Name: 마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 학습하세요 LINC 단지를 방해하는 형광 표지된 EGFP 캐시 투 펩타이드를 유도적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하는 방법을. 이 기법은 핵 위치 설정 연구에 활용됩니다.

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저자는 (학과 안과 및 Visual 과학)과 의학의 세인트 루이스 학교 워싱턴 대학에서 마우스 유전학 코어의 분자 유전학 코어, 형태 및 이미지 코어의 직원을 감사드립니다. 저자는 세포에 대한 맥도넬 센터 및 분자 신경 생물학, 신경 장애에 대한 희망 센터에서 작은 보조금 프로그램에 의해 지원, 국립 안과 연구소 (DH에 # R01EY022632), 국립 안과 연구소 센터 코어 그랜트 (# 1 P30EY002687) 및 연구에서 무제한 부여 안과 및 Visual 과학 부서에 실명을 방지합니다.

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 세인트 루이스의 워싱턴 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 마우스 사육 및 유전자형 <ol><li> (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19, 20, Tg는 생산의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2)의 Tg와 마우스 (PCP2-Cre 호텔) 쥐 새끼를 낳. 주 :이 프로토콜의 나머지는 소뇌 내 조롱박 세포 EGFP-KASH2 발현을 제한의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 마우스 라인의 사용에 초점을 맞추고 있지만, 유사한 절차가 다른 Tg는 (Cre 호텔) 마우스 수 미행 ( 도 2A). </li><li> 이전 19 설명 된대로 모두 EGFP와 Cre 호텔 유전자를 품고 새끼를 식별하는 유전자형을 수행합니다. </li></ol> 해부 및 조직 컬렉션 재료 2. 준비 <ol><li> -20 ℃에서 30 %의 수크로오스 PBS (PBS 1X 중 자당 30g / 100 mL) 및 점포 100 ㎖를 준비한다. 조직 (H)의 일transcardial 관류에 대한 35 ML의 주사기에 arvesting, 해동 및 자당 용액의 부하 ~ 30 ~ 35 ml의. </li><li> PBS로 4 % PFA, 40 ㎖ (10 ㎖, 16 % 파라 포름 알데히드 및​​ PBS 30 ㎖)을 준비한다. transcardial 관류에 대한 35 ML의 주사기에로드 ~ 30 ~ 35 ml의 4 % PFA. </li><li> 조직의 절개에 대한 PBS의 10 ㎖로 10cm 조직 배양 판을 채 웁니다. </li><li> 16 ㎎ / ㎖ 케타민 3 ㎎ / ㎖ 자일 라진 구성된 케타민 / 자일 라진 칵테일을 준비합니다. </li><li> 해부에 대한 70 % 에탄올 용액을 준비합니다. </li></ol> 3. 해부 및 조직 컬렉션 <ol><li> 1 ML의 주사기를 사용하여, 체중 25g 당 케타민 / 자일 라진 칵테일 500 μl를 주입하고 15 분 ~ 기다립니다. 대안 적으로, 관심있는 생물학적 시스템에 적합한 다른 제도적 승인 진정 방법을 사용한다. </li><li> 진정되면, 부드럽게의 등쪽면 스티로폼 트레이에 모든 발 핀, 통증 반응의 부족을 확인하기 위해 후면 발을 꼬집어마우스를 아래로 향하게. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하고 마음에 액세스 할 흉곽의 상단에 하복부에서 절개를합니다. </li><li> 심장의 우심방의 작은 절개를 확인하고 심장의 좌심실에 30 % 자당 용액이 들어있는 주사기를 삽입합니다. </li><li> ~ 2-5 ml의 당 분의 속도로 용액을 관류. 비어있는 경우, 주사기를 제거하고 4 % PFA 용액으로 반복한다. </li><li> 스티로폼 트레이에서 마우스를 고정 해제 뇌에 액세스하기 위해 목을 벨. </li><li> 집게와 가위를 사용하여 동물의 머리 주위 피부를 제거합니다. 바늘로 두개골의 뒤쪽 부분에 구멍을 찌를 조심스럽게 가위 해부 집게와 두개골을 제거합니다. </li><li> 뇌가 명확하게 접근하면, 소뇌를 제거하고 PBS에 배치하는 집게를 사용합니다. 메스와 시상면에서 소뇌를 양분하고 4 ℃에서 하룻밤 30 % 자당 용액에 전송할 수 있습니다. 참고 : 수험하기파라핀 섹션입니다 전에 조직 매립 및 단면에 4 % PFA 4 ° C에서 하룻밤 소뇌를 해결. </li></ol> 4. 조직 가공 및 단면 <ol><li> 드라이 아이스, 2- 메틸 부탄의 슬러리를 조제. 욕조의 온도가 5 분 동안 평형을 허용합니다. </li><li> 10월 화합물과 cryomold를 입력하고 금형에 이분 소뇌의 절반을 배치합니다. </li><li> 해부 현미경과 집게 위치의 쌍 (소뇌의 중간 선 부근) 이분 된면이 위를 향하도록 소뇌 사용. </li><li> OCT의 화합물은 조직 표본 주위 백색 고체 매트릭스를 형성 할 때까지 5 분 동안 드라이 아이스 슬러리에 cryomold 옮긴다. 주의 : 필요하다면 냉동 시험편 지금 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 라벨 세르 15 μm의 단면을 수집하기 위해 제조자의 지시에 따라 조직 절편을 수집하기위한 폴리 리신 슬라이드를 처리 및 저온 장치가 미리 준비찾. 섹션을 수집하려면, 조심스럽게 슬라이드의 폴리 라이신 코팅 된면이 OCT의 섹션을 문의하십시오. 섹션의 방향을 유지하기 위해,이 단계에서 슬라이드를 회전하지 않습니다. </li><li> 염색 및 이미징을 진행하기까지 -20 ° C에서 보관 조직 섹션. </li></ol> 5. 염색과 소뇌 섹션의 이미지 <ol><li> 조직 염색하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 : PBS의 ~ 50 ㎖ ~ PBS에서 4 % PFA의 5 ~ 10 ml의 ~ PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 10 % 당나귀 혈청의 10 ~ 20 ml의 </li><li> 해동 소뇌 부분. 중요한 것은, EGFP의 퇴색을 방지하기 위해 지속적이고 강렬한 빛의 소스에 노출을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 사각형을 그립니다. </li><li> 5 분 동안 4 % PFA와 섹션을 포스트 - 수정. 소수성 장벽 (보통 ~ 500 μL)로 구분 전체 영역을 커버하기에 충분한 액체를 사용합니다. 진공 또는 피펫을 다시 사용정착은 조직 절편을 방해하지 않도록 특히주의하면서 이동합니다. </li><li> 피펫으로 부드럽게 조직 섹션을 방해하지 않고 슬라이드에 PBS를 적용합니다. 5 분 후 조심스럽게 액체를 제거하기 위해 진공 또는 피펫을 사용합니다. PBS가 3 회 반복하여 총 린스. </li><li> 피펫을 사용하여 조심스럽게 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 10 % 당나귀 혈청 (솔루션의 9​​00 μL 당 3 μL Calbindin 및 / 또는 Nesprin2 항체) 적절한 일차 항체의 희석을 적용합니다. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 주 : EGFP-KASH2은 동결 절편에 직접 형광 현미경으로 볼 수 있으며이 항 EGFP 항체를 이용할 필요가 없다. 파라핀 섹션이 준비되어있는 경우, EGFP-KASH2의 영상은 반 EGFP 항체와 면역을 필요로한다. </li><li> 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 씻어. </li><li> 제조 1 : 0.5 % 트리톤 X-100-알렉사 형석 이차 항체 1,000 희석액,어둠 속에서 10 % 당나귀 PBS에서 혈청 및 저장. </li><li> 조심스럽게 최종 PBS 린스를 제거하고 어둠 속에서 한 시간 동안 차 항체 희석을 적용합니다. </li><li> 이차 항체 용액을 제거 씻어 절을 세 번 씻는다. 필요한 경우, 제 PBS의인가 등 DAPI (~ 300 ㎚) 등의 핵 염색을 적용한다. </li><li> 완전히 조직과 조직 섹션에 미디어를 장착 장소 ~ 5-7 μL 각국에서 PBS 용액을 제거합니다. 조직 절편 위에 유리 커버 슬립을 놓고 어둠 속에서 실온에서 ~ 15-30 분간 방치. </li><li> EGFP와 같이 5.8 / 5.9에서 사용 된 이차 항체에 적합한 임의의 다른 파장을 시각화하는 적절한 필터를 갖춘 형광 현미경을 사용한다. 소뇌 조각에서 EGFP-KASH2 핵 림을 보려면 20 배 목표를 사용합니다. </li></ol>

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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

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가장 중요한 단계는 성공적으로의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 모델이 적합 Cre 호텔 마우스 라인 (들)을 식별하는 것입니다 사용하여 생체 내에서 LINC 복합체의 역할을 연구합니다. Cre 호텔 유사한 경​​로에 관여하는 다른 세포 유형에서 활성 상태 인 경우 사실, 그것은 결과의 해석을 복잡하게 할 수 있습니다. 소뇌 (도 2B)의 분자량 및 과립 세포층 여기에 도시 된 바와 같이, 따라서, 이것은, 주변 셀을 검사하는 것이 중요하다. 마찬가지로, 임의의 생리 학적으로 관련된 표현형을 최대화하는 것이 관심의 세포 유형에 걸쳐 광범위 Cre 호텔 식 Cre 호텔 균주를 파악하는 것이 중요하다. 이는 관심의 시스템의 개발시 LINC 복합체 성분의 발현 패턴의 충분히 특성화를 수행하는 것도 중요하다. 실제로, (TG-LacZ를 CAG / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 한가지 단점은 일 Nesprins 단백질 또는 변이체는 생물학적 체계에 관여 할로 어떤 정...

핵 봉투 (NE)는 세포질에서 핵질을 분리한다. 그것은 핵 구멍에 연결하는 내부 및 외부 핵 막 (INM 각각 ONM)로 구성되어있다. 모두 멤브레인로 구분 루멘은 핵 주변 공간 (PNS)라고합니다. ONM 러프 소포체 (ER)의 연장이고, INM 핵 박판에 부착, A- 및 B 형으로 표현 핵-V 형 중간 필라멘트 그물 세공은 1,2 라민. Nucleoskeleton 및 세포 뼈대 (LINC) 복합체의 링커는 물리적 골격 필라멘트 및 분자 모터 (그림 1A)에 핵의 내부를 연결하는 전체 핵 봉투에 걸쳐 거대 분자 어셈블리입니다. 일 (SAD1 / Unc84) 단백질과 Nesprins (핵 봉투 SPectRINS) : 그들은 NE의 통합 횡단 단백질의 두 가족의 특성을 진화 적으로 보존 모티브 사이의 상호 작용으로 구성되어 있습니다. 포유 동물에서, Sun1 Sun2에 ARN 말단 영역 nucleoplasmic A- 및 B 형 라민 3-5와 직접 상호 작용 INM의 E 막 횡단 단백질. PNS 내 INM의 다른 측면에서, 썬 단백질은 150 C- 말단 아미노산이 태양 도메인이라고 ~의 진화 - 보존 스트레칭 항구. SUN 도메인은 진화 - 보존 KASH와 직접 상호 작용 (Klarsicht / ANC-1, 영신의 인사 상동) 도메인, Nesprins의 분자 서명. KASH 도메인은 막 횡단 도메인 (6) 다음에 PNS 내로 돌출 ~ 30 C 말단 아미노산 스트레치로 구성된다. 적어도 네 가지 Nesprin 유전자 (Nesprin1-4)는 NE 7에서 지역화 단백질을 KASH 함유 인코딩. 놀라운 1,000 kDa의 (Nesprin1 거인)에 크기가 달라질 ~ 50kDa (Nesprin4)에서 Nesprins의 세포질 영역은 여러 스펙 트린은 액틴, plectin 및 분자 모터 8과 같은 세포 골격의 구성 요소와 상호 작용을 가능하게 반복뿐만 아니라 특정 주제 포함 (13). &lt;척추 동물과 무척추 동물의 P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 연구 라민 / 일 / Nesprin / 분자 모터는 진화 적으로 보존 된 &quot;축&quot;핵 이동과 고정을 제어를 구성하는 것으로 나타났습니다. LINC 복잡한 구성 요소의 여러 녹아웃 (KO) 마우스 모델을 설명하고 포유류의 개발 9,14,15시 (NE)에서 태양과 Nesprin 단백질의 역할을 이해하는 프레임 워크를 제공하는 수단이되었다되고있다. 그러나, 이러한 모델 특히 현재 몇 가지 중요한 단점 :의 표현형 기여 구별 비 자치 효과, 2) 어려움을 세포에 의한 표현형 해석 1) 어려움 KASH없는 Nesprin 대 KASH이 함유, 3) 16 이소 폼 다양한 세포 유형의 NE에서 태양과 Nesprin 단백질의 기능 중복은 모두의 KASH 도메인에 대한 결핍 마우스 (17)의 모든 SUN-KASH 상호 작용과 마우스의 4) 주 산기 치사를 비활성화하는 복잡한 번식 체계를 필요Nesprins1 2는 성인의 분석 18 표현형을 배제한다. 이 프로토콜은 따라서 위에서 설명한 단점이 많은 우회, 셀 자율과 발달 규제 방식으로 생체 내에서 모든 Sun-KASH 상호 작용을 방해하기 위해 설계된 새로운 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이는 Cre 호텔 / LOX 계 마우스 모델은 두 개의 중요한 개념에 의존한다 : 1) 공지 Nesprin 단백질 KASH 도메인은 세포 배양 시스템에서 NE에 EGFP 타겟팅 및 2) 일 도메인이 과발현 따라서 KASH 도메인으로 이것은 무작위 상호 작용하기에 충분한 어떤 KASH 도메인은 모든 내생 일 도메인을 포화과 지배적 인 음성 방식 (17) (그림 1B)에 LINC 복합체를 비활성화합니다. 이 프로토콜은 조직 수확 및 소뇌 조롱박 세포의 모든 SUN-KASH 상호 작용의 중단을 확인하는 데 사용 처리 단계를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>접착 슬라이드</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin 항체</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 항체</td><td></td><td></td><td>이전에 설명된 Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting 미디어</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸 부탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 linc 단지를 방해

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

개발도상국과 성체 조직 내에서의 핵 이동과 정착은 핵골격 및 세포골격(LINC complexes)의 고리(LInkers)라고 불리는 큰 고분자 단백질 어셈블리에 크게 의존합니다. 이 단백질 골격은 핵막에 걸쳐 있으며 핵 내부를 주변 세포질 세포골격의 구성 요소와 연결합니다. LINC 복합체는 각각 SUN 도메인과 KASH 도메인이라고 하는 C-말단 분자 서명 모티프를 가진 두 개의 진화적으로 보존된 단백질 패밀리인 Sun 단백질과 Nesprins로 구성됩니다. 태양 단백질은 내부 핵막의 막관통 단백질로, N-말단 핵질 도메인은 핵 층과 상호 작용하고 C 말단 태양 도메인은 핵 주위 공간으로 돌출되어 Nesprins의 KASH 도메인과 상호 작용합니다. Canonical Nesprin isoforms는 세포질로 돌출되어 세포골격의 구성 요소와 상호 작용하는 다양한 크기의 N-terminus를 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 세포 유형 특이적 방식으로 내인성 SUN/KASH 상호 작용을 방해하는 우성-음성 형질전환 마우스 전략의 검증을 설명합니다. 우리의 접근 방식은 LINC 복합 불활성화의 생식계열 모델과 관련된 주산기 치사율 및 세포 비자율적 표현형과 같은 많은 단점을 우회하는 Cre/Lox 시스템을 기반으로 합니다. 이러한 이유로 이 모델은 다양한 조직에서 발달 및 항상성 중 LINC 복합체의 역할을 이해하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

이 프로토콜의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 생쥐를 사용 소뇌 조롱박 세포 EGFP-KASH2 발현을 제한 (TG-LacZ를 CAG / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 유용성을 도시한다. Tg가에서 (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 자손, LacZ를 / V5 오픈 리딩 프레임함으로써 특히 조롱박 세포 (그림 2A)를 대상으로 EGFP-KASH2의 발현을 유도하는 Cre 호텔 재조합 효소에 의해 P6에서 절제되어있다. 예상대로 핵 (그림 2B)의 주위에 관찰 EGFP 양성 림 같은 패턴에 의해 지시 된 바와 같이, EGFP-KASH2은 핵 봉투를 대상으로한다. 임의의 생리 학적 표현형을 극대화하기 위해서는 세포 - 특이 적 항체 마커와 공동 - 염색 KASH2 EGFP 양성 세포의 비율을 계산하여 그 EGFP-KASH2 타겟 세포의 과반수에 표현되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 이 예에서는 EGFP-KASH2 식 Calbindi...

핵막 단백질은 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중심적인 역할을 하며 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 LINC 복합체 파괴의 시공간 제어를 허용하는 새로운 Cre/Lox 기반 마우스 모델을 설명합니다.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

이 실험의 전반적인 목표는 형광 표지된 EGFP cache two 펩타이드의 유도성 및 표적 발현과 그로 인한 내인성 link complex의 파괴를 가능하게 하는 형질전환 마우스 모델의 유용성을 보여주는 것입니다. 본 실험에서는 형광 표지된 cache two의 발현을 소뇌의 Purkinje 세포로 표적화합니다. 이러한 유전적 접근 방식은 다양한 마우스 조직 내 핵 배치에서 link complex의 역할에 관한 핵심 질문들을 해결할 수 있습니다.E-G-F-P-K two의 유도성 및 표적 발현은 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, 기존의 모든 cruise 계통 마우스와 단 한 번의 교배 계획만으로 가능합니다. 둘째, 이 접근 방식은 link 복합체 구성 요소의 생식세포 돌연변이 마우스 모델에서 관찰되는 주생기 치사율을 피할 수 있습니다.마지막으로, 이 방법은 특정 세포 또는 조직 내에서 연결 복합체의 생리학을 연구하는 것을 가능하게 합니다. In vivo 실험을 통해, 연구실 구성원인 Chloe Potter가 소뇌의 Purkinje 세포에서 E-G-F-P-K2를 시각화하는 데 필요한 단계별 과정을 보여줄 것입니다.이전 문헌에 기술된 바와 같이, PCP two CRE 마우스와 clac Z 마우스를 교배하여 PCP two CAG C two 마우스를 생성합니다. 태어난 새끼 마우스들을 대상으로 유전형 분석을 수행합니다. 이전 기술 방식에 따라 EGFP와 Cree 트랜스진을 모두 보유한 개체를 식별하기 위해, PBS에 30% sucrose 용액 50 milliliters를 제조하여 조직 채취일 전까지 -20 °C에서 보관합니다. 적절한 연령에 도달하면 서면 프로토콜에 기술된 대로 마취 하에 마우스의 경심장 관류를 실시하여 뇌 조직 해부를 준비합니다. 해부한 뇌를 10 milliliters의 PBS가 담긴 10 centimeter 조직 배양 플레이트에 넣고 소뇌와 대뇌를 분리합니다.다음으로, 메스를 사용하여 소뇌를 시상면으로 절개하고, 절편을 30% sucrose 용액으로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 드라이아이스와 2-methyl butane으로 슬러리를 준비합니다. 배스의 온도가 평형을 이룰 때까지 5분 동안 기다리십시오.다음으로, 크라이오 몰드에 OCT 화합물을 채우고 해부 현미경과 핀셋을 사용하여 절개된 소뇌의 절반을 몰드에 넣습니다. 소뇌의 정중선에 가까운 절개면이 몰드 상단을 향하도록 소뇌를 배치합니다. 그런 다음 OCT 화합물이 조직 표본 주변에서 단단한 흰색 매트릭스를 형성할 때까지 크라이오 몰드를 건조한 아이 슬러리에 5분 동안 둡니다.포매된 시료를 필요할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오. 조직 절편 수집을 위해 전처리된 polylysine 슬라이드에 라벨을 붙이고, 신선한 OCT를 사용하여 조직 홀더에 소뇌 조직 블록을 장착하십시오. 블록이 단단히 고정되면 조직 홀더를 장착하고, 조직이 나타날 때까지 40 µm 두께로 슬라이스를 깎아 과도한 OCT를 제거하십시오.두께를 15 micrometers로 설정하고, OCT 절편을 슬라이드의 polylysine 코팅된 면에 조심스럽게 접촉시켜 절편을 수집합니다. 염색 및 이미징을 진행하기 전까지 조직 절편을 -20 °C에서 보관하십시오. 계속 진행할 준비가 되면, 형광 단백질의 퇴색을 방지하기 위해 소뇌 절편을 암소에서 해동하십시오.소수성 배리어 펜을 사용하여 조직 절편의 주변을 따라 직사각형을 그립니다. 조직을 추가 고정하기 위해 약 500 µL의 4% paraform aldehyde를 절편에 넣고 5분 동안 둡니다. 그 후, 피펫으로 조직 절편을 건드리지 않도록 각별히 주의하며 진공 흡입기로 고정액을 제거합니다.조직 절편이 손상되지 않도록 슬라이드에 PBS를 조심스럽게 도포하십시오. 5분 후, 진공 마이크로 피펫을 사용하여 액체를 주의 깊게 제거하고, PBS 세척 과정을 총 3회 반복합니다. 다음으로, 슬라이드에 블로킹 용액 약 500 µL를 첨가하고 10분 동안 배양하십시오.블로킹 솔루션을 제거한 후, cal 결합 또는 nesin 2 항체를 1:300으로 희석하여 포함시킨 동일한 솔루션으로 교체합니다. 그 다음 항체 솔루션을 제거하고 PBS로 슬라이드를 3회 헹굽니다. 슬라이드를 암실 상태의 상온에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 블로킹 용액을 사용하여 cow 결합 표지 슬라이드용 anti-US Alexa Fluor 594와 Nesprin 2 표지 슬라이드용 anti-Alexa Fluor 594를 1:1000으로 희석하여 준비하고, 사용할 때까지 이 용액들을 암실에 보관합니다. 마지막 PBS 세척액을 조심스럽게 제거하고, 희석된 2차 항체로 절편을 덮어 암실에서 1시간 동안 반응시킵니다. 배양 후, 2차 항체 용액을 제거합니다.그 다음, PBS에 희석한 300 nanomolar 농도의 DPI와 같은 핵 염색약을 5분 동안 처리합니다. 이후, 절편을 PBS로 두 번 더 헹굽니다. PBS 용액을 최대한 제거하고 조직 절편 위에 마운팅 매질(mounting medium) 한 방울을 떨어뜨려 덮습니다.기포가 생기지 않도록 조직 절편 위에 유리 커버 슬립을 덮고, 실온의 암소에서 15~30분 동안 그대로 둡니다. 그 후 형광 현미경을 사용하여 항체 염색과 형광 단백질을 시각화합니다. 소뇌 절편의 경우, 20배 또는 40배 대물렌즈를 사용하십시오.여기에 표시된 것과 같이 E-G-F-P-C two nuclear rim을 관찰하려면, Fitzy 채널에서 소뇌 절편 내의 E-G-F-P-C two를 직접 시각화할 수 있습니다. 또한, 퍼킨 세포(Perkin cells)를 특이적으로 표지하는 cow binding과 EGFP의 공국소화(colocalization)를 통해, E-G-F-P-C two의 발현이 퍼킨 세포 내의 퍼킨 세포로 국한됨을 확인할 수 있습니다. 핵 주변에서 관찰되는 EGFP 양성 RIM 유사 패턴은 EGFP cache two가 핵막으로 표적됨을 나타냅니다.본 예시에서는 cow 결합 양성 Perkin 세포의 70% 이상에서 EGFP cache two 발현이 검출되었습니다. EGFP cache two는 가용한 sun 도메인을 포화시켜 핵막에서 내인성 nesprin을 대체합니다. 이에 따라, EGFP cache two를 발현하는 Perkin 세포의 핵막에서 내인성 NESIN two가 대체됩니다.E-GFP-Nesin 2를 발현하지 않는 Perkin 세포는 예상된 대조군과 같이 핵막에 내인성 nesin 2를 유지하는 반면, CRE 재조합효소를 발현하지 않는 세포는 전체 bikini 세포 집단 1의 핵막에서 NESIN 2를 나타냅니다. 따라서 조직의 CT 블록을 사용할 수 있습니다. E-GFP-K 2는 약 4시간 후에 시각화할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, PFF 고정 정도나 포매 조건이 에피토프의 항원성에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 특정 에피토프를 보존할 수 있는 최적의 고정 조건을 결정하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 CK two 형질전환 마우스 모델을 사용하여 특정 조직에 VGFP cashew의 발현을 표적화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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이 비디오는 마우스 모델에서 타목시펜의 복강 내 주입 후 타목시펜 유도 Cre-recombinase 시스템을 사용하여 표적 유전자 녹아웃을 수행하는 절차를 설명합니다.

CreER-LoxP 시스템 기반 표적 유전자 불활성화: 마우스 모델에서 표적 유전자 녹아웃을 위한 타목시펜 유도성 Cre 재조합효소 시스템

이 비디오는 2점 Lysophosphatidylcholine(LPC) 주입을 사용하여 국소 탈수초화 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 마취된 쥐의 두개골이 노출되어 있습니다. 주입 좌표가 결정되고 대상 부위에서 LPC 주입이 가능하도록 구멍을 뚫습니다. LPC는 염증을 통해 뉴런의 국소 탈수초화를 유도하며, 2점 주입은 지속가능성을 보장합니다.

리소포스파티딜콜린의 2점 주입을 통한 국소 탈수초화 마우스 모델 구축

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수...

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

이 프로토콜은 마우스 난관에서 국소적으로 제한된 CRISPR 매개 게놈 편집을 위한 미세주입 및 생체 내 전기천공을 설명합니다.

생체 내 미세주입 및 전기천공을 사용한 체세포 게놈 공학 마우스 모델

학습하세요 LINC 단지를 방해하는 형광 표지된 EGFP 캐시 투 펩타이드를 유도적으로 발현시키는 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하는 방법을. 이 기법은 핵 위치 설정 연구에 활용됩니다.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

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