Name: 유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 닭 배아 사지에 구슬을 접목하여 성장 인자와 억제제가 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 발달 생물학 연구에서 신호 전달 경로를 직접 관찰하는 데 활용됩니다.

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이 작업은 노팅엄 대학교(University of Nottingham)가 DS에 수여하는 Early Career 상으로부터 부분적으로 자금을 지원받았습니다. RM은 이라크 교육 개발을 위한 고등 위원회(Higher Committee for Education Development of Iraq)의 자금 지원을 받습니다.

윤리 문 : 이러한 모든 실험 동물 관리 및 노팅엄 대학의 윤리 지침을 따르십시오. 손톱에 대한 헤파린 비즈 1. 준비 <ol><li> 사용하기 전에 PBS에 철저 헤파린 구슬을 씻으십시오. 참고 : 비즈는 PBS의 슬러리로 4 ° C에 저장할 수 있습니다. <ol><li> PBS의 1 ml의 드롭에 20 μL 피펫으로 주식에서 그들을 제거하여 이식을 위해 구슬을 선택합니다. 그런 다음 3cm 페트리 접시에 PBS의 20 μL 드롭에 구슬을 전송하는 2 μL로 설정 마이크로 피펫을 사용합니다. P2 피펫 팁으로 선택한 구슬을 전송, 현미경을 해부 스테레오를 사용하여 크기에 따라 구슬을 선택하고, 그 약 100 μm의 직경은 이상적이다. </li></ol></li><li> 구슬에서 PBS를 제거합니다. 20 μL 피펫 및 미세 워치 집게와 모세관 작용에 의해 잔류 액체와 액체의 대부분을 제거합니다. 주 : 사실상 성장하므로 가능한 한 많이 제거하는 것이 중요이 비드에 첨가 될 때, R는 희석되지 않는다. </li><li> 비드에 직접 성장 인자 피펫. FGF18 위해 PBS에 0.​​1 % BSA 0.5 ㎎ / ㎖에서 재구성 재조합 FGF18의 0.5 μl를 추가합니다. 증발 액체를 방지하기 위해 접시의 가장자리 주위에 물 몇 방울을 놓습니다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 인큐베이션 비즈. 파스퇴르 피펫과 접시에서 물 방울을 제거하고 이식에 대한 준비가 얼음에 배치합니다. </li><li> 를 시각화하기 위해 이식 전에 (투명 구슬) 전송을 2 % 페놀 레드에 4-5 구슬이 필요합니다. 배아에 전송하기 전에 PBS로 씻어. </li></ol> 손톱 확장을위한 AG 1-X2 비즈 2. 준비 <ol><li> 0.2 N 포름산 유도체 화 비드를 사용하는 종래. <ol><li> 이 사용을 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 구슬을 전송하는 주걱을 수행합니다. 0.2 N 포름산의 1ml를 추가하고 1 시간 동안 진탕 플랫폼에 씻는다. </li><li> 그런 다음 P1000 피펫으로 포름산을 제거하고 1로 교체ml의 물. 1 시간 동안 세척하고 포름산 나머지 제거하기 위해 여섯 번 반복합니다. </li><li> P1000 피펫에 남아있는 액체를 제거하고 4 ℃에서 구슬을 저장합니다. 주 :이 단계에서 모든 잔여 수분을 제거 할 필요가 없다. </li></ol></li><li> 3cm 페트리 접시에 작은 주걱을 사용하여 주식에서 약 5 ~ 10 μL 볼륨의 구슬의 작은 펠렛을 제거하고 DMSO 1 ㎖를 추가 (또는 약물에 용해 용매 중). 참고 :이 적당한 크기의 사람들을 선택할 수있는 수백 개의 구슬을 제공해야한다. </li><li> 그런 다음 다른 3cm 페트리 접시에 용매의 20 μL 드롭에 약 100 μm의 직경 비즈를 전송하는 데 2​​ μL로 설정 P2 피펫을 사용합니다. </li><li> 20 μL 피펫과 2 μL 피펫과 잔류 용매와 용매 제거합니다. 약 20 μL를 적용 할로 교체하십시오. 주 : 일관성 (또는 이제까지 용매가 사용되는) DMSO에 100 μM의 농도로 약물을 용해 들어일부 작은 분자 억제제 -80 ° C에서 20 μL 및 저장소로 나누어지는이 불안정하고 반복 동결 융해를 방지하는 것이 가장 좋습니다. 필요한 경우 다음 구슬을 몸을 담근 전에 원하는 농도로 약물을 희석. 효과적인 농도는 각각의 약물에 대한 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 1 시간 동안 품어. 이러한 분자의 대부분은 민감한 빛으로 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 물에 용해 2 % 페놀 레드의 20 μL에 2 μL로 설정 P2 피펫으로 전송에게 4-5 구슬을 이식하기 전에. 구슬을 시각화하기 위해 스테레오 해부 현미경을 사용하여이 단계를 수행합니다. 고급 시계 제조 집게와 단일 비드 또는 와이어 루프를 제거하고 배아에 전송하기 전에 PBS로 씻어. 이 활동의​​ 손실이 발생할 수 있으므로 사용하기 전에 15 분 이상 2 % 페놀 빨간색 구슬을 두지 마십시오. </li></ol> 3. 텅스텐 바늘을 준비 <ol><li> 3-4cm 길이로 미세 텅스텐 와이어를 잘라. 의 끝 부분에 와이어의 한 조각을 삽입분젠 버너에 유리 파스퇴르 피펫과 녹아은 위치에 고정합니다. 그들이 사용하는 동안 손상된 경우 여분이 있다는 것을 확인하기 위해 10 바늘까지 준비합니다. </li><li> 토치 불꽃으로 와이어의 끝을 배치하고 (2 ~ 3 분 정도) 텅스텐 흰색으로 점등과 끝이 날카로운 될 때까지 기다립니다. 주 : 사용 중에 바늘은 세정 될 수 있으며, 필요에 따라 토치에 re-은 날카롭게. 주의 : 이러한 바늘은 또한 비드를 전송하는 루프를 만들기 위해 사용될 수있다. 부드럽게 벤치에 바늘을 터치하고 그 루프를 형성하도록 구부려 것이다. </li></ol> 구슬 이식 4. 준비 배아 <ol><li> 그들이 원하는 단계 (대부분의 사지 꽃 봉오리 조작 3-5 일)에 도달 할 때까지 무딘 끝이 위로 알을 품어. 쉘을 중단 한 후 껍질을 제거하고 배아를 노출하는 집게를 사용하는 무딘 끝에 무딘 집게 탭을 사용. 달걀 껍질 막 않도록 확인도 제거됩니다. 참고 : PBS의 1-2 ml를 지원하기 위해 파스퇴르 피펫으로 추가 할 수 있습니다이 멤브레인은 노른자을 고수합니다. 부드럽게, 노른자의 표면에 PBS를 피펫 노른자를 손상하지 않도록주의하면서 집게로 막을 잡고 살짝 떨어져 계란에서 잡아 당깁니다. </li><li> 10 ML의 주사기와 계란 19 G 바늘에서 알부민 5 ㎖까지 제거합니다. 배아 생존율을 감소시킬 수있다 큰 볼륨의 제거와 같은 계란을 밀봉하는데 사용되는 테이프와 접촉하지 않는 배아를 보장하기 위해 필요한만큼만 받아. </li><li> 배아는 15 (100) U 페니실린을 포함하는 PBS ml의 0.1 mg의 스트렙토 마이신 / ml의 예술가 인도 잉크의 5-6 방울을 추가 시각화합니다. 0.5을 주입 ml로 직접 1 ML의 주사기와 배아와 25 G 바늘 아래. </li><li> 탈수하지 않는 배아를 보장하기 위해 난자에 1 % 소 태아 혈청과 100 U 페니실린과 0.1 mg의 스트렙토 마이신 / ml의 PBS의 2-3 ML을 추가합니다. 날카롭게 시계 제작자의 집게를 사용하여 난황 막을 제거하고 개발 사지 싹 통해 양막을 엽니 다. 배아가 건조하지 않도록하고필요한 경우, 더 PBS / FCS를 추가합니다. 참고 : 사지 싹이 명확 배아의 측면에 쌍의 outgrowths로 볼 수있다. 이 단계에서 배아는 오른쪽이 일반적으로 가장 위에 켜집니다. 결과는 오른쪽 팔다리에 구슬을 접목과 반대측 컨트롤과 같은 왼쪽 사람을 사용하는 일반적으로 쉽습니다. </li><li> 비드가 이식 될 사지 꽃 봉오리에 절개를 만들기 위해 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용합니다. 젊은 단계에서이 어렵지만 가능한 사지 꽃 봉오리를 통해 모든 방법을 절단하지 마십시오. 참고 : 구형 배아 (HH 스테이지 22 이상)에서는 그 래프팅뿐만 사지 자체가 작은 봉오리 같이이 더 어렵 이하 단계에서 사지 싹의 특정 영역을 선택할 수있다. 그것은 사지 봉오리 그래서, 특히 젊은 단계에서, 비드는 근위 사지에 남아 이식 비드지나 성장할 것을 기억하는 것이 중요하다. </li><li> 어느 극세 WA를 이용한 성장 인자 또는 약물 중 하나에서 비드 데리tchmakers 집게 또는 텅스텐 바늘로 만든 루프. 비드가 DMSO 또는 페놀 레드 하나에 침지 된 경우, 배아에 적용하기 전에 PBS로 헹군다. 집게 / 와이어 루프와 배아에 구슬을 전송합니다. 그런 다음 절개로 비드를 삽입 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용합니다. </li><li> 배아가 수화 유지되도록 보장 계란에 PBS / FCS의 1-2 ML을 추가하지만이 배아를 손상 비드가 빠질 될 수 있습니다로 배아 자체에 직접 적용하지 마십시오. 테이프로 계란을 밀봉하고 인큐베이터로 돌아갑니다. </li></ol>

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오보에서 조직 개발에 직접 적용 비드 이식편의 사용은 그들이 적용되는 발달 단계 및 노출 기간에 걸쳐 탁월한 제어를주는 개발 중에 성장 인자 신호 전달의 역할을 해부 강력한 도구이다. 분자의 각 유형에 대한 비드의 선택은 중요하다. 그것은 각각 실험적 이들 비드에 억제제의 효과를 시험 할 필요가 있지만, 여기에 설명 된 이러한 억제제 및 레티노 산 작은 소수성 분자는 보통 유도 AG 1-X2 비드에 잘 결합한다. 유사 성장 인자 것이 비드의 다른 유형을 테스트 할 필요가있을 수있다. 일부 구슬 이식을 수행 할 수있을만큼 오랫동안 그 레이블을 것이다 조작하지만 PBS에 린스 페놀 레드 짧은 치료 기간 동안 시각화하기 어려울 수 있도록 투명하고 있습니다. 구슬을 준비 할 때, 특히 억제제로 적셔되어있는S, 그것을 가능한 한 광으로부터 보호하는 것이 중요하다. 초기 치료 기간 동안 및 조작하는 동안 그들은 포함되어야하고, 구슬이 ...

조류 배아는 몇 년 1 개발의 연구를위한 강력한 도구를 제공하고 있습니다. 가장 유용한 특징 중 하나는 상대적으로 쉽게 조작 할 수 있다는 것이다. 외부 개발은 세포의 운명 2,3- 연구를위한 고전 메추라기 병아리 키메라 시스템과 같은 예를 포함하여 다양한 micromanipulations를 배아 액세스하는 달걀을 열고 수행하는 것을 가능하게 개발 4,5- 동안 특정 조직에서 과발현을위한 레트로 바이러스의 주입 및 이식편 문화는 발달 신호 소스 (6)를 식별합니다. 최근에 GFP를 발현하는 형질 전환 닭 줄에서 이식과 레이블이없는 호스트 사이에 발생하는 키메라 고전 이식 및 유전자 변형의 조합이 개발 7,8에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 조류 배아 조작 될 수있는 용이성을 사지 공부 그것을 우수한 모델을 만들었다개발 9. 생체 현상 사지 특정 성장 인자의 적용은 사지 10,11 패터닝을 변경하고이 프로세스 (12)에 대한 통찰력을 제공하고 요소를 식별하는 수단이되고있다. 이 접근법은 또한 근육 발달을 조절하는 인자를 연구하는 데 사용되었으며, 이러한 Wnts 13, 14, BMPs에 HGF (15) 같은 다양한 신호들에 대한 역할을 밝혀냈다. 최근 이러한 기술은 사지 싹 근육 조직의 유전자 발현을 제어하는 신호를 조사하기 위해 사용되었으며, FGF18 및 레티노 산 사이의 상호 작용이 MyoD 식 (16)의 타이밍을 제어 할 수 있음을 보여 주었다. 비드 상에 로딩하고 정의 발달 단계에서 특이 조직에 직접 그래프트 될 수 성장 인자 및 작은 분자의 조합을 이용하여 개발 중에 거의 모든 시간과 지역을 개입 할 수있는 기회를 제공한다. 이것은 INVE하는데 사용 된체절 패터닝 17, 18, ​​신경 사양 (19), 신경 크레스트 마이그레이션 (20)과 축 연장 (21)를 포함하여 많은 프로세스를 stigate. 여기에서 우리는 닭 사지 개발에 중 성장 인자 또는 억제제에 배어 구슬을 접목하는 방법을 설명합니다. 이것은 계내 혼성화에 근육과 특정 유전자의 발현을 분석하여 이들 신호 근육 생성에 미치는 영향을 결정하기 위해 사용되어왔다. 우리는 레티노 산 또는 특정 신호 전달 경로의 소분자 저해제로서 작은 소수성 분자에 대한 성장 인자, 또는 AG 1-X2 구슬에 사용되는 헤파린 침지 비드를 사용하여 이식 조직을 설명한다. 그러나 다른 구슬도 FGFs (22)과 쉬 (23)을 모두 전달하는 데 사용 된 어떤 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>헤파린 아크릴 비즈</td><td>시그마</td><td>H5263</td><td>사용된 아크릴-헤파린 비즈는 단종되었습니다. 그러나 교체 제품, Heparin agarose beads, cat no H6508을 사용할 수 있습니다. 이들은 투명하여 작업하기가 더 어렵지만 AG 1-X2 비드,</td></tr> <tr><td>AG 1-X2 비드,</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel 블루 비드,</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>이 비드는 Shh 및 FGFs를 포함한 다양한 성장 인자와 함께 사용되었으며 헤파린 비드</td></tr><tr><td>FGF18</td>, <td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>을 대체하는 데 사용할 수 있습니다.0/1% BSA로 PBS에 재현탁하고, 0.5-1ul의 일회용 부분 표본을 준비하고, -80°C에서 보관합니다. 배치 및 공급업체는 다양할 수 있으므로 효과적인 용량을 결정하기 위해 다양한 농도를 테스트해야 합니다.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>셀 신호</td><td>9903</td>은 <td>DMSO에서 20mM 재고로 만들고 -80°C에서 일회용 분취액에 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>DMSO에 재현탁하고 -80°C의 일회용 분취액에 보관하십시오. 빛으로부터 보호하십시오.</td></tr><tr><td>블랙 인디언 잉크</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td> <td>이 제품에 대한 대안을 사용할 수 있지만 일부 잉크는 배아에 독성이 있으므로 주의해야</td></tr> 합니다<tr><td>. 텅스텐 와이어, 직경 0.1mm 99.95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>PBS/잉크 및 PBS/FCS에서 100X 희석</td></tr></tbody></table>

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

닭 배아를 사용하여 직접 성장 인자 또는 유전자 발현 및 신호 전달 경로의 활성화에 대한 신호 경로의 어느 특정 억제제의 효과를 테스트 할 수있다. 이 기술은 특정 시간에 대한 정확한 정의 발달 단계에서 신호 전달 분자의 전달을 허용한다. 이 배아 수확 및 유전자 발현 원위치 혼성화, 또는 면역 염색으로 관찰 신호 전달 경로의 활성화에 의해, 예를 들어, 검사 될 수 후. U0126, MEK 억제제에 적신이 FGF18에 배어 비디오 헤파린 구슬 또는 AG 1-X2 구슬, OVO에서 사지 꽃 봉오리에 이식된다. 이 FGF18가 U0126에 의해 억제된다 MyoD 및 ERK의 인산화 및 내인성 및 FGF18 유도 모두 MyoD 발현의 발현을 유도 것을 보여줍니다. 레티노 산 길항제에 배어 구슬은 FGF18에 의해 조기 MyoD 유도를 강화시킬 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 우리가 될 수 있습니다다른 성장 인자 및 억제제와의 광범위한 혼성 쉽게 배아에서 다른 조직으로 구성된다.

HH 단계에서 21 MyoD는 염색이 개발 somites (그림 1A)의 myotome에서 볼 수 있지만, 사지 근육 아세포 개발에 표시되지 않습니다. 그림 1B는 FGF18 구슬 이식 다음 MyoD 6 시간 동안 현장 하이브리드에 보여줍니다. 사지 반대측에는 발현은 없지만 MyoD 비드 부근 아세포에서 유도된다. U0126에 배어 구슬, MEK, MyoD (그림 1C)의 블록 FGF18 유도의 특정 억제제를 공동 이식. 마찬가지로 HH 단계 (21)에서 U0126 비드를 접목하고 24 시간이 치료 반대측 사지 (그림 1D, E)에 비해 MyoD의 내생 발현을 감소 후 MyoD 식을 찾고. HH 단계 19 FGF18에서 사지 싹에서 MyoD (그림 1 층)을 유도하지 않습니다. Figu</stro...

성장 인자 또는 신호 전달 경로의 특정 억제제에 적신 구슬을 발달 중인 배아에 접목함으로써 생체 내에서 그 효과를 직접 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 비드를 사지 싹에 이식하여 이러한 분자가 유전자 발현 및 신호 전달에 미치는 영향을 확인합니다.

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 성장 인자와 억제제가 발달 중인 닭 배아 사지의 유전자 발현에 미치는 영향을 결정하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 신호 전달 분자가 체내(in vivo)에서 세포의 성장과 분화에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이러한 인자들을 배아에서 직접 테스트할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.이 방법은 사지 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경 조직, 체절 또는 낭배 형성과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Rebeea Mohammed가 진행하겠습니다. 우선, 원래의 스톡 용액에서 1 mL의 비즈를 새 튜브로 옮기십시오.비즈를 침전시킨 후 액체를 제거하고, 1 mL의 PBS로 교체합니다. 이 단계를 5회 반복하고 세척된 비즈를 PBS 슬러리 상태로 4 °C에서 보관합니다. 20 µL 피펫을 사용하여 세척된 스톡 용액에서 접합용 비즈를 선택하여 1 mL의 PBS에 넣습니다.실체 현미경을 사용하여 직경이 약 100 µm인 비즈를 선택합니다. 선택한 비즈를 2 µL의 액체와 함께 PBS 20 mL 방울이 담긴 새 페트리 접시로 옮긴 후, 비즈에서 PBS를 제거합니다. 먼저 20 µL 피펫으로 제거하고, 그 다음 미세 시계 제작용 핀셋을 사용하여 모세관 현상으로 잔류 액체를 제거합니다.성장 인자를 비드에 추가할 때 희석되지 않도록 가능한 한 많은 액체를 제거하는 것이 중요합니다. 성장 인자를 비드 위에 직접 피펫팅하십시오. FGF18의 경우, 0.1% BSA가 포함된 PBS에서 0.5 mg/mL로 재구성된 재조합 FGF18 0.5 µL를 추가합니다.그 후, 액체가 증발하는 것을 방지하기 위해 디시 가장자리에 물을 몇 방울 떨어뜨립니다. 준비가 되면 비드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 파스퇴르 피펫을 사용하여 디시에서 물방울을 제거하고 디시를 얼음 위에 놓습니다.먼저 스패튤라를 사용하여 비드를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 비드를 유도체화합니다. 그다음, 0.2 N formic acid 1 mL를 첨가하고 쉐이킹 플랫폼에서 1시간 동안 비드를 산성 용액 내에서 배양합니다. 이어서 비드가 가라앉도록 둔 후, formic acid를 제거하고 1 mL의 물로 대체합니다.흔들림 플랫폼(shaking platform) 위에서 비즈를 1시간 동안 세척하고, 잔류 포름산을 제거하기 위해 이 세척 과정을 6회 반복합니다. 마지막 세척 후 남은 액체를 제거하고 비즈를 4 °C에서 보관합니다. 스패튤라를 사용하여 보관된 비즈에서 약 5~10 µL 부피의 소량을 덜어내어 30 mL 페트리 접시에 옮깁니다.그 다음, 1 mL의 DMSO를 첨가합니다. 이어서 2 μL로 설정된 P2 피펫을 사용하여, 지름 약 100 μm의 비즈를 다른 30 mL 페트리 접시에 담긴 20 μL의 용매 방울로 옮깁니다. 20 μL 피펫을 사용하여 용매의 대부분을 제거하고, 남은 잔류 용매는 2 μL 피펫으로 제거합니다.그 후, DMSO에 용해된 처리 예정 약물 20 µL를 비드에 가하여 덮어줍니다. 비드를 약물 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 많은 약물 분자가 빛에 민감하므로 비드를 차광 처리하십시오.비드를 시각적으로 확인하기 위해, 2 µL의 액체에 담긴 4~5개의 비드를 2% phenol red 수용액 20 µL에 옮깁니다. 정밀 시계 제작용 핀셋을 사용하여 비드 하나를 꺼낸 후 PBS로 세척합니다. 세척 전 phenol red 용액에 비드를 15분 이상 방치하지 마십시오. 이는 활성 손실을 유발할 수 있습니다.가는 텅스텐 와이어를 3~4 cm 길이로 자릅니다. 그런 다음, 와이어 한 조각을 유리 파스퇴르 피펫 끝부분에 삽입하고 분젠 버너로 가열하여 녹여 고정합니다. 와이어가 손상되었을 때를 대비해 예비용을 포함하여 최대 10개의 니들을 준비합니다. 다음으로, 와이어 끝을 토치 불꽃에 넣고 텅스텐이 하얗게 빛나며 끝이 날카로워질 때까지 유지합니다.이 과정은 약 2~3분 정도 소요됩니다. 1mL당 100 units의 Penicillin과 0.1 mg의 Streptomycin이 포함된 15 mL의 PBS에 아티스트용 인디아 잉크를 5~6방울 추가합니다. 닭 배아를 준비하려면, 대부분의 사지 싹 조작에 적합한 단계인 통상 3~5일이 될 때까지 알의 뭉툭한 끝부분이 위로 향하게 하여 배양합니다.원하는 시점에 도달하면, 뭉툭한 핀셋을 사용하여 알의 뭉툭한 끝부분을 두드려 껍질을 깨뜨립니다. 그런 다음 핀셋으로 껍질을 제거하여 배아를 노출시킵니다. 이때 난세포막도 함께 제거되었는지 확인하십시오.배아를 시각화하기 위해, 1mL 주사기와 21게이지 바늘을 사용하여 배아 아래에 아티스트 인디아 잉크를 몇 방울 섞은 PBS를 주입하십시오. 그 후, 배아를 덮고 있는 난황막을 미세 핀셋으로 제거할 수 있습니다. 다음으로, 배아가 건조해지지 않도록 1% fetal calf serum, 100 units/mL Penicillin 및 0.1 mg/mL Streptomycin이 첨가된 PBS 2~3mL를 난자 내에 추가하십시오.날카로운 시계 제작용 핀셋을 사용하여 발달 중인 사지 싹 위의 양막을 엽니다. 이 단계에서 배아는 보통 오른쪽이 위로 오도록 회전합니다. 필요할 때마다 보충된 PBS 용액을 더 추가하여 배아가 건조해지지 않도록 하십시오.발생 중인 사지를 노출시키기 위해 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 배아를 둘러싸고 있는 양막을 엽니다. 그다음, 날카롭게 다듬은 텅스텐 와이어를 사용하여 비드가 이식될 사지 싹에 절개창을 냅니다. 가능한 한 사지 싹을 완전히 절단하지 않도록 주의하십시오.어린 단계에서는 이것이 어렵습니다. 초정밀 시계 제작용 핀셋을 사용하여 성장 인자 또는 약물이 코팅된 비드를 집어 올립니다. 비드가 DMSO 또는 페놀 레드에 담가져 있었다면, 배아에 적용하기 전에 반드시 PBS로 헹궈내십시오.포셉을 사용하여 비드를 배아로 옮긴 후, 뾰족하게 가공된 텅스텐 와이어를 이용해 절개 부위에 비드를 삽입합니다. 배아의 수분 상태를 유지하기 위해 보충된 PBS 용액 1~2 mL를 난자에 추가로 넣습니다. 이때 용액을 배아에 직접 가하면 배아가 손상되거나 비드가 이탈될 수 있으므로 주의하십시오.다음으로, 19게이지 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 배아가 알을 밀봉하는 데 사용된 테이프에 닿지 않을 정도의 알부민만 제거합니다. 바늘을 껍질 안쪽 벽을 따라 미끄러지듯 내려 넣어 노른자가 손상되지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 테이프로 알을 밀봉하여 인큐베이터로 다시 옮깁니다.FGF18이 MEK를 통해 ERK를 인산화할 수 있는지 확인하기 위해, 비드 이식 1시간 후에 배아를 수확하여 인산화된 ERK의 존재 여부를 면역 염색하였으며, 이는 오른쪽 이미지에서 이식된 비드 주변에서 확인할 수 있습니다. HH 단계 21에서 MyoD는 발달 중인 사지 근아세포에서 발현되지 않습니다. 다만, 발달 중인 체절의 근절에서는 염색이 관찰될 수 있습니다.FGF18 비드 이식 6시간 후, 비드 근처의 근아세포에서 MyoD의 유도를 확인할 수 있습니다. 반면, 반대측 사지에서는 발현이 나타나지 않습니다. 이러한 발현은 U0126과 같은 MEK 억제제를 코팅한 비드를 함께 이식함으로써 억제될 수 있습니다.마찬가지로, HH 단계 21에서 U0126 비드를 이식하면 처리를 하지 않은 반대측 사지에 비해 24시간 후 MyoD의 내인성 발현이 감소합니다. HH 단계 19의 사지아(limb bud)에서 FGF18은 MyoD를 유도하지 않습니다. 하지만 FGF18과 레티노산 길항제(retinoic acid antagonist)를 적신 비드를 함께 이식하면 이를 극복할 수 있으며, 이소성 MyoD가 검출됩니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4분 내에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 발생 생물학 분야의 연구자들은 배아 발달 과정에서의 성장 인자 신호 전달을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 기술을 시도할 때 배아가 건조해지지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 성장 인자 신호 전달이 발달에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 발달 중인 배아에 비드를 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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