Name: 정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 정량 실시간 PCR을 사용하여 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이를 평가하는 방법을. 종양 특이적 mRNA를 검출하여 전이 수준을 정량적으로 분석하는 이 기술은 암 연구에 필수적인 도구입니다.

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예치 연구소는 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 (IRG-97-219-14) 국방부의 교부로부터 연구 자금으로, MUSC에서 홀 링스 암 센터 수여 (W81XWH-11-2-에서 연구 자금 지원됩니다 0229) MUSC에서, 그리고 우려 (ESY에) 재단의 수상으로.

이 프로토콜은 가이드 라인과 사우스 캐롤라이나 (MUSC)과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 동물 보호 기준을 따른다. 1. 폐 해부 <ol><li> 유방 종양 절제술 (선택 연구 목표 및 기본 종양 분석 또는 꼬리 정맥 주입이 수행 여부에 따라). <ol><li> IACUC 대학 규정에 따라 이소 플루 란 마취의 치사량을 사용하여 마우스를 안락사. 수술 전위에 의해 euthanization을 확인합니다. </li><li> 폼 보드, 사지 확산의 뒷면에 마우스를 배치하여 해부 핀과 핀. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여, 중심에서 동물의 하부를 파악. </li><li> 가위를 사용하여, 마우스의 복강을 관통하지 않도록주의, 피부를 통해 목으로 상승 했네요. </li><li> 종양 조직을 나타 내기 위해 사지에 피부를 다시 잘라. </li><li> 종양 조직과 홍보를 해부하다추가 분석을 위해 (안이 프로토콜에 자세히 설명) 등의 동결 또는 고정으로, 선호하는 방법으로 eserve. </li></ol></li><li> 폐 조직의 해부. <ol><li> 전술 한 바와 같이, 종양 조직을 수확하는 경우, 과잉의 피부 아래에 핀. </li><li> 집게를 사용하여, 동물의 하단부를 잡고 복막 목의 기부를 향해 위쪽으로 절단 시작한다. </li><li> 조심스럽게 흉강에 출혈 수있는 혈관을 절단되지 않도록주의하면서 흉곽의 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 왼쪽과 오른쪽 흉곽의 횡격막과 상부를 절단하여 리브 뼈를 제거합니다. </li><li> 집게를 사용하여 마우스의기도를 잡고 앞으로 잡아 당깁니다. </li><li> 해부 가위로 기관을 절단 및 마우스에서 폐를 제거합니다. 참고 : 핵심은 폐에 부착 남아있을 수 있습니다. 이 경우, 신중하게 다섯 로브를 수집주의하면서 폐에서 멀리 마음을 해부하다 (그림 1 참조 </stroNG&gt;). </li><li> 여분의 혈액을 제거하는 PBS로 부드럽게 씻는다. </li></ol></li><li> 폐 조직의 총 평가. <ol><li> 옵션 1 : 생체 내 이미징. <ol><li> 루시 페라 이미징 ~ 10 분 전에 이미지로, 동물에게 복강 내 (IP) 주사 루시페린의 150 ㎎ / ㎏ 용량을 제공합니다. 마취 된 동물 또는 절개 (그림 2) 5 후 제거시 생체 내에서 이미지 폐. </li></ol></li><li> 옵션 2 : 총 평가. <ol><li> 종양 결절을 시각화 스테레오 현미경으로 폐를 검사합니다. 주 : 세포 표지 GFP 경우 GFP를 검출 (510분의 470 nm의 근처 예) 적절한 여기 / 발광 최대치와 광 큐브를 함유 형광 가능한 실체 처리에 앞서 형광 대해 입체적 폐를 조사하는데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 폐 즉시 분석 할 경우, &#39;RNA 분리&#39;부분을 진행합니다. 그렇지 않으면, 액체 비누를 사용하여 동결 조직 스냅ID 질소 나 드라이 아이스. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. RNA 분리 참고 : 대표 분석을 위해, RNA는 RNA 분리 키트 (자료 목록을 참조)를 사용하여 분리 하였다. 현재의 분석은 하나의 특정 제조 업체의 제품을 사용하는 동안, 분리 키트의 다양한 여러 유명 업체에서 사용할 수 있습니다. 또한, 비 기반 키트 원심 분리 방법이 또한 옵션이다. cDNA를 또한 표준 곡선 분석을위한 세포주 또는 플라스미드로, 양성 대조군 샘플로부터 RNA를 제조한다. 또한, 프라이머 프로브 세트에 대한 특정 양의 제어가 구입하실 수 있습니다 (자료 목록 참조). <ol><li> 이전에 냉동 조직을 사용하는 경우, 드라이 아이스에 냉동 조직을 수집합니다. </li><li> 같은 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화 : 박격포와 유 봉 액체 질소에 조직을 동결 한 후 드라이 아이스를 통해 손에 의해 수행 연삭; 조직 균질 또는 기계적 분리 장치제조업체의 제안에 따라; 초음파, 또는 다른 선호하는 방법. 참고 : 대표 분석을 위해, 균질화 선호하는 방법은 초음파이다. <ol><li> 도 3에 제시된 분석의 비율로 용해 (RNA 분리 키트로 제공) 버퍼 및 2- 메르 캅토 에탄올을 제조 20 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 용해 버퍼마다 1 ml의 용. 재현 탁 조직 300 ㎕의 용해 완충액 30 % 진폭으로 설정 초음파기 10 초 동안 초음파 처리하고 조직의 각 30g을 위해 2- 머 캅토 에탄올이 보충. </li><li> 분쇄 한 후 300 μL 용해 버퍼에 재현 탁 지상 조직, 박격포와 유 봉을 사용하는 경우. </li></ol></li><li> 590 μL TE 버퍼 (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 10 μL의 단백질 분해 효소 K를 추가합니다. 조직의 (즉, 매 30 mg을 위해) 각 300 μL에 600 μL의 단백질 분해 효소 K 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 참고 : 소화 시간이 다를 수 있습니다. </li><li> ≥1 원심 분리기 샘플10 분 3,000 g의 이물질을 제거합니다. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> RNA를 침전 상층 액의 모든 900 μL, 450 μL 에탄올 (96 % -100 %)를 추가합니다. </li><li> 컬럼에 해물 / 에탄올 혼합 700 μl를 전송합니다. </li><li> 1 분 ≥13,000 G에서 원심 분리기 샘플은 열에 RNA를 결합합니다. </li><li> 액체 폐기물을 버리고 컬럼에 남아있는 상층 액을 추가하고 다시 스핀. </li><li> 모든 해물이 칼럼을 통해 방사되면 30 초 동안 ≥13,000 g에서 원심 분리 컬럼 샘플의 상부에 세척 완충제 (1)의 350 μL를 추가한다. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> 내가 10 배의 DNase의 5 μL 및 샘플 당 DNase를 /의 RNase없는 물 40 μL (50 μL / 샘플의 총 부피)와 효소의 DNase의 5 단위를 혼합하여 DNase의를 준비합니다. </li><li> DNase의 50 μL 각 열을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어 추가합니다. </li><li> 열 및 원심 분리기 샘 워시 버퍼 1의 350 μl를 추가PLES 30 초 동안 ≥13,000 G에서. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> 컬럼에 워시 버퍼 2의 600 μl를 추가하고 ≥13,000 g에서 30 초 스핀. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> ≥13,000 g에서 2 분 동안 250 워시 버퍼 2 μL와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 새 컬렉션 튜브에 열의 일부를 넣고 오래 수집 튜브를 폐기합니다. </li><li> 컬럼의 RNase / DNase를 무료로 물을 50 ~ 100 μl를 추가하고 1 분 동안 품어. </li><li> ≥13,000 g에서 1 분간 스핀. </li><li> 다시 실행 RNA 수율을 높이기 위해 칼럼을 통해 수집 된 용출액을. </li><li> 즉시 사용, 얼음에 샘플을 유지하고 정량를 진행합니다. 나중에 사용하기 위해, 드라이 아이스, 액체 질소에 동결 스냅. -80 ° C의 냉동고에서 보관이 필요할 때까지. </li></ol> 3. 첫 번째 가닥 합성 주 : 대표적인 분석을 위해, 역전사 효소 (RT) 반응을 수행 하였다 F(자료 목록 참조) QRT-PCR을 위해 설계 IRST 가닥 cDNA 합성 키트. <ol><li> 샘플은 이전에 수집 된 경우, 얼음에 튜브를 해동. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 측정한다. </li><li> 전체 RNA의 0.5 μg의 사용, cDNA의 주식을 생성하는 역전사 효소를 사용하여 첫 번째 가닥 합성을 수행합니다. <ol><li> 멸균 된 RNase / DNase의 프리 PCR 튜브 / 플레이트에서, 반응 혼합물 (표 1)을 제조 하였다. 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 표준 PCR 기계 (표 2) 프로그램. </li></ol></li><li> 멸균 뉴 클레아없는 물을 사용하여 원하는 볼륨 (일반적으로 50 ~ 100 μL)에 완성 된 반응을 희석. </li></ol> 4. 실시간 PCR 주 : 대표적인 분석을 위해, SYBR 그린을 이용 하였다. 그러나, 임의의 바람직한 방법은 사용자의 결정에 치환 될 수있다. <ol><li> 양성 대조군의 cDNA를 사용하여 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정합니다. <ol><li> 분석 내가 보여 위해N 그림 3은, 양성 대조군의 cDNA를 추천 제조업체를 사용하여 인간의 HER2에 대한 표준 곡선을 준비 (자료 목록 참조). 마우스 GAPDH에 대해, 표준 곡선을 생성하는 음성 대조군 폐의 cDNA를 사용한다. 5 기준을 생성하는 4 : 각 프로브에 대해, 직렬의 cDNA 1 희석. </li></ol></li><li> 표준 곡선 및 실험 샘플을 포함해야 총 샘플들의 수를 계산한다. 참고 : 분석은 여기에 설명 된 내용은 샘플 당 2-3 실험 복제를 분석 하였다. 표준 곡선 분석은 최종 정규화 양을 계산하는 샘플 당 상대적 HER2의 양 및 GAPDH를 결정하도록 적용될 수있는 단순 회귀 분석 모델을 생성하기 위해 수행 하였다. 이 분석은 또한 프라이머 효율이 손의 분석에 적합한 지 확인합니다. </li><li> 멸균 된 RNase / DNase의 무료 관에서, 마스터 믹스 (표 3)를 준비합니다. <ol><li> 마스터 믹스 amoun을 계산샘플 당 T. 하나 이상의 샘플까지 확장 할 수 있습니다. 관심있는 각각의 실험 유전자뿐만 아니라, GAPDH 등의 내부 제어를 위해 마스터 믹스를 사용한다. 200 nm의 최종 농도 GAPDH에 대한 프라이머를 사용합니다. 참고 : 인간 및 마우스 세포의 기원을 구별 할 때 내부 통제에 특히 유용하다. 주 : HER2 프라이머 농도는 최적화 제조업체에 의해 결정 하였다. </li></ol></li><li> 각 표준 또는 실험 샘플에 해당하는 1 μL의 cDNA를을 포함하는 테스트 판을 준비합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 적어도 1의 cDNA 샘플 /을 할당합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 당 마스터 믹스 19 μl를 추가합니다. 참고 :도 3의 대표 데이터를 들어, cDNA를 시료는 각 프라이머 프로브 이중으로 분석하고, 두 개의 샘플의 평균으로 그래프. </li><li> QRT-PCR 시스템에서 실행 반응은 권장 또는 이전 PCR 프로토콜을 테스트하여. 표 4 참조 </s도 3 및도 4에 대표 데이터에 사용되는 PCR 프로토콜 trong&gt;. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
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<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY 및 MAA는 FirstString 리서치에 고용되지 않고 회사의 금융이자를 보유하지 않습니다. FirstString 리서치는이 논문에서 제시 한 루시 페라 영상 데이터를 제공했다. GSG는 FirstString 연구의 사장 겸 CEO이다. CLG는 FirstString 연구의 직원입니다. GSG와 CLG는 FirstString 연구가 발행 한 스톡 옵션이 있습니다.

이 프로토콜은 이종 이식 된 마우스 모델을 이용하여 폐에 유방 종양 세포 전이를 평가 QRT-PCR의 용도를 설명한다. 그것은 생물 발광 영상을 포함한 다른 기술, 사용할 수 있으며, 또한 자신의 가치와 한계에도 불구하고 전이를 검출하는 효과가 있음을 인정한다. 제시된 데이터는 QRT-PCR 총 전이 정량 폐 조직 내 종양 유래의 mRNA를 검출하는 효과적인 조치를 제공하는 것이 제안한다. 그것은 QRT-PCR 분석을 보완 또는 이들 이미징 기법 대신에 수행 될 보조 방법을 제공하는 것이 제안된다. 이 기술은 최고의 장비 또는 전이성 부담의 특정 관심사를 가진 연구 그룹에 대한 특정 유형의 제한 액세스 할 수있는 연구 환경에 적합하지만, 역학적 연구를 자세히 설명하지 될 수 있습니다. 유익한 있지만, 여기에 설명 된 QRT-PCR 분석은 한계가있다. 이는 하류의 추가 수행하는 것이 가능하지 않다면역 조직 화학 (IHC) 또는 폐 조직의 전체 RNA를 분리를 위해 사용되기 때문...

QRT-PCR 분석은 종양 전이를 평가하는 방법으로서 제안되어있다. 이 방법은 전이를 평가 관련되지만, 생체 내 이미징 장치 또는 형광 할 입체경 특정 장비에 액세스 할 수없는 사용자를위한 대안으로 제시된다. 일반적으로 사용되는 방법의 논의는 QRT-PCR 분석은 별개로 또는 전이를 평가하는 방법에 동반하여 사용할 수있는 방법에 대한 데모 뒤에 제공된다. 이 절차는 전이성 부담의 정량 분석​​을 제공하는 잠재력을 가지고있다. 실체 현미경하에 폐의 시각화뿐만 아니라 헤 마톡 실린 및 에오신 다음 직렬 절편을 포함하여 총 분석의 표준 방법은 폐 조직의 (H &amp; E) 염색, 정량화하지만 2-5 계산을위한 사용자 정의 된 매개 변수에 크게 의존하고있다. 실체 현미경을 사용하여 전체 폐를 평가할 때, 단지 큰 표면 전이는 VISI은BLE 및 분석은 전이성 병변을 구성하는 것을 결정하기 위해 폐 해부학 적 구조의 합리적인 지식을 가지고 조사를 필요로한다. 이러한 GFP 적절한 여기 / 방출 최대 (GFP 예 : 근처 510분의 470 ㎚)와 빛 큐브를 포함하는 입체 현미경의 사용과 같은 마커로 종양 세포의 형광 라벨은이 과정에서 지원,하지만 표면의 종양 결절은 탐지 가능 . 또한, GFP와 같은 매개 변수 아래에 표시되는 혈액의 오염에서 형광이 가능 전이성 병변의 거짓 식별 될 수 있습니다. 폐 전이를 시각화하기 위해 H &amp; E 염색 한 다음 폐의 단면은 미세 전이와 면역 세포의 침윤을 포함한 다른 마이크로 프로세스를 평가하는 유용한 방법이지만 종종 파라핀 삽입, 절편 및 염색 절차는 전체 폐 조직의 사용을 필요로한다. 따라서, 다운 스트림 절차는이 운전 방식 다음과 같은 이상 없습니다디. 정량화하지만,이 과정은 분석이 폐의 전체 3 차원 구조를 차지하도록 동물 당 염색 폐 구간의 다수를 평가하는 조사원을 필요로한다. 결과적으로, 시험이 유형의 에러를 카운트로 이어질 수 있고, 시간 소모적이며, 분석은 연구자의 판단에 크게 의존한다. (MRI는 PET, SPECT는 예) 현재 수행하거나 실험 쥐 모델 8 생물학적 과정을 테스트하는 데 사용되는 생체 내 이미징 기술의 몇 가지. 생체 내 생물 발광 영상은 전이 (9)의 총보기를 취득하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 일반적으로 인해 종양 세포 주입 후 유선 및 자발적 전이시 폐 같은 특정의 장기에 상주하는 루시퍼 라제 반응 요소를 포함하도록 설계되는 종양 세포의 축적에 루시페라아제 리포터 활성의 존재를 평가하기 위해인가 1루시페라아제 리포터 활성의 0. 시각화는 루시페린 기판 (D-루시페린)의 존재에 의해 유도된다. 루시 페라 제는 생물 발광을 생성 oxyluciferin하는 D-루시페린의 산화 적 탈을 촉매. 정보 있지만,이 방법은 기판의 안정성 (즉, 짧은 반감기)이 실험 동물에 전달되는 방법에 따라 달라집니다 기판의 적절한 분배, 및 탐지 (9)의 낮은 감도 등 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다. 이 기술에 주요 장점은, 비 침습적 인 살아있는 동물에서 수행 될 수 있고, 일반적으로 절개 9,10- 수확되지 않았을 수있는 다수의 기관에서 종양 세포의 전이의 검출을 초래할 수 있다는 것이다. 생체 영상 기술의 일 측면은 양성 폐 조직 파라핀 등에 매립 이차 절차 허용 흐트러 그대로 또는 여기 제시 QRT-PCR 분석한다는 것이다. 그러나, QRT-PCR은 theoretica이기 때문이다에서야 검출 더 민감한 법안은 총 평가는 폐에 존재하는 종양 세포의 낮은 숫자를 공개하지 않을 수 있습니다. 유용한 반면, 상기 이미징 기술은 치환 될 수 있거나, 현재 설명 QRT-PCR 방법으로 보충. QRT-PCR은 폐에서 종양 유래의 mRNA의 민감한 측정을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA 분리 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript 역전사 슈퍼믹스 QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr>용 <tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR 그린 어세이: ERBB2, 인간&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린 어세이를 위한 PrimePCR 템플릿: ERBB2, Human&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh 프라이머 시퀀스</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

정량 실시간 pcr에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

전이성 질환 먼 기관에 차 암 사이트에서 악성 종양 세포의 확산된다 암 관련 사망의 1 차 원인이다. 전이성 확산의 일반적인 사이트는 폐, 림프절, 뇌, 뼈 (2)를 포함한다. 전이를 구동 메커니즘은 암 연구의 강렬한 영역입니다. 전이 먼 사이트는 암 연구를위한 수단이다에 따라서, 효과적인 분석은 전이성 부담을 측정합니다. 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가는 일반적으로 다음 해부 폐 조직의 육안 관찰에 의해 정성 행한다. 전이를 평가하는 정량적 방법은 현재 생체 외 및 사용자 정의 된 매개 변수를 필요로 생체 내 이미징 기반 기술에 제한됩니다. 이들 기술의 대부분은 오히려 세포 수준 3-6보다 전체 유기체 수준이다. 다 광자 현미경을 이용하여 새로운 이미징 방법 METAS을 평가할 수 있지만세포 수준에서 7 TASIS이 매우 우아한 절차는 보급의 메커니즘보다는 전이성 부담의 정량적 평가를 평가에 더 적합하다. 여기에 정량적으로 전이를 평가하는 간단한 체외 방법이 제공된다. 정량 실시간 PCR을 사용하는 것은 (QRT-PCR), 특정 종양 세포의 mRNA는, 마우스 폐 조직 내에서 검출 될 수있다.

시간을 초과가 실험 동물 내로하면 종양 세포의 초기 접종을 수행하는 데 걸리는 행하는, 생체 내 종양 분석, 조직 수확 RNA 분리 및 QRT-PCR 분석에 기본이 1-2 일 과정이다 (도 1) . 총 분석의 예는 폐 조직 내에서 종양 세포를 평가하기위한 생물 발광 이미징이다. 여기서, 유방 종양 실험은 ACT1라는 갭 정션 connexin43에 단백질을 대상으로 임상 에이전트, 폐에 루크 4T1 유방 종양 세포의 자발적인 전이를 저해 할 여부를 평가하기 위해 수행 하였다. 치료, 위약 또는 테스트 에이전트를받은 동물의 몇 주 후 루시페린 주입과 희생되었다. 해부시, 폐 루시 페라 생물 발광에 대한 가시화되었다. 대표 이미지는 약물로부터의 폐를 나타납니다처리 된 동물은 종양 세포가 ACT1 치료 <...

이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 전이를 분석하는 방법으로서 폐의 종양 세포로부터 특정 mRNA의 양을 검출하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 전이를 정량적으로 측정할 수 있다는 점입니다. 폐 종양 적출을 수행하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 치사량의 isofluorine을 사용하여 마우스를 안락사시킨 후, 마우스의 사지를 벌려 등에 닿게끔 폼 보드 위에 놓고 적출 핀을 사용하여 보드에 고정하십시오.에탄올로 마우스를 분무한 후, 핀셋으로 동물의 하단 중앙 부분을 잡고, 가위로 피부를 통해 목 방향으로 위쪽을 향해 절개하되, 마우스의 복강을 찌르지 않도록 주의하십시오. 이제 동물의 하단 끝부분에서 복막을 잡고, 목 기저부 방향으로 위쪽을 향해 절개를 시작하십시오. 흉강 내로 출혈이 발생할 수 있는 혈관을 절단하지 않도록 주의하면서 흉곽의 좌우 측면을 따라 조심스럽게 절개하십시오.횡격막과 흉곽의 상단부를 가로질러 좌우로 절개하여 갈비뼈를 제거합니다. 그 다음, 포셉을 사용하여 마우스의 기관을 잡고 앞으로 당긴 뒤, 해부 가위로 기관을 절단하여 마우스에서 폐를 적출합니다. PBS를 사용하여 폐 조직을 부드럽게 세척합니다.그 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 폐 조직의 육안 평가를 수행한 후, 폐를 즉시 분석해야 하는 경우 RNA 분리로 진행하십시오. 조직에서 RNA를 분리하려면, 텍스트 프로토콜에 나열된 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화하는 것부터 시작하십시오. RNA 분리 키트의 용해 버퍼를 준비하고, 용해 버퍼 1mL당 20µL의 tumor captoethanol을 추가하십시오.30g의 조직마다 300µL의 용해 버퍼(lysis buffer)로 재현탁하고, 진폭을 30%로 설정한 초음파 분쇄기로 조직을 10초 동안 처리합니다. 590µL의 TE 버퍼에 10µL의 protinase K를 첨가한 후, 이 버퍼 600µL를 초음파 처리된 조직 300µL에 추가합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로, 잔해물을 제거하기 위해 샘플을 13,000 ×g 이상에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. RNA를 침전시키기 위해 상층액 900 µL당 450 µL의 에탄올을 첨가합니다.그런 다음 라이세이트 에탄올 혼합액 700 µL를 RNA 컬럼으로 옮깁니다. RNA가 컬럼에 결합할 수 있도록 13,000 ×g 이상의 속도로 1분 동안 다시 원심분리합니다. 그 후 폐액을 버리고, 남은 상

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간의 전립선 암이 동 소성 모델에 폐 종양 세포와 구별 전이의 형성을 순환, 종양 크기의 정량을 허용한다. 세포가 일차 장기 탈출해야 같이, 혈류를 입력하고, 보조 사이트에 이식,이 모델은 인간에서 효과적으로 시나리오 되풀이되었습니다.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

이 프로토콜의 목표는 유방 종양 형성을 연구하는 것입니다. 이 기술을 사용하면 마우스 유방 종양을 제거하고 종양에서 일차 세포를 준비할 수 있습니다. 폐 전이를 연구하기 위해 폐 추출 프로토콜이 포함되어 있습니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

마이크로 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 선암종 마우스 모델의 폐에서 종양 결절 발달을 감지하는 방법과 시간 경과에 따른 결절 크기 및 치료에 대한 반응 변화를 모니터링하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 평가의 정확성은 종말점 조직학적 정량화로 확인되었습니다.

종양 개발의 평가를 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하고 후속 치료에 대한 반응의를 폐암의 마우스 모델에서

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다.

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론 드 노보 유방암 전이

Murine orthotopic 유 방 암 모델 및 과격 한 유 방 절제술 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방 하기 위해 종양 부담 척도를 생물 발광 기술을 소개 합니다.

Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

우리는 피지-ImageJ를 사용하여 4T1 유방암 모델에서 폐 전이를 정량화하는 보다 일관되고 신속한 방법을 설명합니다.

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

배우세요 정량 실시간 PCR을 사용하여 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이를 평가하는 방법을. 종양 특이적 mRNA를 검출하여 전이 수준을 정량적으로 분석하는 이 기술은 암 연구에 필수적인 도구입니다.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

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