레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식
2015년 11월 25일
우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.
이 방법의 전반적인 목표는 관심 있는 표적 또는 출처 뇌 핵에 대한 연결을 추적하기 위해 뉴런과 축삭 돌기를 라벨링하는 것입니다. 이 방법은 뇌의 서로 다른 영역 또는 뉴런 하위 집단 간의 연결 패턴뿐만 아니라 주어진 신경 회로에 대한 기능적 중요성과 같은 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 추적자 주입 중 표적 정확도가 증가한다는 것입니다.
이는 기본 광학 장비를 사용하여 형광 표지된 뇌 핵을 시각화함으로써 달성됩니다. 이 방법의 또 다른 장점은 신경 세포 프로모터의 제어하에 형광 단백질을 발현하는 마우스 팝의 비침습적 유전형 분석을 허용한다는 것입니다. 유전형 분석을 할 때 새끼는 적절한 여기 파장을 가진 레이저 포인터를 사용하여 각 형광 마커의 발현을 확인합니다.
동시에 여기 파장을 차단하지만 방출 파장은 통과하는 필터 고글을 착용하십시오. 레이저를 문제의 강아지의 머리 뒤쪽이나 척수에 겨누십시오. P'S 눈에 레이저를 비추지 않도록 주의하고 레이저 노출을 짧게 유지하십시오.
여기된 형광 마커는 피부를 통해 볼 수 있어야 합니다. 마우스가 더 나이가 들면 수확된 조직의 개별 뉴런을 식별할 수 있습니다. 마우스를 마취하고 반사가 없는지 확인한 후 두개골 위의 피부를 제거하고 머리 뒤쪽을 따라 두개골 중간 부분까지 피부를 자릅니다.
생후 1개월이 넘은 생쥐에서도 동물의 눈을 통해 형광을 관찰할 수 있습니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 PBS 트랜스 카디를 사용하여 30 게이지 바늘을 사용하여 마커 양성 동물을 관류하면 5-10 분 후에 대부분의 혈액이 제거됩니다. 그런 다음 뇌를 제거하고 관심 영역을 해부합니다.
여기서, 뇌의 복부 영역에 있는 두 개의 두드러진 전구인 사다리꼴체(trapezoid body)는 관심 영역을 포함하고 있습니다. 사다리꼴체 또는 VNTB의 복부 핵은 이식된 관심 뇌 영역을 산소가 함유된 해부 용액 접시로 옮기는 것으로 시작합니다. 거기. 주입 영역이 상단의 접근 할 수 있도록 30 게이지 주사기 바늘로 explan을 고정합니다.
주입의 경우 3회 또는 4회의 당김 주기로 제조된 Bo 규산염 유리 당김 주입 피펫을 사용합니다. 다음 용액으로 피펫을 로드합니다. Alexa FLUORA 4 5 55에 접합된 콜레라 독소 소단위 B는 주로 역행 수송을 위한 것입니다.
레이저 포인터와 주입 피펫이 모두 장착되고 사용 준비가 된 상태에서 주사할 레이블이 지정된 뇌 영역 또는 세포에 빔을 조준합니다. 밴드 통과 필터 고글을 통해 자기장을 관찰하여 주입 피펫으로 어떤 뉴런을 표적으로 삼아야 하는지 확인합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 관심 영역에 배치합니다.
그런 다음 15PS에서 50밀리초 펄스를 전달하도록 설정된 압력 인젝터를 사용하여 추적 물질을 2-10개의 펄스로 주입합니다. 주입된 염료가 퍼질 수 있도록 펄스 사이를 10-15초 정도 기다립니다. 테트라에틸을 주입할 때 루민은 TTL 펄스를 전달하는 자극 전극으로 영역을 전기적으로 자극합니다.
전극이 수조 용액에 접지되어 있는지 확인하십시오. 8볼트에서 각각 50밀리초 길이로 50밀리초 간격으로 8개의 TTL 펄스를 제공합니다. 몇 분에 걸쳐 10-20회의 펄스 반복으로 영역을 자극합니다.
뇌핵은크기, 신경 밀도 및 세포 유형이 다양합니다. 이는 주어진 뇌 영역에 대한 최적의 라벨링 결과를 얻기 위해 압력 및/또는 전기 펄스의 지속 시간과 수를 조정해야 할 수도 있음을 의미합니다. 레이저와 고글을 사용하여 형광 추적기 신호를 확인합니다.
염료는 세포에 흡수되어 주입된 부위 주위에 퍼져야 합니다. 주사 후 실온에서 1-4시간 동안 산소가 공급된 인공 뇌척수액으로 뇌간을 배양합니다. 배양 중 산소화를 유지한 다음 조직을 4% 파라폼 알데히드로 고정합니다.
다음날 섭씨 4도의 PBS에서 하룻밤을 보내면서 조직을 잘라 사다리꼴체 또는 VNTB의 복부 핵에 학년간 주사를 놓을 수 있습니다. 테트라에틸 로딘 덱스트린을 사용하면 VNTB의 돌기가 사다리꼴체 또는 MNTB의 내측핵까지 확장되는 것을 보여줍니다. 그런 다음 MNTB에 콜레토인(chole toin), 소단위 B를 주입했는데, 이는 소급하여 VNTB라고 크게 표시되었습니다.
더 자세하게는, glyc enteric VNTB cell의 somata가 다음으로 표지된 것으로 나타났습니다. MNTB에는 역행 라벨 덱스트린 트리(dextrin tri)가 주입되었습니다. CTB 라벨링의 구두점 패턴과 달리 덱스트린 트리트 라벨링은 조밀하고 GOGI와 비슷했습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 정확도를 높여 뉴런과 뉴런의 과정에 레이블을 지정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시연된 기술은 주어진 신경 회로에 참여하는 뇌 영역과 신경 하위 집단을 식별하는 데 도움이 되며, 일단 숙달되면 주입 절차를 적절하게 수행하면 약 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 면역화학 또는 뇌 세척과 같은 다른 방법과 쉽게 결합하여 신경 돌기 및 기타 신경 세포의 형태, 방향성 또는 기능에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 체외 환경에서 전행성 또는 역행성 추적자 주사를 사용하여 뉴런과 그 축삭 투영을 표지하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 형광 표지된 마우스 돌연변이와 기본 광학 장비를 사용하여 표지 정확도를 향상합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 신경 연결성
- 추적자 주사 기술
배경
- 신경 연결을 추적하는 것은 뇌 기능을 이해하는 데 중요합니다.
- 기존의 추적자 전기 주입 방법은 정확도를 개선할 수 있습니다.
- 형광 표지된 마우스 돌연변이는 타겟팅을 위한 시각적 보조 수단을 제공합니다.
- 형광 마커를 사용하여 비침습적 유전자형 분석을 수행할 수 있습니다.
연구 목적
- 뉴런과 그 축삭 투영을 정확하게 표지하기 위함입니다.
- 특정 뇌 핵으로의 연결을 추적하기 위함입니다.
- 연결 패턴 및 그 기능적 중요성을 조사하기 위함입니다.
사용된 방법
- 전행성 및 역행성 추적자 주사.
- 향상된 시각화를 위한 체외 준비.
- 정확도를 위한 기본 광학 장비의 사용.
- 형광 단백질을 발현하는 마우스 개체군의 유전자형 분석.
주요 결과
- 추적자 주사 중 타겟팅의 정확도 증가.
- 신경 연결의 성공적인 시각화.
- 형광 마커를 통한 비침습적 유전자형 분석의 확인.
- 뇌 영역 간 연결 패턴에 대한 통찰력.
결론
- 수정된 기술은 신경 회로의 연구를 개선합니다.
- 신경 회로의 기능적 중요성 탐색을 용이하게 합니다.
- 이 방법은 신경과학 연구를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Laser-guided neuronal tracing in brain explants enables precise mapping of neuronal connectivity, supporting early discovery and mechanistic de-risking in neuropharma pipelines. The integration of targeted tracer injection with real-time fluorescent visualization increases predictive confidence in target validation and circuit mapping. This capability is critical for portfolio decisions involving CNS targets and functional neurocircuit interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-precision interrogation of neuronal pathways and connectivity relevant to disease models.
- Supports functional target validation by linking genetic markers to neurotransmitter subpopulations.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying circuit-level contributions to phenotypes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain explant systems for downstream compound screening or phenotypic assays.
- Improves reproducibility and standardization of tracer uptake and neuronal labeling.
- Enables quantitative assessment of tracer spread and neuronal targeting accuracy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neuronal tracing outputs with disease-relevant circuits for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional mapping in explant models.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement of CNS-targeted assets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation and functional circuit mapping in CNS drug discovery workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neuronal connectivity and circuit function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tracer labeling for assay readiness.
- Analytics: Provides measurable outputs on tracer uptake, neuronal targeting, and connectivity patterns.
- Translational Research: Links explant findings to disease-relevant neurocircuit biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS target and pathway investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuronal target validation and circuit mapping.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neuronal tracing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for CNS programs by reducing mechanistic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuropharma assets based on functional connectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, tracer injection, and fluorescence imaging.
- Needs access to optical equipment, pressure injectors, and filter goggles for real-time visualization.
- Demands cross-team standardization of tracer protocols and imaging parameters.
- Adaptation may be needed for different brain regions or animal models.
- Tracer uptake and labeling efficiency may vary with tissue age and neuronal density.
