마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

이 실험의 전반적인 목표는 형광 표지된 EGFP 캐시, 생체 내 2개의 펩타이드의 유도 가능하고 표적화된 발현을 가능하게 하고 그에 따른 내인성 링크 복합체의 파괴를 가능하게 하는 형질전환 마우스 모델의 유용성을 설명하는 것입니다. 이 실험에서 형광 표지된 캐시 2의 발현은 소뇌 Perkin 세포를 표적으로 합니다. 이 유전적 접근법은 대부분의 서로 다른 조직 내에서 핵 포지셔닝에서 연결 복합체의 역할에 대한 핵심 질문을 해결할 수 있습니다.

E-G-F-P-K 2의 유도 가능하고 표적화된 발현에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 기존 크루즈 균주를 가진 암초 마우스의 단일 번식 계획이 필요합니다. 둘째, 이 접근법은 연결 복합 구성 요소의 생식세포 돌연변이의 마우스 모델에서 관찰되는 주산기 ality를 우회합니다.

마지막으로, 이 방법을 사용하면 특정 세포 또는 조직 내에서 연결 복합체의 생리학을 연구할 수 있습니다. 생체 내에서. 연구실 멤버인 클로이 포터(Chloe Potter)가 소뇌 버킨 G 세포에서 E-G-F-P-K 2개를 시각화하는 데 필요한 다양한 단계를 보여줄 것입니다.

먼저 clac Z 마우스를 PCP 2 CRE 마우스와 번식시켜 이전 간행물에서 설명한 바와 같이 PCP 2 CAG C 마우스 2 개를 생산합니다. 결과 새끼가 태어나면 유전형 분석을 수행합니다. 앞서 설명한 바와 같이 EGFP와 Cree 전이유전자를 모두 보유하고 있는 사람들을 식별하기 위해, PBS에서 50ml의 30% 자당 용액을 준비하고 적절한 연령에서 조직 수확일까지 섭씨 영하 20도에서 보관하고, 서면 프로토콜에 설명된 대로 해부를 위해 뇌 조직을 준비하기 위해 마취 하에 마우스의 트랜스 심장 관류를 수행합니다. 절개된 뇌를 10cm 조직 배양 플레이트에 10mL의 PBS가 있는 넣고 소뇌와 소뇌를 분리합니다.

다음으로, 메스를 사용하여 시상면의 소뇌를 절개하고 절편을 30% 자당 용액으로 옮겨 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관합니다. 드라이 아이스 슬러리와 두 개의 메틸 부탄을 준비합니다. 수조의 온도를 5분 동안 평형을 이룹니다.

다음으로, 냉동 주형에 OCT 화합물을 채우고 해부 현미경과 한 쌍의 집게를 사용하여 절개된 소뇌의 절반을 주형에 넣습니다. 소뇌의 정중선 근처에 있는 이중 절개 표면이 금형에서 위를 향하도록 소뇌를 배치합니다. 그런 다음 OCT 화합물이 조직 표본 주위에 단단한 흰색 매트릭스를 형성할 때까지 5분 동안 극저온 주형을 안구 건조 슬러리로 옮깁니다.

필요할 때까지 내장된 표본을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 조직 절편을 수집하기 위해 전처리된 폴리리신 슬라이드에 라벨을 붙이고 새로운 OCT로 조직 홀더에 소뇌 조직 블록을 장착합니다. 블록이 단단히 부착되면 티슈 홀더를 장착하고 티슈가 닿을 때까지 40마이크로미터 슬라이스를 면도하여 여분의 OCT를 제거합니다.

두께를 15마이크로미터로 설정하고 슬라이드의 폴리리신 코팅면과 OCT 섹션을 조심스럽게 접촉하여 섹션을 수집합니다. 염색 및 이미징을 진행할 때까지 조직 절편을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 계속할 준비가 되면 형광 단백질의 퇴색을 방지하기 위해 어두운 곳에서 소뇌 부분을 해동합니다.

소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 단면의 둘레에 직사각형을 그립니다. 약 500마이크로리터의 4% 파라폼 알데히드를 5분 동안 절편에 첨가하여 조직을 후첨가합니다. 그런 다음 진공 청소기를 사용하여 고정제를 흡인하고 피펫으로 조직 부분을 방해하지 않도록 특히 주의하십시오.

조직 부분을 방해하지 않고 슬라이드에 PBS를 부드럽게 바릅니다. 5 분 후, 진공 청소기 더 피펫을 사용하여 액체를 조심스럽게 제거하고 PBS 헹굼을 총 3 번 반복합니다. 다음으로, 슬라이드에 약 500마이크로리터의 차단 용액을 추가하고 10분 동안 배양합니다.

차단 용액을 제거한 다음 cal binding 또는 nesin 2 항체의 1-300 희석액을 포함하는 동일한 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 항체 용액을 제거하고 PB S3로 슬라이드를 헹굽니다. 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다.

다음으로, 암소 바인딩 라벨이 붙은 슬라이드에 대해 anti-US Alexa floor 5 94의 1000 희석액을 준비하고 차단 용액에 Nesprin 두 개의 라벨이 붙은 슬라이드에 대해 anti Alexa Fluor 5 94를 준비하고 필요할 때까지 용액을 어두운 곳에 보관합니다. 최종 PBS 헹굼을 부드럽게 제거하고 어두운 곳에서 1시간 동안 희석된 2차 항체로 절편을 덮습니다. 배양 후 2차 항체 용액을 제거합니다.

그런 다음 PBS에서 300나노몰의 DPI와 같은 핵 염색제를 5분 동안 적용합니다. 그런 다음 PBS에서 섹션을 두 번 더 헹굽니다. 가능한 한 많은 PBS 용액을 제거하고 장착 매체 한 방울로 조직 섹션을 덮습니다.

기포를 피하고 티슈 섹션 위에 유리 커버 슬립을 놓고 어두운 곳에서 실온에서 15-30분 동안 보관합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 항체 염색 및 형광 단백질을 시각화합니다. 소뇌 절편의 경우 20 x 또는 40 x 대물렌즈를 사용합니다.

여기에 표시된 것처럼 E-G-F-P-C 두 개의 핵 테두리를 보려면 E-G-F-P-C 2를 Fitzy 채널의 소뇌 슬라이스에서 직접 시각화할 수 있습니다. 또한, Perkin 세포를 특이적으로 표지하는 EGFP와 암소 결합의 공동 국소화는 E-G-F-P-C 2 발현이 Perkin 세포 내의 perkin 세포에 국한되어 있음을 확인합니다. EGFP 캐시 2는 핵 주변에서 관찰되는 패턴과 같은 EGFP positive RIM으로 표시된 핵 외막을 대상으로 합니다.

이 예에서 EGFP 캐시 2 발현은 암소 결합 양성 Perkin 세포의 70% 이상에서 검출되었습니다. EGFP 캐시 2는 사용 가능한 태양 영역의 포화를 통해 핵막에서 내인성 nesprin을 치환합니다. 따라서, 내인성 NESIN 2는 EGFP 캐시 2를 발현하는 Perkin 세포의 핵막에서 변위됩니다.

E-G-F-P-C 2를 발현하지 않는 Perkin 세포는 예상대로 핵 외피에서 내인성 nesin 2를 유지하지만 CRE 재조합 효소를 발현하지 않는 제어 interate는 전체 비키니 세포 집단 1의 핵 외피에서 NESIN 2를 표시합니다. 따라서 조직의 CT 블록을 사용할 수 있습니다. E-G-F-P-K 2는 약 4시간 만에 시각화할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 PFF 고정 정도 및/또는 포식 조건이 항원결정기의 항원성에 큰 영향을 미칠 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 특정 항원결정기를 보존할 수 있는 최적의 고정 조건을 결정하는 것이 매우 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CK two 형질전환 마우스 모델을 사용하여 특정 조직에 대한 VGFP 캐슈의 발현을 표적으로 하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.