Name: 멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 다중 채널 듀얼 전기장 미세유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 전기축성 이동을 연구하는 방법을. 키나아제 억제제가 종양 세포 이동에 미치는 영향을 평가하고 암 전이 진단에 활용할 수 있는 통찰을 제공합니다.

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이 작업은 대만 과학기술부(Ministry of Science and Technology, Taiwan)의 재정 지원을 받고 있습니다(계약 번호. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) 및 대만 Academia Sinica의 나노 과학 및 나노 기술 연구 프로그램.

1. 디자인 및 MDF 칩의 제조 <ol><li> 이나 AutoCAD와 같은 상용 소프트웨어를 사용하여 개별 아크릴 층 패턴을 그리고 패턴을 저장합니다. <ol><li> 도 1A에서 4 층 아크릴 시트 패턴의 설계를 검토하고 층간 접속을 확인한다. </li></ol></li><li> 모든 아크릴 시트 및 CO 2 레이저 스 크라이 빙 (도 1B, 2A, 및 2B)를 이용하여 레이저 어블 레이션에 의해 양면 테이프를 제작한다. (16) <ol><li> 레이저 스크 라이버를 켜고 제어 노트북 컴퓨터를 연결합니다. </li><li> 상용 소프트웨어를 실행하고 클릭하여 단계 1.1 설계 패턴을 열고 &quot;디자인 패턴 파일을.&quot; </li><li> 레이저 스크 라이버의 XYZ 스테이지에 빈 아크릴 시트 또는 양면 테이프의 조각을 놓습니다. </li><li> 자동 alignmen와 아크릴 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저 빔의 초점을 설정레이저 스크 라이버의 제조업체에서 제공하는 T 스틱. </li><li> 아크릴 시트 또는 양면 테이프를 직접 가공에 레이저 스크 라이버에 디자인 패턴을 보냅니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 아크릴 시트에서 보호 종이를 제거하고 질소 가스로 깨끗한 표면을 날려. </li><li> 아크릴 시트를 스택 (110)에서 45 분 동안 열 본더에 2kg / ㎠의 압력 하에서 이들을 접합 흐름 / 전기 자극 채널 조립체를 형성하기 위해 C를 °. </li><li> 칩의 세포 배양 용 기재로서 현미경 용 커버 유리를 준비한다. <ol><li> 염색 항아리에 커버 유리를 넣고 재료 목록에 세제를 10 배 희석 항아리를 채우십시오. </li><li> 초음파 steri 청소기의 커버 유리와 염색 항아리를 넣고 15 분 동안 커버 유리를 청소하십시오. </li><li> , 염색 항아리에서 희석 한 세제를 붓고 증류수로 항아리를 보충하고, 단계 1.5를 반복합니다.2 3 회. </li><li> 양면 테이프로 부착하기 전에 질소 가스를 불어 넣어 세정 커버 유리를 건조. </li></ol></li><li> 단계 1.2 패터닝 양면 테이프 흐름 / 전기 자극 채널 어셈블리 세정 커버 유리를 부착. </li><li> 슈퍼 접착제와 MDF 칩 어셈블리의 제 1 층에 개별로 개구 아크릴 어댑터 (13)의 부착 편. MDF 칩 조립체는 완전한 (도 2d)이다. </li><li> 사용하기 전에 UV 조사 30 분으로 완료 MDF 칩 어셈블리를 멸균. </li></ol> MDF 칩의 소금 브리지 네트워크 2. 설정 <ol><li> 사용 (121)에서 15 분의 유지 시간을 설정하여도 3b에 도시 된 모든 플라스틱 튜브, 손으로 조인 견과류 및 마이크로 원심 튜브 살균 종래 오토 클레이브에서 C를 °. </li><li> 매체 입구를 통해 MDF 칩 어셈블리에 불소 수지 튜브 (도 3B-I)을 연결및 출구 어댑터는도 1a에 도시. </li><li> 그림에 플라스틱 튜브를 매체 입구의 루어 테이퍼를 연결하고 콘센트 3B-나는 3 방향 마개에. </li><li> 3 ㎖ 주사기를 사용하여 CO 2 -equilibrated 인산염 완충 식염수 (PBS), 2.5 mL를 취하여 입구 플라스틱 튜브의 3 방향 스톱 콕에 주사기를 연결한다. 출구 플라스틱 튜브의 3 방향 스톱 콕에 빈 3 ㎖ 주사기를 연결한다. 두 주사기 따라서 MDF 칩을 통해 서로 연결되어있다. 참고 : (37)의 PBS를 품어 ° C 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터 O / N은 CO 2는 PBS를 -equilibrated 얻을 수있다. </li><li> 백색 고체를 손으로 조인 너트와 레이어 1 PMMA 시트에있는 파란색의 개구부 및 녹색 어댑터 (그림 1A)를 밀봉 (그림 3B-III). </li><li> CO 2 염다리 채널 배양 챔버를 채우기 설정 단계 2.4에 기재된 주사기에 PBS를 -equilibrated. 기피기포의 형성. </li><li> 이어서, CO 2 넣어 O / N 항온 배양 용의 37 ° C, 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 MDF 칩을 PBS가 함유 -equilibrated. 이는 양면 테이프에 용해 공기 챔버에 버블을 형성 할 수있다. </li><li> 두 개의 주사기를 사용하여 채널에서의 빠른 흐름에 의해 PBS 채널에서 거품을 얻어 플러시. 앞뒤로 필요 PBS 펌프. </li><li> 매체 배출관에 연결된 3 방향 스톱 콕을 통해 채널에서 PBS 드레인. </li><li> CO 2는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 -equilibrated 새로운 3 mL를 주사기를 사용하여, 2.5 mL를 취하여 (단계 3.5 참조), 및 새와 입구에 연결된 주사기를 교체한다. 매체 채널을 리필. </li><li> 염다리 네트워크의 제조. <ol><li> 일시적으로 고체 너트 (그림 3B-III) 녹색 어댑터 (그림 1A)를 제거하고 (&gt; 70 ° C) 아가로 오스에 소금 BRI를 뜨거운 3 %를 주입녹색 어댑터 (그림 1A)에있는 구멍을 통해 당선 총재 채널. 주 : 뜨거운 아가로 오스의 제조 : PBS 50ml에 아가로 오스 분말 1.5 g을 녹인다. 오토 클레이브에서 121 ℃에서 20 분의 유지 시간을 설정하여 살균. </li><li> 액체 염다리 채널의 길이의 3/4을 채우면 아가 주입 멈춘다. </li><li> 아가로 오스 주입 후 고체 너트를 (그림 3B-III) 나사에 의해 녹색 어댑터 (그림 1A)에 구멍을 밀봉합니다. </li><li> 반투명 튜브를 손으로 조인 너트 (그림 3B)과 푸른 어댑터 (그림 1A)에 고체 너트를 교체합니다. </li><li> 3 % 통 너트 (그림 3B-IV)에 아가로 오스 예열을로드합니다. </li><li> 전 통 너트로의 Ag / AgCl을 전극 (그림 3B-V) (그림 3B-IV)을 포함아가로 오스의 응고. </li></ol></li><li> 염다리 네트워크의 설정을 완료 한 후, 한 번에, 배양 챔버로 한 실을 CL1-5 폐암 세포를 주입. </li></ol> 3. 암 세포의 준비 및 Electrotactic 실험에 대한 설정 <ol><li> 폐암 세포주 CL1-5의 레귤러 배양. <ol><li> 37 75T 세포 배양 플라스크에서 완전 배지에서 교수 팬 Chyr 양, 17에서 얻은 배양 CL1-5 폐암 세포, 5 % CO 2 분위기에서 C를 °. 완전 배지는 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 구성된다. 하위 문화 세포마다 3-4일. electrotaxis 실험 수행에 사용되는 세포는 원본에서 25 미만의 통로이다. </li></ol></li><li> 기하 급수적으로 증가 CL1-5 세포에 0.25 % 트립신 버퍼 2 ㎖를 추가하고 37에서 2 분 동안 품어 세포 detachmen에 대한 ° C 5 % -CO 2 세포 배양 인큐베이터티. </li><li> 10 % FBS DMEM 6 ml의 분리 처리를 종료하고 RT에서 5 분 동안 300g로 원심 분리하여 세포. 이어서 배지를 버리고 PBS 5 ㎖과 세포 펠렛을 중지. </li><li> PBS에서 세포의 수를 계산. 이어서 RT에서 5 분 동안 300g에 1 × 106 세포를 원심 분리를 수행. </li><li> PBS를 폐기하십시오. 미리 예열 CO 2 -equilibrated DMEM으로 세포를 중단하고 1 × 106 세포 / ml가되도록 세포 밀도를 조절한다. 참고 : 37 완전한 매체를 품어 ° C CO 2를 얻기 -CO 2 세포 배양 인큐베이터 O / N은 DMEM을 -equilibrated 5 %. </li></ol> 4. Electrotactic 실험에 대한 설정 <ol><li> MDF 칩의 출구에서, 칩에 셀 1 × 106 / mL의 0.3 mL로, 주사. </li><li> 세포 배양 인큐베이터에서 셀 시드 MDF 칩을 인큐베이션 (37 ℃ 설정 2-4 시간 동안 ° C와 5 % CO 2). </li><li> MDF 마이크로의 설정유체 시스템. <ol><li> 투명 인듐 주석 산화물 유리 (ITO) 위에 히터 MDF 마이크로 유체 시스템을 설치한다. MDF 칩과 ITO 유리 사이 클립핑 K 형 열전대를 가진 MDF 칩의 온도를 측정한다. 비례 적분 미분 (PID) 컨트롤러와 ITO 히터를 제어 할 수 있습니다. 37 MDF 미세 유체 시스템 배양 온도를 설정 PID 제어기와 C를 °. 주 : ITO 히터의 제조 및 세포 배양 물 가열 시스템의 설치 이전의 보고서에 기재되어있다 (18, 19). </li><li> 거꾸로 현미경에 컴퓨터 제어 XYZ 전동 무대에서 온도 조절 MDF 칩 어셈블리를 장착합니다. 전동 무대의 사용 단계 5.1에 설명되어 있습니다. 4 채널 주사기 펌프 유입구를 통해 챔버로 배양 완전 배지 펌프. </li></ol></li><li> 20 μL / hr의 유속 MDF 칩으로 완전 배지 펌프. 아웃에서 문화 폐기물(그림 3a에 &quot;쓰레기&quot;로 표시)의 microcentrifuge 튜브에 수집 할 수 있습니다. </li><li> MDF 칩에 37 ℃에서 또 다른 16 ~ 18 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 배지를 교체하기 위해 10 분 동안 20 μL / 분의 유속에서 각 배양 챔버로 각각 50, 25, 5, 0 μM 키나아제 억제제를 함유하는 배지를 펌프. 주 : 10.6 mg의 키나아제 억제제로 멸균 3 ㎖을 첨가하여 회합 단백질은 Rho 키나아제 억제제의 Y27632의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 10 % FBS DMEM 배지를 이용하여, 각각 50, 25, 5 μM로 10 mM의 원액을 희석. </li><li> 37 ℃에서 또 다른 60 분 동안 키나아제 억제제로 세포를 배양한다. / 시간 20 μL에 중간 유량을 설정합니다. 동일한 배양 온도를 사용하는 단계 및 이후에 상기 유량. </li><li> 칩의 Ag / AgCl을 통해 전극 MDF 칩에 DC 전원을 접속하는 전기 배선을 사용한다. </li><li> 직렬 I 전류계를 연결N 전기 회로. MDF 칩에 전류를 모니터링하는 전류계를 사용한다. </li><li> DC 전원을 켜고 V. 15 내지 19에 전원 전압을 조정하여 86.94 μA 전류를 전류계로 설정 주 : 옴의 법칙을 고려 I는 벌크 재료를 통해 흐르는 전류, 즉, electrotactic 챔버 내의 배양액이고, E = I / (ΣA의 EFF), σ (= 1.38 Ω -1 m - 1)이고 배양 배지 (0.07 mm 높이 × 3mm의 폭 = 0.21 mm 2) EFF의 전도도 electrotactic 챔버의 유효 단면적, 및 300 MV / mm를 생성하기 위해 필요한 전류 (I) 인 MDF 칩의 EF는 86.94 μA이다. </li></ol> 5. 수집 및 세포 이미지 분석 <ol><li> MATLAB GUI 프로그램을 사용하여 모터 단계를 제어 할 수 있습니다. microsco에 장착 된 MDF 미세 유체 시스템과PE, 전동 단계를 사용하여 관찰 영역에 칩을 이동합니다. </li><li> 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 기록 세포의 현미경 사진에 탑재. </li><li> 2 시간 동안 15 분 간격으로 4 배 대물 렌즈를 사용하여 미세한 이미지를 가져 가라. </li><li> 세포 이동의 분석. <ol><li> NIH ImageJ에 1.47 (V)를 실행 </li><li> 셀의 중심의 최종 위치로 초기부터 거리를 분석한다. </li><li> &quot;이미지 시퀀스&quot; &quot;파일&quot;→ &quot;가져 오기&quot;→로 이동하여 세포 이동 분석을위한 9 개의 이미지를 가져옵니다. 제 화상은 제로 시간의 결과이고, 마지막 이미지가 120 분의 결과이다. </li><li> → &quot;측정 설정&quot; &quot;분석&quot;에 가서 옆에있는 상자 &quot;무게 중심&quot;을 확인 </li><li> &quot;자유형 선택&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 첫 번째 이미지에서 선택된 셀의 에지를 도시한다. </li><li> &quot;편집&quot;로 이동 → </em&gt; &quot;선택&quot;→ &quot;관리자 추가&quot; </li><li> 아홉 번째 이미지로 이동하여 첫 번째 이미지에서 선택한 같은 셀의 가장자리를 묘사. 셀의 위치는 이미지 여덟째 제를 사용 추적 될 수있다. </li><li> → &quot;관리자 추가&quot; &quot;편집&quot;→ &quot;선택&quot;으로 이동 </li><li> 반복 90 ~ 100 세포에서 데이터를 수집하기 위해 5.4.5 5.4.9에 단계를 반복합니다. </li><li> 선택한 셀의 초기 및 최종 위치의 결과를 얻을 → &quot;측정&quot;을 &quot;분석&quot;로 이동합니다. 주 : 이동 속도는 시간 당 평균 기포 이동 길이로 정의된다. directedness는 (애노드로부터 캐소드로) dcEF의 벡터 및 최종 위치에 셀의 시작점에서 벡터 사이의 코사인 각도로 정의된다. directedness는 음극쪽으로 마이그레이션 셀의 양극쪽으로 마이그레이션 세포 -1과 +1. 무작위 마일의 그룹에 대한세포 격자, directedness 0 2 </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 까다로 MDF 칩의 제 1 층 상에 아크릴 어댑터를 부착하는 과정을 발견 하였다. 슈퍼 접착제 단지 1 내지 2 μL의 응용 단단히 MDF 칩 상에 어댑터를 부착하기에 충분하다. 접착제의 큰 금액은 슈퍼 접착제 및 준수 실패의 불완전한 중합 결과. 아크릴 어댑터 단단히 MDF 칩에 부착 한 후, 마이크로 유체 시스템의 액체 누출이 거의 발생하지 않았다. 또한, 진공 챔버 내부의 O / N 항온 처리는 양면 테이프 / 커버 유리 또는 양면 테이프 / 아크릴 시트 인터페이스 사이에 포획 된 공기를 제거하는 데 도움을 주었다. 따라서,이 프로세스는 MDF 칩 배양 챔버의 안정성을 향상시킨다. 염다리 네트워크의 제조시 3 % 아가로 오스의 온도 제어가 중요하다. 아가의 온도가 주입 중에 충분히 높지 않으면, 아가 신속 주사기 내부 고화와 연결할 수없는염다리 네트워크에 주입 될 수있다. 더욱이, 아가로 주입하는 동안, 그것은 염다리 네트워크 내의 어떤 기포 형성을 방지하는 것이...

직류 전계 (dcEF) 아래에 애노드 또는 캐소드 측으로 이동 부착 세포의 거동 electrotaxis로 지칭된다. 셀 electrotactic 동작은 배아 발생, 신경 재생과 상처 치유에 중요한 역할을한다. 이러한 쥐 전립선 암 세포, (2) 유방암 세포, 3, 폐 선암 세포 4-8로서 1 종양 세포가인가 dcEF하에 electrotactic 이동을 보여 주었다 . 생리 EF는 샘 조직에서 측정되었다. 9,10- Electrotaxis 또한 그랜드 - 관련 종양 세포에서보고되었다. 2,3- 암세포의 electrotaxis가 전이 인자로 간주되고, 종합적. 11의 전기 안내 제어 dcEF 하에서 암 세포는 암 치료를위한 미래의 잠재적 접근 할 수있다. 그러나 오늘, electrotaxis의 상세한 분자 메커니즘은 논란이 남아있다. 따라서, INF의 조사암 세포의 이동에 대한 전기 자극의 luence 암 치료 전략의 개발을 촉진 할 수있다. 최근 바이오 마이크로 유체 장치는 시험 관내에서 12 화학적 구배, 전기 자극 (13) 및 4 전단력을 유동 세포 반응을 연구 제작되었다. (또한 아크릴로 알려진 PMMA), 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 또​​는 폴리 메틸 메타 크릴 레이트를 사용하여 바이오 미세 유체 소자의 제작이 성공적으로 실험의 실패율을 감소시켰다. 또한, 생물학적 인 피사체를 조사하기위한 시제품으로서 아크릴계 마이크로 유체 장치를 이용하여 PDMS 칩을 사용하는 것보다 간단하다. 아크릴계 장치의 각종 기능은 electrotaxis 연구 개발되어왔다. 그러나, 이전 디자인의 것도 동시에 electrotaxis 연구를 위해 세포에 다양한 화학 조건의 효과와 전기 분야를 테스트 할 수 없습니다. 따라서, 우리는 미세 유체 장치 MU 개발ltichannel 이중 전기 분야 (MDF) 칩 포함하는 4 개의 독립적 인 문화 채널과 하나의 칩에 8 개의 다른 실험 조건을. 처음 허우에 의해보고 된 아크릴 기반 MDF 칩, 등., 8은 전기 자극과 여러 화학적으로 고립 채널을 통합합니다. 이러한 화학적으로 절연 한 채널 실험에서 배양 세포의 다른 유형을 사용할 수있다. 채널에 dcEF은 전력 공급에 의해 생성된다. 두 개의 독립적 인 전기장인가 전계 강도 (EFS) 0 EFS 또 다른 하나는, 각각의 화학적으로 절연 채널에서 수행된다. 이러한 방식으로, 칩 나은 제어 공존 EF 화학적 자극을 제공한다. 또한, MDF 칩 내부 화학적 확산의 수치 시뮬레이션 결과는 전혀 교차 오염이 24 시간 후 실험 기간 사이에 채널이 발생하지 것을 나타낸다. (8) 데비 비교리 의해보고 세륨 등., 14 MDF 칩은 전기적으로 자극 된 세포의 생화학 적 분석을 위해 더 큰 허용 배양 공간을 제공한다. 또한, 칩의 MDF 큰 관찰 영역보다 세포는 시험에서 관찰 할 수 있으므로, 전기적으로 자극 된 세포의 이동 속도 나 directedness의 분석은 더 정확하다. 황 등. (4) 및 영 외. (15)에 의해보고 된 이전 연구의 단일 채널 칩 설계는 셀 또는 화학 물질의 한 타입이 테스트 될 수 있도록. 그러나, MDF 칩 electrotaxis 다양한 화학 물질의 영향뿐만 아니라, 다른 종류의 세포에 대한 전기 자극의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다. 즉, MDF 칩은 화학 선량 의존성 효율적인 학습을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (hydrochloride)</td><td>케이맨 화학</td><td>10005583</td><td></td></tr><tr><td>아가 로스</td><td>LONZO, 미국</td><td>SeaKem LE AGAROSE</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>테루 모</td><td>3ml 루어 테이퍼</td><td></td></tr><tr><td>3 방향 스톱 콕</td><td>Nipro</td><td>루어 테이퍼</td><td></td></tr><tr><td>PMMA (아크릴)</td><td>HiShiRon Industries CO., Ltd, 대만</td><td></td><td>두께 1mm, 2mm</td></tr><tr><td>아크릴 어댑터</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, 대만 타이중</td><td>1/4-28 포트, 10x10x6mm</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>너트</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Deckgl&auml; ser, 독일</td><td>24x60mm</td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>3M</td><td>PET 8018</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 접착제</td><td>3M</td><td>스카치 리퀴드 플러스 슈퍼 접착제</td><td></td></tr><tr><td>TFD4 세제</td><td>Franklab, 프랑스</td><td>TFD4</td><td></td></tr><tr><td>초음파 steri 클리너</td><td>LEO ULTRASONIC CO., LTD., 대만</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo bonder</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>CO2 레이저 스크라이버</td><td>LTT 그룹, 대만</td><td>ISL-II</td><td></td></tr><tr><td>비례 적분 파생(PID) 컨트롤러</td><td>JETEC Electronics Co., Japen</td><td>TTM-J40-R-AB,</td><td></td></tr> <tr><td>K형 열전대</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td></td></tr><tr><td>4채널 주사기 펌프</td><td>KdScientific, 미국</td><td>250P</td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>GWInstek, 대만</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Y-Z 모터 스테이지</td><td>TanLian, E-O Co. Ltd., 대만</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>올림푸스, 일본</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>디지털 SLR 카메라</td><td>캐논, 일본</td><td>60D</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 electrotaxis 연구

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

직류 전계 (dcEF) 아래 방향 세포 이동의 동작 electrotaxis로 지칭된다. 배아 개발, 세포 분화 및 상처 치유하는 동안 세포의 이동을 안내에 생리 dcEF의 중요한 역할은 많은 연구에서 입증되었다. electrotaxis 분석에 미세 유체 칩을 적용함으로써, 조사 과정을 단축하고, 실험 오차가 최소화된다. 최근, 마이크로 유체 장치는 고분자 물질 (예를 들면, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트, PMMA, 아크릴) 또는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 넓게 전기 자극에 세포의 반응을 연구에 사용되었다 만들었다. 그러나, PDMS 소자를 제조하는 데 필요한 다수의 단계와는 달리, 칩 uidic FL 아크릴 마이크로 간단하고 신속한 구조 장치 시제품 및 생산 모두에 적합하다. 그러나보고 된 장치 중 어느 것도 동시 화학 및 DCE의 효율적인 연구를 촉진하지세포에 F 효과. 이 보고서에서, 우리는 우리의 디자인 및 폐암 세포에 화학적 및 전기 자극의 효과를 동시에 조사하는 아크릴계 멀티 듀얼 전계 (MDF) 칩의 제조를 설명한다. MDF 칩은 하나의 시험에서 전기 / 화학적 자극의 여덟 조합을 제공합니다. 이 칩은 크게 필요한 실험 시간을 단축뿐만 아니라 electrotaxis 연구의 정확성을 증가뿐만 아닙니다.

MDF 장치의 제조 및 조립 아크릴계 MDF 칩의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 네 아크릴 시트, 하나의 커버 유리, 아크릴 어댑터 (13), 양면 테이프의 조각이 완료 MDF 칩 (도 2D)의 조립에 사용 하였다. MDF 장치의 네 개의 독립 채널을 배양이있다. 그러나, 온 - 칩 염다리 네트워크는 칩의 여덟 부분에 8 개의 다른 실험 조건을 생성한다. 세 염다리, 79, 90 (도 1a의 계층 2에서 청색 채널), 길이 80mm는, 화상의 관찰을 방해하지 않고 MDF 칩의 두번째 층에 결합되었다. 0이 염다리 네트워크 및 배양 챔버들 사이의 작은 기공 (블루 입방 레이어 3의 채널과도 1a의 4),0.25...

많은 미세유체 장치가 전기택시 연구에 사용하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이러한 칩 중 어느 것도 세포에 대한 동시 화학 및 전기장(EF) 효과를 효율적으로 연구할 수 없습니다. 우리는 전기택시 연구에 사용하기 위해 더 잘 제어되고 공존하는 EF 및 화학적 자극을 제공하는 폴리메틸메타크릴레이트 기반 장치를 개발했습니다.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

본 미세유체 실험의 전반적인 목표는 직접 전기장 하에서 종양 세포 이동에 미치는 키나아제 억제제의 효과를 평가하는 것입니다. 따라서 이 방법은 암세포의 전기장 유도 이동에서 결정적인 경로가 무엇인지와 같은 세포 전기택시스 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쉽게 구현할 수 있으며 재현성이 높고 시간이 절약되는 전기택시스 연구 방법이라는 점입니다.이 기술의 함의는 암의 전이 능력 진단까지 확장됩니다. 전기장에 의해 자성 암세포의 이동성이 향상될 수 있으므로, 이 방법은 종양 세포의 세포 내 전기적 특성을 제공할 수 있습니다.또한 상처 치유와 같은 피부 재생 과정에도 적용될 수 있습니다. 먼저 제도 및 설계 프로그램을 사용하여 개별 아크릴 층 패턴을 그립니다. 패턴을 저장한 다음 레이저 스크라이버를 켭니다.스크라이버를 제어용 노트북에 연결하고 설계된 패턴 파일을 클릭하여 아크릴 층 패턴을 엽니다. 다음으로, 레이저 스크라이버의 x, Y, Z 스테이지 위에 빈 아크릴 시트를 놓고, 해당 레이저 스크라이버 자동 정렬 스틱을 사용하여 시트 표면에 레이저 빔의 초점을 맞춥니다.설계된 패턴을 레이저 스크라이버(laser scriber)로 전송하여 아크릴 시트를 직접 가공합니다. 그 다음 핀셋을 사용하여 아크릴 시트에서 보호지를 제거하고 질소 가스로 표면을 깨끗하게 불어냅니다. 이제 시트들을 쌓고 열 접합기(thermal bonder)를 사용하여 110 °C에서 45분 동안 2 kg/cm²의 압력으로 접합하여 유체 전기 자극 채널 어셈블리를 형성합니다.동일한 방식으로 양면테이프를 준비한 후, 깨끗한 커버 글라스를 유체 전기 자극 채널 조립체에 테이프로 고정합니다. 그다지 순간접착제를 사용하여 아크릴 어댑터 13개를 다채널 이중 전기장 또는 MDF 칩 조립체의 첫 번째 층에 있는 각 개구부에 부착하여 MDF 칩 염다리 네트워크를 구축합니다. 먼저 배지 입구 및 출구 어댑터를 통해 바닥 플라스틱 튜브를 MDF 칩 조립체에 연결하십시오.다음으로, 중간 유입구 및 유출구 플라스틱 튜브의 루어 테이퍼를 3방향 스톱콕에 연결합니다. 2.5 mL의 이산화탄소 평형 PBS가 담긴 3 mL 시린지를 유입구 플라스틱 튜브의 3방향 스톱콕에 연결하고, 빈 3 mL 시린지를 유출구 플라스틱 튜브의 3방향 스톱콕에 연결합니다. 흰색 솔리드 핑거 타이트 너트를 사용하여 레이어 1 아크릴 시트의 파란색 및 녹색 어댑터 개구부를 밀봉합니다. 그 후, 기포가 생기지 않도록 주의하면서 염다리 채널과 배양 챔버를 이산화탄소 평형 PBS로 채웁니다.칩을 37 °C, 5% carbon dioxide 세포 배양 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣어 두어, 다음 날 아침 양면테이프에 용해되어 있던 공기가 챔버 내에서 기포를 형성하도록 합니다. 두 개의 시린지를 사용하여 PBS를 빠르게 흐르게 함으로써 기포를 씻어내며, 필요에 따라 PBS를 앞뒤로 펌핑합니다. 모든 기포가 제거되면, 배지 배출 튜브에 연결된 3방향 스톱콕을 사용하여 채널에서 PBS를 배출합니다.그 다음, 입구에 연결된 주사기를 2.5 mL의 CO₂ 평형화된 DMEM이 들어 있는 3 mL 주사기로 교체하고, 챔버가 가득 찼을 때 배지로 다시 채웁니다. 녹색 어댑터에서 고정 너트를 제거하고, 최소 70 °C로 가열된 3% agarose를 솔트 브릿지 채널(Salt bridge Channel)에 주입합니다. 어댑터의 개구부를 통해 뜨거운 agarose가 주입 준비를 마치면, 배양 챔버 사이의 배지 열이 차단되었는지 확인합니다.화합물이 염다리 채널 길이의 4분의 3을 채우면 agros 주입을 중단하고 고체 너트로 기공을 다시 밀봉하십시오. 이제 파란색 어댑터의 고체 너트를 반투명 튜브형 핑거 타이트 너트로 교체하고 튜브형 너트에 aros를 충전하십시오. 그런 다음 aro가 응고되기 전에 은-염화은 전극을 튜브형 너트에 매립하십시오.전기촉각 실험을 설정하려면, 배출 튜빙을 통해 MDF 칩에 0.3 milliliters의 세포를 주입하고 칩을 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 2~4시간 후, MDF 미세유체 시스템을 투명한 인듐 주석 산화물 유리 히터 위에 설치하고 MDF 칩과 인듐 주석 산화물 유리 사이에 K 타입 열전대를 부착합니다. 칩의 온도를 측정하기 위해, 비례 적분 미분 제어기를 사용하여 MDF 미세유체 시스템의 배양 온도를 37 degree Celsius로 설정하고, 온도 제어 MDF 칩 어셈블리를 도립 현미경의 컴퓨터 제어 XYZ 전동 스테이지에 장착합니다.그 후 4채널 시린지 펌프를 사용하여 20 µL/h의 유속으로 유입구를 통해 배양 챔버에 완전 배지를 분주합니다. 배양 폐액은 유출구에서 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 세포를 37 °C에서 16~18시간 동안 더 배양합니다.다음 날, 각 챔버의 배지를 적절한 농도의 키나아제 억제제가 보충된 신선한 배지로 교체하여 60분 동안 처리합니다. 그런 다음 은-염화은 전극을 통해 DC 전원 공급 장치를 MDF 칩에 직렬로 연결합니다. MDF 칩 내의 전류를 모니터링하기 위해 전기 회로에 전류계를 연결합니다.마지막으로 전원 공급 장치를 켜고 전압을 15에서 19 V 사이로 조절합니다. 전류계를 통해 전류를 86.94 µA로 설정합니다. 본 대표적인 MDF 미세유체 시스템 실험에서는 다양한 농도의 키나아제 억제제를 처리한 폐암 세포를 사용하였습니다.Y 2 7 6 3 2는 전기 자극의 유무와 관계없이 세포 이동 속도에 변화를 보이지 않았습니다. 그러나 전장(electric field)을 가한 상태에서 Y 2 7 6 3 2를 처리했을 때 암세포 이동의 방향성(nautic)이 유의미하게 감소했습니다. 실제로 50 micromolar 농도에서 rock 억제제는 세포의 이동 속도에는 영향을 주지 않으면서 세포의 방향성 이동을 완전히 제거했습니다.또한, 적용된 화학 물질의 농도와 방향성 지수 사이에 용량 의존적 상관관계가 나타났으며, 이는 axxis 연구 방법으로서 MDF 미세유체 시스템의 신뢰성과 효율성을 확인시켜 주었습니다. 일단 숙달되면, 개발 후 적절하게 수행될 경우 이 기술은 7~8시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 전기 텍사스 분야의 연구자들이 피부 내 침투를 통해 비약적인 발전을 이룰 수 있는 길을 열어줍니다.레이저 스크레이퍼를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 주의 사항을 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 "Evolution Accelerator" 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.

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유방암 세포는 비종양 유방 상피 세포와 비교하여 다른 유전 특성을 나타냅니다. 이러한 유전 특성의 차이에 기초하여, 두 집단은 면역 요법 목적으로 분리 될 수 있다는 가설이 세워졌다. 이를 지원하기 위해 MCF-7 및 MCF-10A 세포를 분류하는 미세 유체 장치를 모델링합니다.

AC 전기영동을 이용한 비전이성(MCF-7) 및 비종양(MCF-10A) 유방암 세포 분리를 위한 미세유체 장치

여기에서는 상피 조직 항상성의 전기기계적 조절을 연구하기 위해 고유한 2층 미세유체 장치를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 조직 평면에 수직인 정적 생리학적 전류를 적용하여 세포 간 접착, 증식 및 압출에 영향을 미칩니다. 살아있는 세포 이미징 및 기계적 응력 측정은 이러한 과정의 메커니즘을 보여줍니다.

2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

배우세요 다중 채널 듀얼 전기장 미세유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 전기축성 이동을 연구하는 방법을. 키나아제 억제제가 종양 세포 이동에 미치는 영향을 평가하고 암 전이 진단에 활용할 수 있는 통찰을 제공합니다.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

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