Name: 레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 학습하세요 레이저 유도 신경 세포 추적 기법으로 뇌 외식에서 신경원과 축삭 투영을 정확히 표지하는 방법입니다. 형광 표지 마우스와 기본 광학 장비를 활용하여 표지 정확도를 높이고 비침습적 유전자형 분석이 가능합니다.

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NIH 지원 / NIDCD R01 DC 011582. 이미징 실험은 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스 고급 광학 현미경 코어의 대학에서 수행 하였다는 NIH / NCRR 콜로라도 CTSI 허가 번호 UL1 RR025780과 록키 마운틴 Neurlogical 장애 코어 센터 보조금 NIH P30NS048154에 의해 부분적으로 지원. 솔크 연구소에서 박사 샤샤 뒤 락은 GlyT2-GFP 마우스를 우리에게 제공했다.

1. 광학 유전자형 마우스 새끼 1. 광학 유전자형 <ol><li> 적합한 여기 파장의 레이저 포인터를 이용하여 각각의 형광 마커의 발현을 검사 (여기 기재된 실험에서 405 ㎚) 및 여기 파장을 차단하는 필터 고글 대응하지만, 발광 파장을 전달 (450 - 여기에 설명 된 실험에서 700 ㎚) . 헤드 또는 마우스 새끼의 척수의 뒤에 레이저 포인터를 가리 키 (도 1 참조). 눈과 레이저 빛에 피부의 긴 노출에 레이저를 빛나는하지 마십시오. </li></ol> 이전 동물 2. 광학 유전자형 <ol><li> 깊이 복강 내 주사 (120 ㎎ / ㎏ 체중)을 통해 펜 토바 비탈의 과다 복용으로 (여기에 설명 된 실험에서 P138에 세 P14) 마우스를 마취. 동물의 반사 신경을 확인하여 적절한 마취를 확인 (잠​​시 일의 끝을 꼬집어전자 귀 또는 뒷다리 중 하나는 귀 또는 다리)의 수축 반사를 유도합니다. </li><li> 참고 : 동물이 여전히 이상적으로 (즉, 그 중심은 여전히 박동) 살아 있기 때문에 펜 토바 비탈 (120 ㎎ / ㎏ 체중)의 과다 복용의 사용에도 불구하고 우리는 대신 안락사의 &quot;깊은 마취&quot;로 주입 절차를 참조 할 때 수술 및 관류이 시작됩니다. 이것은 뇌를 포함한 내부 장기의보다 효율적인 관류을 보장한다. </li><li> 동물 모든 반사 작용을 보여주지 않는다 일단 신중 머리 뒤쪽을 덮는 피부 절개를 만들고 두개골의 중앙부를 절단하여 두개골 (도 2a)를 덮는 피부를 제거한다. 레이저 광에 폭로 두개골을 노출시켜 전술 한 바와 같이 필터 고글 통해 형광을 관찰한다. GFP 양성 신호가 관찰되는 경우, 다음의 형태를 안락사 보장 / 잘린 통해 동물을 희생하지 않으면 초 (2 단계로 진행 우리IACUC 규정). </li></ol> 참고 : 형광이 동물의 눈을 통해 관찰 할 수있다 (&gt; 1 개월)도 나이가 쥐에서. 2. Transcardial 관류 및 뇌 준비 <ol><li> 빙냉 인산염 완충 식염수로 transcardially 관류; 크게로부터 혈액을 제거하는 30 G 주사기 바늘을 이용하여 (PBS의 NaCl : 10mM의 137 mm의 KCl을 2.7 mm의 KH 2 PO 4 : 1.76 mm의 나 2 HPO 4) 동물. <ol><li> 첫째, 신중하게 날카로운 가위로 흉곽을 열고 심장의 좌심실에 바늘을 밀어 넣습니다. 심장과 대동맥에 PBS를 펌핑 바로이 단계는 몸을 종료 혈액 수 있도록 가위로 심장의 우심방을 열고 다음 시작합니다. 주 : 관류 5 얻어 - 동물의 크기에 따라 10 분. </li></ol></li><li> 관류를 통해 방혈 한 후, 동물의 목을 벨 핀 N으로 머리를 보호eedles (30 G 주사기 바늘) 준비 접시에 눈 소켓을 통해 피어싱과 두개골에서 뇌를 제거하여. <ol><li> 우선, 두개골을 오버레이 피부를 봉쇄하는 날카로운 가위를 사용 뒤통수에 작은 절개를 한 후 단지 미부 동물의 눈의 측면에 절단 헤드의 등쪽에 정중선을 따라 잘라 및 꼬리 방향 마지막 절단은 완전히 머리 뒤쪽에 피부의 플랩을 제거한다. </li><li> 이 크게 결국 뇌간의 제거를 단순화하기 때문에 다음, 두개골 자체에 대한 동일한 절단 패턴을 반복, 그 과정에서 모두 cochleas을 제거해야합니다. 이 절차 후 뇌의 꼬리 절반이 완전히 노출 거짓말한다​​. </li><li> 다음 단계에서, 소뇌에서 약 45 ° 내지 약 2mm의 입쪽의 각도 전체 전뇌를 통해 절단하는 날카로운 면도날 또는 메스를 사용한다. AB와 뇌의 분리 전면 절반을 특종ENT 주걱. </li><li> 그 입쪽 끝에 뇌의 절반을 상승 꼬리이어서 여전히 복부쪽에 뇌간 접속되어 뇌신경 통해 잘라 주걱을 사용한다. 최종 결과로서, 뇌간을 포함한 뇌의 꼬리 절반 준비된 동물 머리의 나머지 떨어져 자유롭게 낙하한다. </li><li> 그것의 복부 측면을 노출하는 뇌의 제거 꼬리 반 플립과 사다리꼴 본체를 포함하는 복부있는 &quot;전구&quot;의 (선행 성 주사에 대한) 단지 주동이의 관상면을 따라 절단 또는 (역행 주사에 대한) 바로 꼬리 (단계 참조 2.3). <ol><li> 언제나 조직에 과도한 기계적 스트레스에 의한 세포 사멸을 최소화하기 위해 절단 과정을위한 날카로운 면도날 또는 메스를 사용한다. 최종 결과로서, 길이가 약 1cm에 걸친 다른 뇌 영역을 따라 완전한 우수한 olivary 착체를 함유하는 뇌 이식편을 수득 한 것이다. </li></ol></li></ol> &lt;/ 리&gt; </ol> 주 :이 프로토콜은 청각 뇌간 위치한 사다리꼴 체로 트레이서 주입하는 절차를 보여준다. 필요에 따라, 절삭면과 주사 부위의 위치 및 방향을 적응. 들이 식별되고 뇌를 절단하지 않고 분사 될 수 있도록 뇌의 표면에 충분히 가까이 관심 거짓말의 형광 뇌 영역 (도 2b 참조) 경우, 관상 절단 공정을 생략 할 수있다. <ol start="3"><li> 사다리꼴 본체 (VNTB)의 복부 핵을 포함하는 두 복부 눈에 띄는 &quot;전구&quot;로 사다리꼴의 몸을 확인합니다. </li></ol> 참고 :이 절삭면의 대략적인 정위 위치에 대한 자세한 해부학 참고로, MM은 Tz 일 &quot;로 표시 사다리꼴 몸 (= MNTB)의 내측 핵을 보여줍니다, 브레 그마 ~ -5.7를 아틀라스의 프랭클린 &amp; Paxinos, 2008 년 패널 (78)을 참조 &quot;. 패널 (69)는 사다리꼴 보의 복부 핵을 보여줍니다&quot;MVPO&quot;(medioventral periolivary 핵) (19)로 표시 DY (VNTB). 3. 선행 성 / 역 행성 추적 참고 : RT (25 ℃)에서 모두 다음 절차를 수행합니다. <ol><li> 125 mm의의 KCl : 2.5 mm의의 MgCl 2 : 1 mm의 CaCl2를 0.1 mM의 포도당 절단 후 (95 % O 2, 5 % CO 2) 해부 용액 (NaCl을 산소 함유 제제 접시에 뇌간 이식편 배치 25 mm의의 NaH 2 PO 4 : 1.25 mm의 NaHCO3을 25 mm의 아스코르브 산 : 0.4 mm의 이노시톨 : 3 mm의 피루브산 2 mM)을 30 G 주사기 바늘을 고정. 분사의 영역이 위쪽으로 향하도록합니다. </li><li> 붕규산 유리 주입 피펫을 당겨 다음과 같은 세 가지 솔루션 중 하나를 채우기 : choleratoxin 서브 유닛-B PBS 12 ~ 13에서 알렉사 형광 (555)에 결합 된 (주로 역행 전송에 사용), B의) 1.0 ㎎ / ㎖ 솔루션 ) 1 % -d10,000 MW 덱스 트란 TRITC-555의 0.9 % 식염수, 덱스 트란 (주로 역행 수송에 사용 MW 3,000) 555 테트라 메틸 또는 c) 1 % -dilution 0.9 % 식염수에 ilution (주로) 선행 성 전송을 위해 사용된다. <ol><li> 4 당겨주기 - 2.5에서 3.5 옴과 그들이 3에서 제조되는 것을 주입 피펫 저항 범위를 확인합니다. 여기 기재된 실험을 위해, 피펫 풀러에 미리 프로그램 당기는 알고리즘을 선택함으로써 이것을 달성한다. </li></ol></li><li> 적절한 파장의 정적으로 탑재 레이저 포인터 사용 뇌 이식편 조명 (도 3a에 &#39;2&#39;번 항목을 여기서 설명한 실험에서 405 nm 파장). 주사를위한 가이드로 레이저 포인터를 사용하고, 형광 표지 된 뇌 핵 또는 주입 될 관심 셀에 레이저 빔을 목표로한다. </li><li> (70) - 호환 필터 고글 (450를 입고있는 동안 찾아 쌍안 현미경을 통해 조사 대상 지역을 관찰여기에 설명 된 실험) 0 nm의 대역 통과 필터. 관심의 영역으로 미세 조작기를 통해 주입 전극을 삽입합니다. </li><li> 추적 물질을 주입한다. 뇌 단면 내의 관심 영역 (ROI)의 영역과 수직으로 향하는 압력 분사 장치를 사용하여, 50 밀리 초마다 15 psi에서 10 압력 펄스 - 주사는 2로 구성된다. 염료가 확산 할 수 있도록 15 초 - (10)의 간격으로 각각의 압력 맥동을 관리. </li><li> 테트라 메틸 (TRITC) 주사제의 경우에는, 추가로 (여기에서 설명 된 실험과 MNTB VNTB) 관심의 뇌 영역에 배치 된 전극을 통해 전기 염료 흡수를 강화하기 위해 전기 자극한다. <ol><li> 자극 분리 장치 (그림 3B의 항목 번호 7, 9)와 55 V로 자극에 의해 구동 증폭 간격 interpulse 50 밀리, 50 밀리 초 8 볼트의 8 TTL 펄스를 사용합니다. 이 프로토콜, adminis의 20 반복 - (10)를 사용하여몇 분 7,8에 걸쳐 tered. 제대로 전극을 접지하십시오 - 접지선은 목욕 솔루션에 연결해야합니다! </li></ol></li><li> 분사의 성공을 확인합니다. 긴 발광 파장과 형광 트레이서도 단파장 레이저 여기시 형광 신호를 방출하기 때문에, 시각적으로 레이저 영역을 조명하고 상기 필터 고글 통하여 관찰하면서 주입 대상 영역 확산 염료 흡수 / 확인. </li></ol> 4. 배양 <ol><li> 주입 후, 산소 인공 뇌척수액에서 (ACSF을 brainstems을 품어, 염화나트륨 : 125 밀리미터,의 KCl : 2.5 mm의의 MgCl 2 : 1 밀리미터, 염화칼슘 2 : 2 밀리미터, 포도당 : 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 : 1.25 밀리미터, NaHCO3을 25 mm의 아스코르브 산 : 0.4 mm의 이노시톨 : 3 mm의 피루브산 : 2 mm의 95 % O 2로 버블 - 실온에서 5 % CO 2) 1 (RT, 25 ° C) - 4 시간, 동안염료가 전송되고있다. 버블 전체 잠복기 동안 용액. </li><li> 밤새 (O / N)을 포스트 - 고정 가능하도록 39 ° C에서 그들을 및 부화 (PFA / PBS 믹스 pH를 7. 약 100 ml)에이어서, PBS에 용해 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 brainstems 옮긴다. </li></ol> 5. 조직 슬라이스 및 장착 <ol><li> 다음날, PBS에 뇌간에게 (각 세척 단계 5 분) 세 번 씻어, 4 % 한천에서 그것을 커버하고 50로 절단 - vibratome에 80 μm의 두께 조각. 유리 슬라이드와 커버 슬립에 장착 매체를 이용하여 산 조각. </li><li> 선택적으로, (: AB 미디어 100 희석 1 예를 들어 파란색 Nissl) 25 분 동안 형광 Nissl와 섹션 레이블을 붙입니다. <ol><li> , AB 미디어를 준비 0.2 M 인산 완충액 250㎖를 혼합하는 방법 (PB; 51 mM의 KH 2 PO 4, 150 밀리미터 나 2 HPO 4), 15 ml의 5 M의 NaCl, 15 ml의 10 % 트리톤-X, 220 ML의 DDH 2 O 5g과 소 혈청 알부민. </li><li> Prece드를 PBS의 3 세척 단계로 Nissl 라벨 단계 (10 분마다)을 성공합니다. </li></ol></li></ol> 주 : 두꺼운 부분이 장착되고 분석 될 필요 경우 (예 : 여기에 기술 된 실험 슬라이스 100이었다 - 큰 거리에서 축삭 연결을 유지하기 위해 두께 500 미크론) 기술은 조직 지우기와 결합 될 수있다. 우리는 ClearT2 (12)가 20 성공을 발견했다. 조직 청소 단계가 포함되는 경우, 섹션을 설치하기 전에 수행합니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

, 생체 내 추적 연구에 반대 체외 추적 전기의 일반적인 강도는 고가의 정위 (종종 전기 생리학) 장비를 포함하지 않는, 그것은 연구자에게 따라서 관심과의 뇌 영역에 더 접근 할 수 있다는 것입니다. 덱스 트란 아민 및 다른 트레이서의 사용에 대한 상세한 검토를 참조 (생체 트레이서 주사의 경우가 아닌 일 또는 주 - 또한, 뇌 이식편 필요한 생존 기간은 몇 시간 (4 일)에 걸쳐 Lanciego 및 Wouterlood 2011 년 22뿐만 아니라,로드 리 게스 - 콘트레라스, 등. 2008 년 23)에 의해 생체 내 주사에 그래서, 실패 주사가 빠르면 주입 절차를 수행하는 동안 등을 검출 할 수 있도록 또는 다음 날에, 늦어도 주입 파라미터를 적절히 조정할 수있다. 뇌 이식편 대 짧은 생존 기간도 &lt;간의 작은 차이는 일반적으로 존재한다는 것을 의미EM&gt; 효과 (염료가 선행 성 뉴런 또는 역행 주사...

특정 신경 (마이크로) 회로를 정의하기 위해, 상기 하나의 회로는, 자신의 접속 패턴의 다양한 참여자를 발견함으로써 시작한다. 이제까지의 lesioning 1을 통해 신경 해부학 추적 기술의 큰 다양성을 추적 neurofiber에 대한 월러의 게시가 설립되었습니다입니다. 1,971 5-6 발견으로 이들 기술 중 일부는 고정 된 조직 사후 2-4에 적용 할 수있는, 다른 라이브 뉴런 염료의 활성 전송에 의존한다. 후자는 또한 (주어진 돌기의 근원, 즉에 주입 영역으로부터. 면적 상기 돌출되는 뉴런 인 somata) 활성 역행 활용 방법을 구별 두 그룹으로 분할 될 수 있고, 활성 선행 성 (주입로를 주어진 투사의 대상, 즉. 축삭 돌기 및 레이블 뉴런) 수송의 축삭 터미널 지역. 또한, 어떤 경우에는 TRACER 재료는 다음 다른 경우에는 외식 뇌가 주입하는 동안, (생체 내 추적 주사에) 몇 일 또는 몇 주에 의해 주입을 생존과 인공 뇌척수액에 주입 후 몇 시간 동안 품어 살아있는 동물에 주입 (체외 추적 주사) . 이 프로토콜에서 우리는 생체 전기 기술 7-8에서 기존의 추적 물질로 choleratoxin 서브 유닛-B 및 테트라 메틸 덱스 트란을 이용하여 선행 성 및 역행 추적 실험에서 신경 세포 인 somata과 프로세스 레이블을 수정했습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 탐침 주사 중에 타겟팅 정확성을 향상시키기 위해 사용할 트랜스 제닉 마우스 선 및 기본적인 광학 기기를 이용하면서, 다른 뇌 핵 사이의 연결의 연결 패턴을 추적하는 효율적인 도구 신경 과학자를 제공하는 것이다. 선행 성 및 역 행성 추적의 방법을 사용하여 비록choleratoxin 및 덱스 트란 아민과 각각의 형광 표지 된 접합체는 9-13 새로운 것이 아니다 (예. 하스 등 전기의 방법 때문이다. 14), 뇌 조직의 블록을 포함하는 체외 준비에 전기와 추적 주사의 조합 보다 최근의 개발 7이다. 살아있는 동물에 추적 염료의 동일 유형을 사용하여 신경 세포의 추적 기술을 통해 그 주요 장점 때문에 일렉트로 염료 뉴런에 의해 흡수되고있는 더 높은 효율, 증가 된 표지의 강도이다. 실험자 주입 대상 영역 위에 시각적 컨트롤을 가지고 있기 때문에 추가적인 장점은, 트레이서 주입시 (염료 전송 요구)을 단축 잠복기 및 증가 된 정확성을 대상이다. 후자는 또한 고가의 장비가 정위 관심 핵 또는 뇌 영역을 찾기 위해 필요하지 않다는 것을 의미한다. ADDI으로레이 터는 우리는 405 nm의 파장과 일치하는 대역 통과 필터링 고글 휴대용 레이저 포인터 (450 이루어진 뉴런 (15)와 기본적인 광학 기기의 그 글라이신 개체군에서 GFP를 발현하는 트랜스 제닉 마우스 라인 이용했고, 정확도를 목표로 증가 - 700 ㎚). 따라서, 우리는 형광 신호를 통해 주입 영역을 식별함으로써 정확도를 타겟팅 및 토착 GFP 신호와 탐침 사이의 상호 작용의 관찰을 통해 주입 지역 내의 염료 확산을위한 제어 미세한 방법을 제공하여 상당한 추가적인 증가를 달성 형광. 우리의 기술은 추적 가득 차 있었다 (다른 마우스 라인 또는 흥분성)의 GFP 양성 억제 신경 세포를 식별하여 연결과 함께 회로의 기능을 발견 할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 또한 척추 동물의 뇌의 커 넥톰을 공부하고 T를 평가하기 위해 강력한 신경 과학적 도구를 강화그는 주어진 neurocircuit의 다른 신경 해부학 적 특징. 저렴하고 널리 사용되는 광학 장비와 함께 형질 전환 마우스를 사용하여 우리는 크게 우리의 주사의 대상으로 정확도를 높일 수 있었다. 또한, 트랜스 제닉 마우스는 청각 뇌간에서 억제 저항기의 기능을 밝혀 도움 추적 접속의 타입을 식별하라고시켰다.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>달리 명시되지 않는 한 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 가져온 것입니다.</td></tr><tr><td>염화칼륨&nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td></td>마그네슘 <td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td></td>칼슘 <td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>중탄산</td><td></td>나트륨 <td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td></td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td></td><td>A2153</td><td>옵션, 추가 (면역)조직화학</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>옵션, 추가 (면역)조직화학</td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>옵션, 뇌 청소용</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>F84</td><td>옵션, 뇌 청소용</td></tr><tr><td>콜레라톡신 서브유닛-b</td><td>분자 프로브</td><td>C-34776 (Alexa 555)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 테트라메틸-로다민</td><td>분자 프로브</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>형광 Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (파란색)</td><td>옵션</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>인비트로겐</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech 제약</td><td>치명적 플러스&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 필라멘트</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Zeitz Instruments, 독일</td><td>DMZ Universal Puller</td><td></td></tr><tr><td>관류 설정</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 포인터&nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, 홍콩</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>필터/안전 고글</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Bionocular microscope&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, 스위스</td><td>Wild M3</td><td>고휘도 조명기(MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>MC Stimulus 소프트웨어가 설치된 PC</td><td>Multi Channel Sys-tems, 독일 (소프트웨어)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2채널 자극기</td><td>Multi Channel Sys-tems, 독일</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>자극 격리 장치</td><td>A.M.P.I., 이스라엘</td><td>Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige, 일본</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, 독일</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

우리는 과정 중에 타겟 레이저 조명 및 매칭 필터 고글 뇌 절편에서 전기 천공을 통하여 염료 흡수를 증가시키기 위해 전기적 및 압력 펄스의 시리즈를 사용하여 시험 관내 트레이서 주입 프로토콜을 결합하는 기술을 제시한다. 그 자체로 체외 전기의 기술 기술은 뇌의 특정 지역을 타겟팅에 대한 상대적으로 좋은 시각 제어를 얻을 수 있습니다. 레이저 형광 유전자 마커의 자극과 판독 대역 통과 필터 고글을 통해, 유전자 표지 세포 / 핵 및 형광 추적 염료의 배출을 선택할 수있는 연구자가 실질적으로 주사의 정확도를 높일 수 있습니다과 결합하여 관심 영역을 발견하고 더욱 효율적으로 주입 영역에서 염료 확산 / 흡수를 위해 제어함으로써. 또한, 레이저 조사에 의한 방법은 잠 neurocircuit 소정의 기능을 연구 할 수 있도록GFP 발현이 신경 세포의 개체군에 의해 표현 송신기의 유형에 연결된 경우에 소정 영역에 돌출 뉴런의 유형에 대한 정보를 iding.

레이저 포인터 레이저 고글은 신속하고 저렴 쓰레기에서 GFP 양성 동물 유전자형 할 수있는 방법 1 및도 2를 도시한다. 어린 마우스 새끼의 경우, 기술은 비 침습적 두개골 상부 피부 (- D도 1a)를 통해 동물의 뇌에서 GFP 라벨을 식별하는 데 사용될 수있다. 방출 된 형광은 적어도 최대 3 일 산후 (도 1C)에 피부와 새끼 마우스의 두개골을 통해 알 수있다. 절차는 우리의 녹색 형광 단백질 (GFP) 그림 1에 표시되어 신경 세포의 글라이신 하위 집단 (GlyT2-GFP)에 GFP를 발현하는 마우스 라인을 표시. 두꺼운 두개골과 피부 착색 이전 동물, GFP 라벨은 피부 및 뼈를 통해 덜 나타내며, 따라서 헤드 및 / 또는 목 피부는 광 유전자형 (도 2A) 전에 제거 될 필요가있다. 를 관류 한 후동물의 뇌는 꺼내어...

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

이 방법의 전반적인 목표는 신경세포와 그 축삭 돌기를 표지하여 관심 있는 표적 또는 기원 뇌핵으로의 연결성을 추적하는 것입니다. 이 방법은 뇌의 서로 다른 영역 또는 신경세포 하위 집단 간의 연결 패턴뿐만 아니라, 특정 신경 회로에서 이들이 갖는 기능적 중요성과 같은 신경과학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 추적자 주입 시 표적 정확도가 향상된다는 점입니다.이는 기본적인 광학 장비를 사용하여 형광 표지된 뇌 핵을 시각화함으로써 달성됩니다. 이 방법의 또 다른 장점은 신경세포 프로모터의 제어 하에 형광 단백질을 발현하는 생쥐 새끼들의 비침습적 유전자형 분석이 가능하다는 점입니다. 새끼들의 유전자형을 분석할 때는 적절한 여기 파장을 가진 레이저 포인터를 사용하여 각각의 형광 마커 발현 여부를 확인하십시오.동시에, 들뜸 파장은 차단하고 방출 파장은 통과시키는 필터 고글을 착용하십시오. 레이저를 해당 새끼 쥐의 머리 뒷부분이나 척수에 조준하십시오. 레이저가 새끼 쥐의 눈에 비치지 않도록 주의하고, 레이저 노출 시간을 짧게 유지하십시오.들뜬 형광 마커가 피부를 통해 보여야 합니다. 마우스가 성장하면 적출한 조직의 개별 뉴런을 식별할 수 있습니다. 마우스를 마취하고 반사 반응이 없는 것을 확인한 후, 두개골 위의 피부를 제거하고 머리 뒤쪽에서 두개골 중앙 부분까지 피부를 절개합니다.한 달 이상 된 더 고령의 생쥐에서는 동물의 눈을 통해 형광을 관찰할 수 있습니다. 다음으로, 30 gauge 바늘을 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS로 마커 양성 동물의 심장을 통해 관류시키면, 5~10분 후에 대부분의 혈액이 제거됩니다. 그런 다음 뇌를 적출하고 관심 영역을 분리합니다.여기서 뇌의 복측 영역에 위치한 두 개의 돌출된 팽대부인 사다리꼴체(trapezoid body)에 관심 영역이 포함되어 있습니다. 사다리꼴체 복측 핵(VNTB) 실험은 적출한 뇌의 관심 영역을 산소가 공급된 해부 용액이 담긴 디쉬로 옮기는 것으로 시작합니다. 그 후, 주사 부위가 위쪽으로 노출되어 접근 가능하도록 30 gauge 주사 바늘로 적출물을 고정합니다.주입을 위해 3회 또는 4회 당김 사이클로 제작된 Bo silicate glass pull injection 피펫을 사용하십시오. 피펫에 다음 용액을 충전합니다. 주로 역행성 수송을 위해 사용되는 Alexa FLUORA 4 5 55 결합 Cholera toxin subunit B입니다.레이저 포인터와 주입 피펫의 장착 및 준비가 완료되면, 빔을 표시된 뇌 영역 또는 주입 대상 세포로 조준합니다. 밴드패스 필터 고글을 통해 시야를 관찰하여 주입 피펫으로 타겟팅할 뉴런을 확인합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 관심 영역에 위치시킵니다.그 다음, 15 PS에서 50 millisecond 펄스를 제공하도록 설정된 압력 주입기를 사용하여 추적 물질을 2~10회 펄스로 주입합니다. 주입된 염료가 확산될 수 있도록 펄스 사이에 10~15초의 간격을 둡니다. tetraethyl rumine을 주입할 때는 TTL 펄스를 전달하는 자극 전극으로 해당 부위를 전기적으로 자극합니다.전극이 욕 용액 내에서 접지되었는지 확인하십시오. 각 50ms 길이의 8V TTL 펄스를 50ms 간격으로 8회 전달합니다. 수 분 동안 10~20회의 펄스 반복으로 해당 영역을 자극합니다.뇌핵은 크기, 뉴런 밀도 및 세포 유형이 다양합니다. 이는 특정 뇌 영역에서 최적의 라벨링 결과를 얻기 위해 압력 또는 전기 펄스의 지속 시간과 횟수를 조정해야 할 수도 있음을 의미합니다. 레이저와 고글을 사용하여 형광 추적자 신호를 확인하십시오.염료가 세포에 흡수되어 주입 부위 주변으로 확산되어야 합니다. 주입 후, 뇌줄기를 산소가 공급된 인공 뇌척수액에 담가 상온에서 1~4시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 산소 공급 상태를 유지한 다음, 조직을 4%paraform aldehyde로 고정합니다.4°C의 PBS에서 하룻밤 동안 보관한 다음 날, 조직을 절편화하여 trapezoid body의 ventral nucleus 또는 VNTB로의 중간 단계 주입 상태를 마운팅할 수 있습니다. tetraethyl Rodine dextrin을 사용하여 VNTB로부터의 투사체가 trapezoid body의 medial nucleus 또는 MNTB까지 뻗어 있음을 보여줍니다. 그 후, MNTB에 chole toin, subunit B를 주입하였으며, 이는 VNTB를 역행성으로 강력하게 표지하였습니다.더 자세히 살펴보면, 당질 장내 VNTB 세포의 세포체가 다음에 표지된 것으로 보였습니다. MNTB에 역행성 표지제인 dextrin tri를 주입했습니다. 점상 패턴의 CTB 표지와 달리, dextrin trit 표지는 조밀했으며 GOGI와 유사했습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 뉴런과 그 돌기를 더 높은 정확도로 라벨링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 시연된 기술은 숙달되면 특정 신경 회로에 참여하는 뇌 영역과 뉴런 하위 집단을 식별하는 데 도움이 되며, 적절히 수행할 경우 주입 과정은 약 30분 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차는 면역화학 또는 뇌 투명화와 같은 다른 방법들과 쉽게 결합하여 뉴런 투사와 기타 뉴런 구조의 형태, 방향성 또는 기능에 관한 추가적인 질문에 대한 답을 얻는 데 활용될 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 체외에서 레이저 핀셋을 사용하여 교양 뉴런의 조작을 설명합니다.

체외에서 분리된 뉴런을 조작에 대한 레이저 족집게를 사용하여

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 신경 세포 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가.J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오에서,  이광자 레이저 절제 절차가 시연되어 아가로스에 고정된 제브라피시 유충에서 형광 뉴런을 선택적으로 파괴할 수 있습니다. 시술 전후의 고해상도 이미징은 형광의 부재로 관찰되는 바와 같이 효율적인 신경 손상을 확인합니다.

제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

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소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

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레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

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