 보완 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 우리는이 특정 응용 프로그램을 선택했다. 이 방법의 응용 프로그램은 또한 조직 또는 동물 모델을 이용하여 나노 약물 전달 연구를 알릴 수있다. O에 걸쳐 특히, 나노 입자의 흡수, 분포, 대사, 배설에rgans와 조직이 시스템을 조사 할 수있다. 애플리케이션의 다양한 생물 의학 연구 (11)에서 사용하기 위해 연구되고있다. 이 방법은 원소 조성물 16-19의 다양한 나노 입자에 노출되어 (예컨대 다양한 조직 유형, 기관지 폐포 세척액 시료 및 혈액 도말 같은) 상이한 생물학적 시료의 평가에 이용 될 수있다. 또한,이 방법은 생체 내에서와 나노 약물 전달 연구 (11)에 대한 관련입니다 체외에서 나노 입자의 생체 분포를 연구하는 데 유용합니다. 생물학적 시료 넘어 EDFM 및 HSI는 폐수 20 환경 시료에서 나노 입자를 평가할 수있다. 이 나노 입자의 침입을 방지 개인 보호 장비의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에, 작업장 노출 평가는 물론이 기술의 사용에 의해 촉진 될 수있다. 또한, 연구 테오전 현재 직업적 노출 평가에서 수집 된 나노 입자의 필터 미디어 샘플의 평가 및 유사 EDFM HSI 프로토콜을 개발하고있다. EDFM HSI 및 이러한 다른 종류의 시료 준비는 다를 수 있지만, 그들이 쉽게 광학계에 의해 가시화 될 수있는 방식으로 제조하는 것이 중요하다. 그것은 전통적인 시야 현미경을 통해 가시화 될 것처럼 일반적 시료로한다. (11) 시판의 하이퍼 스펙트 럴 여러 이미징 시스템이있다.

<table><tbody><tr><td>CytoViva 150 유닛(콘덴서)</td><td>CytoViva(Auburn, AL)</td><td></td><td>에 장착Olympus BX43 현미경</td></tr><tr>Olympus BX43 현미경 - 분석기 슬롯 - <td>CytoViva 150 유닛 콘덴서와 함께 사용하기 위해</td><td>CytoViva(Auburn, AL)</td><td></td>를 통해 얻은<td>10x 및 40x 공기 대물렌즈 및 100X 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 HSI</td></tr><tr><td>Dagexcel-M 디지털 Firewire 카메라 - 냉각, Exponent 7 소프트웨어 포함</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td><td>향상된 암시야 카메라 및 소프트웨어</td></tr><tr><td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4를 통해 획득; Pixelfly 초분광 카메라, XY 스테이지 컨트롤러,</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> <td>초분광 카메라 및 소프트웨어</td></tr><tr><td>클린룸 청소 유리 현미경 슬라이드 (유리 B 슬라이드)</td>를 통해 얻은 ENVI 초분광 이미징 소프트웨어 포함<td>Schott NEXTERION</td><td>1025087</td><td>최적의 이미징을 위해 기존 유리 현미경 슬라이드에 비해 잔해와 아티팩트 감소</td></tr><tr><td>클린룸 청소 유리 현미경 커버슬립 (#1.0; 22 mm x 22 mm x&nbsp; 1.45 mm)</td><td>Schott NEXTERION</td>은 최적의 이미징 유형 A 현미경 이머젼 오일<td>을 위해 기존 유리 커버슬립에 비해 파편과 아티팩트</td>를 <td>맞춤 제작</td>했습니다</tr>. <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12368B</td><td>다중 공급업체</td></tr><tr><td>70% 이소프로판올 물</td><td></td><td></td><td>여러 공급 업체</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH (National Institutes of Health)</td><td></td> <td>무료 오픈 소스 소프트웨어 온라인 다운로드</td></tr><tr>산업 파트너 <td></td> 알루미나, 실리카 및 세리아 나노 입자가 수성 현탁액으로 <td>연구팀에 공급한</td><td>금속 산화물 나노 입자</td><td>. 저자와 업계 파트너 간의 기밀 유지 계약으로 인해 추가 제품 정보는 공개할 수 없습니다.</td></tr></tbody></table>

향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

나노 물질은 산업, 제조 및 생물 의학 연구 전반에 걸쳐 점점 더 널리 보급되고 있습니다. 생물학적 샘플에서 나노 단위 물질의 식별, 국소화 및 특성화를 지원하는 도구와 기술의 필요성이 증가하고 있습니다. 전자 현미경과 같이 현재 사용 가능한 방법은 자원 집약적인 경향이 있어 많은 연구 커뮤니티에서 사용이 금지되어 있습니다. 초분광 이미징 시스템으로 보완된 향상된 암시야 현미경은 조직학적 샘플에서 나노 입자의 빠르고 저렴한 특성화를 가능하게 하여 이러한 병목 현상에 대한 솔루션을 제공할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 고대비 나노 스케일 이미징과 나노 물질 식별이 가능합니다. 이 기술을 위해 조직학적 조직 샘플은 광 기반 현미경 검사와 마찬가지로 준비됩니다. 먼저, 양성 대조군 샘플을 분석하여 샘플에서 관심 물질을 검출할 수 있는 참조 스펙트럼을 생성합니다. 관심 물질이 없는 음성 대조군도 특이성을 개선하기 위해 분석됩니다(거짓 긍정 감소). 그런 다음 초분광 현미경 검사용 방법 및 소프트웨어를 사용하여 샘플을 이미징 및 분석하거나 이러한 참조 스펙트럼과 일치시켜 샘플에서 관심 물질의 위치에 대한 지도를 제공할 수 있습니다. 이 기술은 귀금속과 같이 매우 독특한 반사 스펙트럼을 가진 재료에 특히 적합하지만 반금속 산화물과 같은 다른 재료에도 적용할 수 있습니다. 이 기술은 전자 현미경 기술을 사용하지 않고는 조직학적 샘플에서 얻기 어려운 정보를 제공하며, 이는 더 높은 감도와 해상도를 제공할 수 있지만 광학 현미경보다 훨씬 더 자원 집약적이고 시간이 많이 소요됩니다.

하이퍼 스펙트 럴 현미경 측정법에 유사한 방식으로 물질을 식별하는 능력에 유용하다. 그림 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 재료는 여러 가지 특성 스펙트럼과 고유의 반사율의 전체 모양을 가지고 있습니다. 또한,도 1은 스펙트럼 정보의 매트릭스 - 의존 특성을 도시한다 : 조직 학적 조직 샘플에서 세 금속 산화물의 각각의 (상부 패널)에 대한 스펙트 럴 프로파일은 수성 현탁액의 3 금속 산화물 각각에 대한 스펙트 럴 프로파일 (상이한 하단 패널). 동일한 매트릭스 미지 시료에 분광 특성 정보를 매핑함으로써, 기술은 재료의 유무를 확인하는 데 유용하고, 또한 반 정량적으로 샘플 물질의 상대적인 양을 비교할 수있다. 양성 대조군 피부 샘플에서 생성 된 기준 스펙트럼 라이브러리는 실험에 매핑에 적합한피부 샘플. 도 2에 도시 된 바와 같이, 기준 스펙트럼 라이브러리 대응 양성 대조군 웰에 매핑하고 대응하는 음성 대조군에 매핑되지 않는다. 기술의 가장 중요한 장점은 샘플에서 관심 물질의 낮은 수준을 검출 할뿐만 아니라, 오염물들을 구별 할 수있는 능력이다. . 예를 들어, 개별 나노 튜브는 20~30g 쥐 25에서 40 μg의 낮은 용량의 흡입시 폐에서 관찰 할 수있다 그림 3이 조직 학적 피부 샘플을 보여줍니다 일부 입자가 암시 야 광학 이미지에서 쉽게 명백한 반면 (열을 2) 나머지는 명 시야 현미경 (컬럼 1), 또는 다른 방법을 사용하여 누락되었을 수있는 하이퍼 스펙트 럴 영상 (컬럼 3)를 사용하여 검출된다. 암시 야 HSI의 사용은 단순 시야 현미경 위에 특이성을 향상시키는 역할을한다. 이러한 이미지는 다음, 분석의 더 정량적 형태의 대상이 될 수 없음ImageJ에 통해 otably 입자 분석. 향상된 암시 야 현미경 심지어 하이퍼 스펙트 럴 이미징 부재에서 여러 가지 응용을 갖는다. 첫번째 품질 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 능력이다. 이 가장 잘되는 관심의 입자는 그들의 시야 대응에 비해 쉽게 식별하고, 그림 3에 의해 입증된다. 하이퍼 스펙트 럴 매핑의 부재 하에서,주의가 관심 입자로부터 오염물 입자 혼란을 방지 할 필요가 있지만 이들 이미지는 또한, 입자 정량 분석​​의 대상이 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> 스펙트럼 라이브러리 (서스펜션의 나노 입자)에 비해 그림 1 참조 스펙트럼 라이브러리 (조직 매트릭스). 이 도면은 유모으로부터의 기준 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 것의 중요성을 보여준다실험 샘플과 같은 행렬에 대한 관심이 omaterials. 첫 번째 행이 연구 (알루미나, 실리카, 세리아)의 각 물질에 대한 기준 스펙트럼 라이브러리 (RSL)를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이 RSL은 양성 대조군 조직 샘플을 음성 대조군 조직 샘플에 대해 여과하고이 프로토콜에 기재된 방법에 의해 만들어졌다. 두 번째 행은 유리 슬라이드에 액체 현탁액에 대한 관심의 나노 입자에서 생성 된 스펙트럼 라이브러리 (SL)를 보여줍니다. 더 곡선 덜 특유의 피크가 약 650의 파장에서 약 600 실리카, 피크에서 알루미나 순이익 서스펜션 SL에서 관찰되었다 반면, 알루미나를 들어, 500과 650의 파장에서 바이 모달 피크, RSL에서 발견했다 더 곡선 덜 특유의 피크가 arou에 실리카 순이익 서스펜션 SL에 보였다 반면, RSL에 존재덜 특유의 피크가이 국민 연금이 포함 된 행렬이 만들어 제안하는 것이 주변 (560)에 세리아 순이익 서스펜션 SL에서 관찰되었다 반면 차 세리아를 들어 600은 바이 모달 피크, RSL 520과 620의 파장에서 발견되었다 특정 실험에 대한 SL을 만들 컨트롤을 선택할 때 상당한 될 수 있습니다 스펙트럼의 변화. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> 그림 2. 참조 스펙트럼 라이브러리 (조직 매트릭스) 양성 대조군과 음성 대조군 돼지 피부 조직에 매핑. 각 RSL (왼쪽 열)의 대응 양성 대조군 (가운데 열)에 잘 매핑과는 음성 대조군 (오른쪽 열)에 대응에 매핑되지 않는다는 점에서이 그림은., 실험 샘플 매핑에 맞게 RSL에 확인 역할을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">하십시오 시간을 클릭</a>감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> 금속 산화물 나노 입자에 노출 실험 돼지의 피부 조직의도 3 초 분광 매핑. 각각 표피, 진피, 피하 조직 : 위에서 아래로 행은 다른 표면에서 깊은 층에 피부의 층에 해당합니다. 첫째 행은 현탁액 중의 알루미나 NP에 노출 된 피부 샘플로부터 표피의 각질층을 나타낸다 두 번째 행은 서스펜션에 NPS를 대 실리카에 노출되었다 세 번째 행은 서스펜션에 NPS를 산화 세륨합니다. 각 열은 다른 이미징 기술과 피부의 동일한 영역을 나타낸다. 첫 번째 열은 빨간색 사각형으로 둘러싸인 영역이 확대 된 시야 현미경 (40X 잡지; 스케일 바 = 50 μm의)에 해당 (100X 잡지, 스케일 바 = 10 μm의) 강화 암시 야 현미경과 (EDF흰색 화살표가 높은 콘트라스트 된 NP를 가리키는 두 번째 열에서 M). 세 번째 열은 같은 고 대비 NP에 (흰색 화살표)를 보여, 하이퍼 스펙트 럴 카메라 (HSI)를 얻었다. EDFM 및 HSI 이미지는 100 배의 배율로 찍은; 스케일 바는 10 μm의 =. 네 번째 열은 알루미나 된 NP는 녹색, 빨간색 실리카 NP에, 그리고 세리아 NP에 표시됩니다 각 노출 그룹에 대한 각각의 RSL에 대해 매핑 HSI 이미지를 보여줍니다 노란색, 각각. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

향상된 암시야 현미경 및 스펙트럼 매핑을 통한 초분광 이미징을 통해 기존 방법보다 향상된 속도와 정확도로 조직학적 샘플에서 나노 단위 물질의 스크리닝, 위치 파악 및 식별이 가능합니다. 이 논문의 목표는 조직학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 암시야 이미징 및 초분광 매핑 방법을 제공하는 것입니다.

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

이 절차의 전반적인 목표는 암시야 현미경 검사와 하이퍼스펙트럴 매핑을 통해 조직학적 시료 내의 금속 산화물 나노입자를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 나노입자가 포함된 양성 대조군 시료에서 관심 영역을 식별하고 암시야 이미지를 캡처함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 하이퍼스펙트럴 카메라를 사용하여 해당 관심 영역의 하이퍼스펙트럴 이미지 또는 데이터 큐브를 생성하는 것입니다.다음으로, 양성 대조군 데이터 큐브로부터 참조 스펙트럼 라이브러리를 생성하며, 이는 위양성을 제거하기 위해 음성 대조군을 대상으로 필터링됩니다. 마지막 단계는 이 참조 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 실험 샘플과 매핑함으로써 동일한 조성을 가진 나노입자를 식별하고 위치를 찾는 것입니다. 궁극적으로 강화 암시야 현미경과 하이퍼스펙트럴 매핑을 활용하면 전자 현미경과 같은 다른 기술보다 더 빠르고 자원 소모가 적은 방식으로 조직학적 샘플 내의 금속 산화물 나노입자를 식별할 수 있습니다.이 방법은 전자 현미경과 같은 기존의 나노 물질 이미징 및 특성 분석 기술에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 일반적으로 시료 준비 과정이 최소화되며 비파괴적이라는 점이 그 예입니다. 또한, 이미지 획득 및 분석에 소요되는 시간과 비용이 적으며, 다양한 매트릭스 내의 나노 입자 이미징에 적용될 수 있습니다.적절한 양성 대조군 시료와 참조 스펙트럼 라이브러리를 구축하는 것이 까다롭고 시간이 많이 소요되기 때문에 연구자들이 이 방법론을 적용하는 데 어려움을 겪는 경우가 있습니다. 하지만 이러한 초기 단계가 완료되면 실험 시료를 매우 빠르게 평가할 수 있습니다. 이 방법은 나노입자의 피부 침투에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 기관지폐포 세척액 및 혈액 도말과 같은 다른 생물학적 시료는 물론, 직업적 노출 평가에 사용되는 필터와 같은 비생물학적 시료에도 적용될 수 있습니다.본 기술의 시연은 저희 실험실의 의대생인 Plar Sosa가 맡아 진행하겠습니다. 먼저 광원, 스테이지 컨트롤러, 광학 카메라, 하이퍼스펙트럴 카메라 및 컴퓨터 시스템의 전원을 연결하고 켭니다. 그다음 스테이지와 콘덴서를 작동 위치까지 올리고, 콘덴서 렌즈 위에 Type A 침액유를 3~5방울 조심스럽게 도포합니다. 기포가 발생한 경우, 오일을 닦아내고 렌즈에 다시 도포하십시오.다음으로, 샘플을 스테이지 위에 배치하고 콘덴서를 천천히 올려 이머전 오일이 슬라이드 하단에 닿게 합니다. 오일이 슬라이드에 닿는 지점에서 조명 링이 급격히 밝아지므로 이를 통해 확인할 수 있습니다. 콘덴서가 배치되면 10 x 대물렌즈로 전환한 후, 필요한 경우 밝기를 최대화하기 위해 콘덴서의 초점을 맞추고 정렬하며, 콘덴서 정렬 노브를 조정하여 밝은 지점을 중앙에 맞춥니다.광학 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 미동 초점 조절 나사를 사용하여 샘플의 초점을 맞춥니다. 그 다음 관심 영역(region of interest)을 찾습니다.조명을 균일하게 맞추기 위해 필요한 경우 컨덴서 초점을 조정하십시오. 메뉴 바의 설정 탭을 클릭하고 이미지 캡처 버튼을 클릭하십시오. 캡처 이벤트의 경우입니다.원하는 이미지 형식을 선택하고 이미지 파일 이름을 지정하십시오. 추가로, 기본 타임랩스 값을 선택한 후 확인을 클릭하십시오. 다음으로, 노출 메뉴로 이동하여 가장 높은 대비의 이미지를 생성하는 노출 설정을 선택하십시오.여기서 레벨은 0.0%로 설정합니다. 게인은 2.8 decibels로 설정하고 셔터 속도는 56 milliseconds로 설정합니다. 메뉴 바의 이미지 버튼을 클릭하여 이미지를 캡처합니다. 대물렌즈를 40 x 및 100 x로 변경합니다.더 높은 배율로 이미지를 캡처하려면 라이트 가이드가 하이퍼스펙트럴 카메라를 향하도록 조정하십시오. 그 다음, HSI 데이터 큐브를 획득하기 위해 하이퍼스펙트럴 이미징 소프트웨어를 실행하고, 메뉴 바에서 하이퍼스펙트럴 현미경(hyperspectral microscope)을 열어 HSI 현미경 제어(HSI microscope controls)를 선택하십시오. 여기서 대물렌즈 배율과 안전 경로(safe path)를 설정하십시오. 이어서 설정에서 캡처 영역(area capture)을 변경하고 라인 수를 변경하십시오.본 연구에서는 노출 시간을 설정하기 위해 720을 사용하였습니다. 여기서는 0.25초를 사용했습니다. 그 외 모든 설정은 기본값으로 두고 HSI 미리보기를 클릭하여 이미지를 확인하십시오.사용자가 카메라 화각의 중심 x축을 따라 이동함에 따라 가장 긴 파장의 강도를 나타내는 결과 강도 그래프를 관찰하십시오. 커서를 움직여 그래프의 정확한 외곽선을 생성하십시오. 이렇게 하면 왼쪽에 수치 강도 표시기가 나타납니다.이 미리보기를 바탕으로 대물렌즈 미동 초점을 조절하여 이미지의 피크를 선명하게 함으로써 초점을 맞추십시오. 다음으로, 광원 밝기나 콘덴서 초점을 조절하여 빛의 세기를 최적화하거나, 미리보기를 취소하고 소프트웨어에서 노출 시간을 조절하십시오. 캡처를 클릭하면 해당 이름의 새 창 네 개가 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.밴드 목록입니다. 1번 줌, 1번 스크롤 및 1번 RGB 밴드가 나타납니다.이 데이터 큐브는 향후 모든 참조에 사용되므로, 첫 번째 RGB 밴드 창을 최대화하십시오. 이 데이터 큐브를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 tiff 파일로 저장한 다음 확인을 클릭하십시오. 데이터 큐브 이미지 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Z profile spectrum을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하십시오.왼쪽에 팝업 스펙트럼 프로파일 창이 나타나면, 데이터 큐브 타겟에서 관심 픽셀을 클릭하십시오. 가장 밝은 픽셀들이 관심 물질을 나타내는 것으로 확실하게 식별할 수 있는 픽셀들입니다. 입자 분석 메뉴에서 입자 필터 도구를 선택하여 데이터 큐브에 존재하는 입자들을 식별하십시오.새 팝업 창 설정에서, spectral max 값은 배경 픽셀보다 높지만 관심 대상 물질보다는 낮도록 설정해야 합니다. 유효 데이터의 최대값은 16, 000입니다. 입자 필터 검토 도구 창에서 전체 선택을 클릭하십시오.그 다음 스펙트럼 라이브러리로 내보내기를 클릭하고 스펙트럼 라이브러리의 이름을 지정하십시오. 음성 대조군으로 사용할 샘플을 선택한 후, 해당 샘플에서 여러 개의 데이터 큐브를 획득합니다. 하이퍼스펙트럴 카메라를 사용하여 최소 하나 이상의 데이터 큐브가 필요하며, 더 많은 수를 캡처할 수 있습니다.음성 대조군 데이터 큐브가 열린 상태에서 선택성을 높이려면, 메인 프로그램 툴바에 있는 분석 메뉴에서 spectral library 필터를 클릭하십시오. open new file을 클릭하고 이전에 양성 대조군을 위해 생성한 spectral library를 입력 파일로 선택한 다음, okay를 클릭하십시오. filter cyto viva spectral library 창에서 image를 클릭하고 참조 spectral library의 출력 파일 이름을 선택한 후, okay를 클릭하십시오.다음으로, 소스 이미지로 음성 대조군 데이터 큐브의 파일 이름을 클릭하십시오. 소프트웨어가 스펙트럼 라이브러리를 분석하여 음성 대조군 데이터 큐브의 스펙트럼과 일치하는 모든 스펙트럼을 제거합니다. 실험 데이터 큐브를 연 상태에서 실험 샘플로부터 데이터 큐브를 획득하십시오.매핑 방법 서브메뉴에서 스펙트럼 메뉴를 클릭하여 spectral angle mapper를 엽니다. 팝업 창에서 실험 데이터 큐브의 이름을 선택하고 확인을 클릭합니다. 파일 이름이 나열되지 않은 경우, 새 파일 열기를 클릭하고 실험 데이터 큐브를 선택하십시오.그런 다음 End Member collection이라는 팝업 창에서 확인을 클릭하고, SAM의 메뉴 바에서 import를 클릭하십시오. 이어서 Spectral Library file을 선택하십시오. 이전에 생성한 참조 스펙트럼 라이브러리를 열고 확인을 클릭하십시오.Input Spectral Library라는 이름의 새 팝업 창에서 select all items를 클릭한 후 okay를 클릭합니다. 그런 다음 color를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 select Apply default colors to all을 선택한 뒤 select all과 apply를 차례로 클릭하고, 출력 파일 이름을 선택한 후 okay를 클릭합니다.데이터 큐브 창의 오버레이 메뉴를 열고 classification을 선택합니다. 그런 다음 출력 파일 이름을 지정하고 확인을 클릭합니다. 대화형 클래스 도구 창 메뉴의 옵션 메뉴를 열고 merge classes를 선택하여 통합된 색상 체계를 생성합니다.다른 소프트웨어를 사용하여 데이터를 더 쉽게 분석하려면, 기본 클래스 목록에서 단일 스펙트럼을 선택하십시오. 그런 다음 미분류(unclassified)를 제외한 모든 클래스를 선택하여 기본 클래스로 병합하십시오. 그 후 확인을 클릭하십시오.다음으로, 선택한 기본 색상을 클릭하면 일치하는 모든 스펙트럼이 해당 색상으로 표시됩니다. 검은색 배경 위에 일치하는 스펙트럼을 보여주는 정적 이미지를 얻으려면 기본적으로 검은색인 미분류 색상 상자를 클릭하십시오. 이 기술의 가장 큰 장점은 암시야 현미경 및 하이퍼스펙트럴 매핑을 통해 조직학적 샘플 내의 금속 산화물 나노입자를 식별할 수 있다는 점입니다. 다음 이미지들은 피부 조직 샘플을 사용하여 이 과정을 보여줍니다.일부 입자들은 암시야 광학 이미지에서 쉽게 확인되지만, 하이퍼스펙트럴 이미징을 통해 추가적인 입자들을 검출할 수 있습니다. 여기 제시된 것은 Illumina 나노입자에 노출된 표피층의 돼지 피부 조직입니다. 실리카 나노입자에 노출된 진피층의 각질층 위에는 고대비의 나노입자 클러스터가 침착된 것이 확인되었습니다.결합 조직 위에 증착된 다수의 고대조도 나노입자를 확인할 수 있습니다. 마지막으로, Syria 나노입자에 노출된 피하 조직에서는 지방세포를 따라 분산된 다수의 고대조도 나노입자가 증착된 것을 볼 수 있으며, 이 방법을 통해 나노입자 식별이 가능합니다.폐, 간, 비장, 신장 및 림프절과 같은 다른 조직 샘플에서도 가능합니다. 이 절차를 수행한 후, 입자 수 및 입자 위치와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 고도로 전문화된 대조군의 필요성과 광자 이미징의 해상도 제한과 같은 특정 고려 사항 및 단점들을 기존 방법들의 특성과 함께 비교 검토해야 합니다.특정 연구 질문을 조사하기 위해 가장 적절한 분석 기술을 선택할 때, 당사는 이 particular 응용 방법이 현재 및 향후의 나노 독성학 연구를 보완할 가능성이 있기 때문에 이를 시연하기로 결정했습니다. 또한, 이는 장기 및 조직 전반에 걸친 나노입자의 흡수, 분포, 대사 및 배설에 관한 연구에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.

identification-metal-oxide-nanoparticles-histological-samples

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 특정 관심 세포주의 세포막과 플라즈몬 금 나노막대의 상호 작용을 모니터링하기 위해 단일 입자 추적(SPT) 분석과 결합된 암시야 현미경(DFM) 기술에 대해 설명합니다. 결합된 DFM 및 SPT 분석을 통해 높은 시공간 해상도로 세포막을 통한 나노막대 움직임을 시각화할 수 있습니다.

세포막에서 나노막대의 확산 역학을 시각화하기 위한 암시야 현미경 검사

얇은 기관 및 종양 조직에서 수행 레이저 유도 분석 분광법을 성공적으로 하나님 기반의 나노 입자에서 발행 자연 요소와 인위적으로 주입 가돌리늄 (하나님을) 발견되었습니다. 화학 원소의 이미지는 100 μm의 양적 서브 밀리미터 감도의 해상도에 도달했습니다. 표준 광학 현미경과 설치의 적합성은 같은 생체 조직의 여러 이미지를 제공하기 위해 잠재력을 강조한다.

레이저 유도 내역 분광학 : 장기 조직에 나노 입자의 매핑 및 정량을위한 새로운 접근

때문에 팔라듐, 금, 코발트의 중요성과 광범위한 사용   첨단 기술 장비 금속은, 자신의 회수 및 재활용은 중요한 산업 문제를 구성한다. 본원에 기재된 금속 회수 시스템은 간단하고, 저비용 도시 내에서 이러한 금속의 유효 검출, 제거 및 복구를위한 수단이다.

감지 및 팔라듐의 복구, 도시 광산에서 금과 코발트 금속은 나노 수레 바퀴 모양의 기공 지정 소설 센서 / 흡착제를 사용하여

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.

제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.

단일 금속 나노 입자의 고분해능 물리적 특성화

이 프로토콜의 목표는 혈장 나노 입자 샘플의 제조를 위한 입증 된 접근법을 상세히 설명 하 고 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용 하 여 단일 입자 분광학을 수행 하는 것입니다.

투과 형 Nomarski 타입 차동 간섭 콘트라스트 현미경을 사용 하 여 플라스 몬 Ic 나노 입자에 대 한 분광학 수행

여기서, 우리는 발광 하이퍼 스펙트럼 이미징 데이터를 얻고 하이퍼 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 란탄 기반 단결정의 광학 이방성 기능을 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

란탄제 기반 분자 단결정에서 광학 이방성 연구를 위한 도구로서의 하이퍼스펙트럼 이미징

여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

여기에서는 식수 내 오염 입자를 효율적으로 포집하고 분석하기 위해 광학적으로 투명하고 평평한 기판을 보여주는 프로토콜을 제시합니다. 여기에 제시된 것은 실리콘 나노멤브레인 분석 파이프라인(SNAP)입니다: 액체 매체에서 입자의 포집, 정량화 및 식별을 위한 유연한 파이프라인입니다.

실리콘 나노멤브레인 분석 파이프라인을 사용한 식수 내 미세 플라스틱의 멀티모달 분석

배우세요 향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑을 사용하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자를 식별하는 방법입니다. 이 기술은 전자 현미경보다 빠르고 비용 효율적인 나노 입자 분석을 가능하게 합니다.

향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별

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