유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 닭 배아 팔다리의 유전자 발현에서 성장 인자와 억제제의 효과를 결정하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 신호 분자가 생체 내 세포의 성장과 분화에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배아에서 이러한 요인을 직접 테스트할 수 있는 방법을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 사지 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 신경 조직, 염색체 또는 위장 형성과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Rebeea Mohammed입니다. 시작하려면 원래 원액에서 1ml의 비드를 새 튜브로 옮깁니다.

구슬이 가라앉을 때까지 기다린 다음 액체를 제거하고 1ml의 PBS로 교체하십시오. 이 단계를 5회 반복하고 세척된 비드를 섭씨 4도에서 PBS의 슬러리로 보관합니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 세척된 원액에서 비드를 제거하고 1ml의 PBS에 넣어 접목할 비드를 선택합니다.

입체경을 사용하여 직경이 약 100미크론인 구슬을 선택합니다. 선택한 비드를 2마이크로리터의 액체에 넣고 20밀리리터의 PBS 방울이 들어 있는 새 페트리 접시에 옮깁니다.그런 다음 비드에서 PBS를 제거합니다. 먼저 20 마이크로 리터 피펫으로 미세한 시계 제작자의 집게를 사용하여 모세관 작용으로 잔류 액체를 제거합니다.

비드에 첨가할 때 성장 인자가 희석되지 않도록 가능한 한 많은 액체를 제거하는 것이 중요합니다. 성장 인자를 비드에 직접 피펫으로 분사합니다. FGF18의 경우 0.5 마이크로 리터의 재조합 FGF18을 추가하고, 재구성된 경우 0.1% BSA로 PBS에 밀리리터당 0.5 밀리그램을 추가합니다.

그런 다음 액체가 증발하는 것을 방지하기 위해 접시 가장자리에 물 몇 방울을 떨어뜨립니다. 준비가 되면 실온에서 1시간 동안 구슬을 배양합니다. 배양 후 파스퇴르 피펫으로 접시에서 물방울을 제거하고 접시를 얼음 위에 놓습니다.

먼저 주걱을 사용하여 비드를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 비드를 유도체화합니다. 그런 다음 0.2 일반 포름산 1ml를 넣고 진반 플랫폼에서 산의 비드를 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 구슬이 가라 앉을 때까지 기다렸다가 포름산을 제거한 다음 1ml의 물로 교체하십시오.

진탕 플랫폼에서 비드를 1시간 동안 세척하고 세척을 6회 반복하여 잔류 포름산을 제거합니다. 마지막 세척 후 남은 액체를 제거하고 비드를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 주걱을 사용하여 스톡에서 약 5-10 마이크로 리터 용량의 작은 구슬 팔레트를 제거하고 구슬을 30 밀리리터 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 1ml의 DMSO를 추가합니다. 다음으로, 2 마이크로 리터로 설정된 P2 피펫을 사용하여 직경이 약 100 미크론 인 비드를 다른 30 밀리리터 페트리 접시에 20 마이크로 리터 용매 방울로 옮깁니다. 20 마이크로 리터 피펫으로 대량의 용매를 제거하고 2 마이크로 리터 피펫으로 잔류 용매를 제거합니다.

그런 다음 DMSO에 용해 된 20 마이크로 리터의 약물로 비드를 덮습니다. 약물 용액에 비드를 1시간 동안 배양합니다. 많은 약물 분자가 빛에 민감하므로 비드를 빛으로부터 보호하십시오.

비드를 시각화하는 데 도움이 되도록 2마이크로리터의 액체에 4-5개의 비드를 물에 용해된 20마이크로리터의 페놀 레드로 옮깁니다. 고급 시계 제작자의 집게로 단일 구슬을 제거하고 PBS로 구슬을 헹굽니다. 활성 손실의 원인이 될 수 있으므로 헹구기 전에 페놀 레드 용액에 비드를 15분 이상 두지 마십시오.

미세한 텅스텐 와이어를 3-4cm 길이로 자릅니다.그런 다음 와이어 한 조각을 유리 파스퇴르 피펫 끝에 삽입하고 분젠 버너에 녹여 제자리에 고정합니다. 손상된 경우 예비 바늘이 있는지 확인하기 위해 최대 10개의 바늘을 준비하십시오. 다음으로, 와이어의 끝을 토치 화염에 넣고 텅스텐이 하얗게 빛나고 끝이 날카로워질 때까지 그대로 유지합니다.

이 작업은 약 2-3분 정도 걸립니다. 100 단위의 페니실린과 밀리리터당 0.1 밀리그램의 스트렙토마이신을 함유한 PBS 15 밀리리터에 아티스트 인디아 잉크 5-6방울을 첨가하십시오. 닭 배아를 준비하려면 대부분의 사지 새싹 조작을 위해 원하는 단계(일반적으로 3-5일)에 도달할 때까지 뭉툭한 끝으로 알을 품습니다.

원하는 시점에 도달하면 뭉툭한 집게를 사용하여 달걀의 뭉툭한 끝을 두드려 껍질을 깨뜨립니다. 그런 다음 집게를 사용하여 껍질을 제거하고 배아를 노출시킵니다. 난자 세포막도 제거되었는지 확인하십시오.

배아를 시각화하기 위해 아티스트 인디아 잉크 몇 방울을 보충한 PBS를 배아 아래에 1밀리리터 주사기와 21게이지 바늘로 주입합니다. 그런 다음 배아 위에 있는 유리막을 미세한 집게로 제거할 수 있습니다. 다음으로, 태아 송아지 혈청 1%, 페니실린 100단위, 스트렙토마이신 1밀리리터당 0.1밀리그램이 함유된 PBS를 2-3밀리리터를 난자에 첨가하여 배아가 탈수되지 않도록 합니다.

날카로운 시계 제작자의 집게를 사용하여 발달 중인 사지 새싹 위에 양막을 엽니다. 이 단계에서 배아는 일반적으로 회전하여 오른쪽이 가장 위쪽이 됩니다. 필요할 때 보충된 PBS 용액을 더 추가하여 배아가 건조되지 않도록 합니다.

배아를 둘러싼 양막은 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 열어 발달 중인 팔다리를 드러낼 수 있습니다. 그런 다음 날카로운 텅스텐 와이어를 사용하여 비드가 이식될 사지 새싹을 절개합니다. 가능하면 사지 새싹을 끝까지 자르지 마십시오.

비록 어린 단계이기는 하지만, 이것은 어려운 일이다. 성장 인자 또는 약물로 코팅된 비드를 매우 미세한 시계 제작자의 집게를 사용하여 집습니다. 비드가 DMSO 또는 페놀 레드에 담근 경우 배아에 적용하기 전에 PBS로 헹궈야 합니다.

겸자를 사용하여 비드를 배아로 옮긴 다음 날카로운 텅스텐 와이어를 사용하여 절개 부위에 비드를 삽입합니다. 배아가 수분을 유지할 수 있도록 보충된 PBS 용액을 1-2ml를 난자에 추가로 첨가합니다. 용액을 배아 자체에 직접 바르면 배아가 손상되고 비드가 빠질 수 있으므로

다음으로, 19게이지 바늘이 장착된 10밀리리터 주사기를 사용하여 배아가 난자를 밀봉하는 데 사용되는 테이프와 접촉하지 않도록 하는 데 필요한 만큼의 알부민만 제거합니다. 바늘이 노른자를 껍질 안쪽으로 밀어 노른자를 손상시키지 않도록 합니다. 마지막으로 테이프로 난자를 밀봉하고 인큐베이터에 다시 넣습니다.

FGF18이 MEK를 통해 ERK를 인산화할 수 있는지 확인하기 위해 비드 이식 1시간 후에 배아를 채취하고 오른쪽 이미지에서 이식된 비드 주변에서 볼 수 있는 인산화된 ERK의 존재에 대해 면역염색했습니다. HH 단계 21에서 MyoD는 사지 근아세포가 발달할 때 발현되지 않습니다. 염색은 발달하는 somites의 근절기에서 볼 수 있습니다.

FGF18 비드 이식 후 6시간 후에 비드 근처의 근아세포에서 MyoD가 유도되는 것을 볼 수 있습니다. 반대쪽 사지에는 표정이 없습니다. 이 발현은 U0126과 같은 MEK 억제제로 코팅된 비드를 공동 그라프팅하여 억제할 수 있습니다.

마찬가지로, HH Stage 21에서 U0126 비드를 이식하면 치료되지 않은 반대쪽 사지에 비해 24시간 후 MyoD의 내인성 발현이 감소합니다. 사지 싹에서 HH 단계 19에서 FGF18은 MyoD를 유도하지 않습니다. 그러나 FGF18에 적신 비드와 레티노산 길항제의 동시 이식은 이를 극복할 수 있으며 이소성 MyoD가 검출됩니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행한다면 3-4분 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 개발로 발달 생물학 분야의 연구자들은 배아 발달 신호를 보내는 성장 인자를 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 기술을 시도하는 동안 배아가 마르지 않도록 하는 것이 중요하다.

이 비디오를 시청한 후에는 성장 인자 신호가 발달에 어떤 영향을 미치는지 결정하기 위해 발달 중인 배아에 구슬을 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.