유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

이 절차의 전반적인 목표는 인플루엔자의 부착 및 내재화를 측정하는 것입니다. 5 49 폐 상피 세포로 들어가는 바이러스 입자. 이것은 5 49 세포에 대한 바이러스인 인플루엔자에 의한 첫 번째 저온 결합에 의해 이루어지며, 이는 부착을 허용하지만 바이러스 입자의 흡수를 방지합니다.

다음으로, 바이러스는 온도를 섭씨 37도로 변화시켜 내재화할 수 있습니다. 그런 다음 라벨링되지 않은 strp Aden이 세포 표면에 결합되는 차단 단계입니다. 부착된 바이러스는 부착된 바이러스 입자와 내재화된 바이러스 입자를 구별하기 위해 수행됩니다.

마지막으로, 세포 관련 비오틴화 바이러스를 CY 3 표지 스트렙타비딘으로 배양하고 유세포 분석을 사용하여 염색된 바이러스를 검출합니다. 최종적으로, 부착 및 내재화된 바이러스의 상대적인 양이 계산됩니다. 이 방법은 인플루엔자의 상대적인 양에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 바이러스는 5 0 9 세포에 부착하여 내재화합니다.

그것은 또한 다른 세포주를 사용하여 다른 체계에 적용될 수 있습니다 또는 다른 바이러스는 biotinylated 바이러스를 생성하고 레테르를 붙인 바이러스 연쇄상구균 din 및 SI 3 레테르를 붙인 연쇄상구균 din의 필요한 양을 결정하기 후에 원본 의정서에 따라, 200, 000, 000, 0 분으로 관을 레테르를 붙인 A 5 49의 세포를 각각 포함하는 4개의 깊은 좋은 관을 준비합니다. 0분, STV, 30분, 30분, STV. 다음으로 튜브를 돌립니다.

상등액을 제거하고 200마이크로리터의 PBS를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 튜브를 다시 회전시킨 후 5 49 표준 성장 배지 200마이크로리터를 사용하여 세포를 재현탁시키고 배양 후 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 샘플을 원심분리하고 펠릿을 PBS 200마이크로리터에 재현탁합니다. 세척을 한 번 더 반복한 후 얼음에서 튜브를 10분 동안 냉각합니다. 튜브가 냉각되면 다시 회전하고 감염 PBS에 희석된 100마이크로리터의 비오틴화 바이러스를 사용하여 얼음에서 1시간 동안 배양한 후 펠릿을 다시 현탁시키고 스핀을 반복하고 PBS로 두 번 세척하고 0분 샘플에 대해 가능한 한 많이 다음 샘플을 병렬로 처리합니다.

회전 후 100마이크로리터의 3.7% 파라폼 알데히드 또는 PFA를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 회전시키고 고정 후 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 모든 샘플이 처리될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

0분 플러스 STV 샘플을 처리하려면 튜브를 돌리고 상등액을 제거한 다음 PBS에 15마이크로리터의 STV 2% BSA 및 0.1%sodium azi를 사용하여 세포 펠릿을 얼음에서 30분 동안 다시 부유시킵니다. 그런 다음 원심분리기를 사용하여 PBS를 사용하여 PFA로 고정 한 후 30 분 샘플에 대해 섭씨 4도에서 샘플을 두 번 세척합니다. supernat를 회전시키고 제거한 후 PBS 2%BSA를 사용하여 샘플을 용해시킵니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후 PBS로 세척하고 PFA로 고정합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 보관하고 STV 샘플을 추가합니다. 펠릿화 후, 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후 PBS 2%BSA 200마이크로리터에 샘플을 현탁시킵니다.

PBS의 STV 2%BSA 0.1%Sodium azi 50마이크로리터에 세포를 회전시키고 ICE에서 30분 동안 배양한 후 세척 및 고정합니다. 그런 다음 모든 샘플을 STV SI 3으로 투과하고 염색한 후 텍스트 프로토콜의 세부 사항에 따라 샘플을 섭씨 4도에서 보관했습니다. 마지막으로, 유세포 분석으로 샘플을 분석합니다.

각 샘플에서 CY 3개의 양성 세포의 백분율을 결정합니다. 부착된 바이러스의 비율과 내부화된 바이러스의 상대적인 양을 계산합니다. 여기에 표시된 0분 샘플과 같은 텍스트 프로토콜에 따르면, 감염된 바이러스는 St.V.SI 3가지 염색으로 시각화된 바와 같이 표적 세포에 냉간 결합되어 있습니다.

STV를 차단 단계로 적용하면 세포 표면의 바이러스가 더 이상 S St.V.SI 3 염색으로 검출되지 않아 신호가 크게 감소합니다. 온도를 37°C까지 올리면 부착된 바이러스가 세포 속으로 흡수됩니다. 내부화된 바이러스는 표지되지 않은 STV의 차단에 민감하지 않으므로 표시된 STV 샘플과 30분 동안 신호 강도가 덜 급격히 떨어집니다.

다음은 이 비디오에 설명된 모든 실험 조건에 대한 SI 3개의 양성 세포의 비율입니다. 모의 감염된 세포는 실험을 위한 배경 신호 강도를 제공하고 바이러스 부착에 대한 음성 대조군 역할을 합니다. 또 다른 대조군 뉴라미니다아제는 치료되지 않은 세포에 비해 IAV 부착을 90% 강력하게 폐지합니다.

TP를 고갈시켜 세포내이입(endocytosis)을 억제하는 나트륨 아지(sodium azi)는 감염 중과 감염 후에 바이러스 입자의 내재화를 억제했는데, 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 나트륨 아지(sodium azi) 처리 세포는 동일한 조건에서 배양된 미처리 세포에 비해 내재화가 급격히 감소한 것으로 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 5 0 9 세포에 있는 바이러스인 인플루엔자의 부착 및 내재화를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석으로 편리하게 판독할 수 있으며 다른 실험 설정에 쉽게 적용할 수 있습니다.