금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 금 나노막대를 포함하는 세포 운반체를 혁신적인 전략으로 사용하여 플라즈몬 입자를 종양에 전달하는 것입니다. 당사의 프로토콜은 외인성 조영제를 사용하여 암을 이미지화하고 치료하기 위한 광음향 및 광열 접근법 개발에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 종양 관련 마이크로파지의 영양성(tropism)에 의존하여 플라즈몬 입자를 종양에 전달합니다.

아이디어는 이러한 세포를 환자로부터 분리하고 체외에서 플라즈몬 입자를 주입한 다음 에스트로겐 숙주로 사용할 의도로 숙주에 다시 주입하는 것입니다. 이 접근 방식의 장점 중 하나는 입자의 생물학적 계면이 시험관에서 완전히 구성되기 때문에 입자의 광학 및 생화학적 안정성에 대한 더 많은 제어를 얻을 수 있다는 것입니다. 먼저 두 번의 원심분리를 사용하여 450마이크로몰의 금 농도에서 6밀리리터의 세트리모늄 캡 금 나노막대를 정제한 다음 500마이크로몰 수성 세트리모늄 브로마이드에서 디캔팅 및 세척합니다.

그런 다음 세트리모늄 브로마이드와 폴리소르베이트 20이 포함된 1.5밀리리터의 100밀리몰 아세테이트 완충액을 금 입자 펠릿이 들어 있는 용기에 추가합니다. 그런 다음 7.5마이크로리터의 10밀리몰라 알파-메톡시-오메가-메르캅토 폴리에틸렌 글리콜을 물에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 반응하도록 둡니다. 다음으로, 디메틸 설폭사이드에 7.5마이크로리터의 100밀리몰 메르캅툰데실 트리메틸 암모늄 브로마이드를 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 반응을 그대로 두십시오. 24 시간 후 4.5 밀리리터의 0.005 % 폴리 소르 베이트 20을 물에 넣으십시오. 이제이 순한 폴리 소르 베이트 20 용액을 사용하여 원심 분리 및 경사 분리의 4 사이클을 사용하여 입자를 정제하십시오.

마지막으로, 입자를 600마이크로리터의 멸균 인산염 완충 식염수로 옮깁니다. 금의 공칭 농도는 이제 4.5 밀리몰이 되어야 합니다. 세포를 준비하기 위해 Dulbecco의 Modified Eagle 배지를 보충한 50만 개의 단핵구 대식세포를 60mm 접시 2개에 플레이트하고 24시간 동안 성장시킵니다.

24시간 후, 세포 배지를 각 페트리 접시에 100마이크로몰 금과 용액의 최종 농도를 위해 준비된 양이온 금 나노로드를 보충한 새로운 배지로 교체합니다. 그런 다음 다시 24시간 동안 배양을 계속합니다. 다음 날, 현미경으로 세포를 확인하십시오.

그들은 정상적인 형태와 많은 어두운 세포 내 소포를 가져야 합니다. 세포가 좋아 보이면 새 배지로 씻고 스크레이퍼를 사용하여 분리한 다음 두 접시의 세포를 병합하여 하나의 컬렉션에 최소 200만 개의 세포를 갖습니다. 이제 120G에서 6분 동안 컬렉션을 원심분리하여 과도한 양이온성 금 나노막대를 제거합니다.

슈퍼네이트를 버립니다. 세포 알갱이는 거의 검은색으로 보여야 합니다. 펠릿을 2밀리리터의 인산염 완충 식염수에 현탁시키고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.

그런 다음 200만 개의 세포가 포함된 현탁액을 혼합하고 6분 동안 120Gs로 스핀다운합니다. 펠릿을 3.6% 포름알데히드와 인산염 완충 식염수 2ml에 넣고 실온에서 10분 동안 세포를 고정시킵니다. 마지막으로, 인산염 완충 식염수 세척 3회를 사용하여 정착액을 제거합니다.

이 절차를 시작하기 하루 전에 500마이크로리터의 산성화된 3% 중량별 저분자량 키토산 용액을 준비합니다. 아세트산을 첨가하여 pH 4.5를 달성합니다. 용액을 완전히 혼합하려면 섭씨 40도에서 24시간 동안 균질화하십시오.

다음날, 금 나노 막대로 제조 한 쥐 대식 세포를 500 마이크로 리터의 키토산 용액과 혼합합니다. 50미크론 두께의 팬텀을 얻으려면 250mg의 혼합물을 1.9제곱센티미터 폴리스티렌 몰드에 로드합니다. 샘플을 후드 아래에 24시간 동안 그대로 두십시오.

다음날, 가교를 유도하기 위해 500마이크로리터의 1몰 수산화나트륨 수용액으로 샘플을 처리하고 10ml의 초순수로 헹굽니다. 광학 파라메트릭 발진기, 광학 플루언스를 조정하기 위한 감쇠기 및 초음파 변환기를 특징으로 하는 맞춤형 광음향 현미경을 사용하여 광음향 변환의 안정성을 분석합니다. 먼저 대식세포가 포함된 키토산 필름을 물탱크에 담근 플라스틱 홀더를 사용하여 탈이온수에 매달아 놓습니다.

샘플을 손상시키지 않고 충분한 신호 대 잡음비로 광음향 방출을 전달하는 프로브 플루언스를 결정합니다. 시험 플루언스 및 획득 매개변수를 설정합니다. 레이저의 각 펄스에 대해 초음파 변환기에서 해당 광음향 신호를 획득합니다.

각 펄스에 대한 레이저 플루언스에 대한 광음향 강도의 비율을 계산합니다. 펄스 수의 함수로 추세를 분석하고 시간 경과에 따른 안정성을 확인합니다. 불안정성의 경우 더 낮은 시행 플루언스로 이 측정을 반복합니다.

안정성의 경우, 시험 플루언스는 광음향 방출이 적절한 신호 대 잡음비를 나타내는 경우 프로브 플루언스로 사용될 수 있습니다. 다음으로, 재형성 임계값 플루언스를 측정합니다. 샘플의 임의의 지점을 선택하고, 프로브 플루언스에서 레이저를 설정하고, 500 펄스에 걸쳐 평균 광음향 강도 A를 측정합니다.

그런 다음 프로브 플루언스 위로 공칭 플루언스를 증가시키고 50개의 펄스를 전달합니다. 평균 플루언스의 이름을 F 여기(F excitation)로 지정합니다. 프로브 플루언스에서 레이저를 재설정하고 500 펄스 이상의 평균 광음향 강도 B를 취하여 측정을 반복합니다.

이제 B와 A의 비율 R을 계산합니다.단위 미만의 R 값은 샘플의 광학 특성에 돌이킬 수 없는 변화가 발생했음을 나타냅니다. 다음으로, 마이크로미터 스테이지를 사용하여 필름을 이동하여 샘플의 측정 지점을 무작위로 변경합니다. 그런 다음, F excitation의 다른 값에 대해 R의 측정을 반복하여 단위 주위와 아래의 R 값을 몇 개 취합니다.

약 15 R 포인트는 합리적인 데이터 모음입니다. 그런 다음, R을 F 가진(excitation)의 함수로 플로팅하고, R이 불확실성 없이 단일성에서 벗어날 때 재형성 임계값을 해당 플루언스로 식별합니다. 일반적으로 양이온성 금 나노막대는 정상적인 형태를 유지하는 대식세포에 대량으로 축적됩니다.

입자는 단단한 내포성 소포 내에 국한되어 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 과정의 후반부에서, 키토산 하이드로겔에 포함된 것은 세포 형태에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. 세포는 현미경 사진으로 볼 수 있듯이 샘플 전체에 잘 분산되어 있습니다.

세포가 없는 금 나노막대를 포함하는 키토산 필름의 제어는 균질합니다. 금 나노막대의 플라즈몬 띠는 세포 매개체에 보존되어 있습니다. 플라즈몬 커플링 또는 크기와 모양이 다른 입자의 다른 흡수와 같은 효과는 이러한 프로토콜에서 실질적인 역할을 하지 않았습니다.

데이터를 수집한 후 F 가진의 함수로 R의 추세를 통해 F 임계값을 결정하는 데 필요한 데이터 및 분석에 대한 아이디어를 얻을 수 있습니다. 여기서 F 임계값은 제곱센티미터당 약 11밀리줄인 것으로 나타났습니다. 광음향 측정은 500 펄스에 대해 20 이상의 신호 대 잡음비로 매우 정확했습니다.

우리의 프로토콜은 입자 설계 및 광안정성 조사에 대한 기존 방법과 관련하여 혁신적입니다. 4차 암모늄 양이온을 사용한 pegylated gold nanorods의 변형은 콜로이드 안정성을 유지하면서 높은 세포 흡수 효율을 제공합니다. reshaping threshold의 정의에 의한 photoacoustic conversion의 안정성 측정은 정량적이고 재현 가능합니다.

이러한 입자는 광음향 이미징을 위한 조영제로 사용되기 때문에 광음향 프로브는 이러한 기능적 특징을 테스트하는 데 이상적입니다. 플라즈몬 입자의 세포 운반체는 광음향 이미징을 위한 조영제로 볼 수 있습니다. 그들의 광안정성은 자유 플라즈몬 입자의 광안정성과 동일합니다.

현재 연구의 초점은 이러한 세포의 생리학에 중점을 두고 있으며, 세포의 viablility 및 chemotactic 활성에 특별한 주의를 기울이고 있습니다.