Name: 유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 학습하세요 유동 세포 계측법을 이용하여 A549 폐 상피 세포에서 인플루엔자 A 바이러스의 부착 및 내부화를 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 항바이러스 전략 개발에 중요한 바이러스-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 SST에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (31003A_135278)에서 교부금에 의해 지원되었다. MOP는 AXA 연구 기금 박사 보조금의 수혜자입니다. 우리는 그림 1의 디자인에 대한 도움말은 패트리샤 Nigg 감사합니다.

전에 시작 주 : 사용 층류 후드 및 적절한 biocontainment을 라이브 바이러스에 작업 할 때. 여기서는 배양 인플루엔자 바이러스 균주 A / WSN / 33에 적합한 성장 조건을 설명한다. 감염의 다중성 (MOI)와 배양 시간은 사용 바이러스 균주에 따라 달라질 수 있습니다. 바이오틴 / WSN / 33 바이러스의 1. 준비 <ol><li> 시드 Madin-다비 송곳니 kindey (MDCK), 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용하여 2 cm의 T175 플라스크에 세포. 약 70 %의 전면 생장까지 37 ℃에서 배양 된 세포로 진행한다. </li><li> 감염 전에 배지 제거하고 세포 단층을 덮도록 충분한 양을 첨가하여 인산염 완충 식염수 (PBS, pH7.0-7.3)으로 세포를 세척 하였다. </li><li> PBS를 제거하고 10-4의 방어와 A / WSN / 33 세포를 감염. PBS에 바이러스를 희석은 0.02 mg의 마그네슘 2+, 0.01 mg의 칼슘 2 + &lt;보충/ SUP&gt;, 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1 % 펜 / 스트렙토 (감염-PBS). T175의 CM 2 플라스크 4 ml로 접종을 사용합니다. </li><li> 세포를 37 ℃에서 1 시간을 품어. 플라스크에 0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 펜 / 연쇄상 구균 보충 열망과 피펫 (10)의 ML의 DMEM에 의해 접종을 제거합니다. </li><li> 다음 수확 뜨는 볼 수 있으며, 세포 변성 효과 (CPE)까지 약 3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품어. CPE는 분리 셀 (14)의 죽음 뒤에 세포의 반올림으로 인식 될 수있다. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 5 분 동안 450 XG에 뜨는 스핀. 새로운 팔콘 튜브에 뜨는을 전송하고이 단계를 한 번 더 반복한다. 알약을 폐기하십시오. </li><li> 초 원심 분리기 튜브 및 NTE 완충액 (10 mM 트리스 [pH 7.4의, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)에 희석 30 % 수크로오스 5 ㎖와 언더 상청액에 넣고 상청액. 초 원심 분리하기 전에 튜브 균형 및 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 채워. 스핀 superna112,398 XG에 tants은 초 원심 분리기 90 분 (SW28 로터 25,000 RPM에 해당). </li><li> 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS에 4 ℃에서 하룻밤 바이러스 펠렛을 흡수. 로 pipetting 아래로 재현 탁 펠렛. 브래드 포드 분석에 의해 정제하여 15 바이러스의 단백질 함량을 측정한다. </li><li> 비오틴은 / WSN / 33을 생성하는 바이오 틸 키트를 사용합니다. 제조업체의 지시를 따르십시오. </li><li> 간단히, 정제 된 바이러스에 비오틴을 적당량 추가하고 얼음에 2 시간 동안 배양한다. 초 원심 분리기 튜브에 바이러스를 옮기고 30 ㎖의 최종 부피에 도달하는 PBS로 관을 채운다. 초 원심 분리기에서 90 분 동안 112,389 XG에 바이러스를 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고 250 μL PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 밤새 펠렛을 만끽 해보세요. 분취 량은 최소 24 개월 동안 안정 할 것이다 -80 ° C에 보관 비오틴 바이러스를 저장. 참고 :이 바이오틴 (P)의 역가를 결정하는 데 도움이 될 수표준 상패 분석​​에 의해 IAV의 배상. 그러나, 후속 프로토콜 만 비오틴 바이러스 입자를 측정하는 것을 유의해야한다. 불완전한 바이오 틸 unbiotinylated 입자에 남은 플라크 분석으로 아니라 첨부 / 내재화 분석에서 측정 된 신호에 전염성 역가에 기여할 것이다. </li></ol> 2. 바이오틴 바이러스의 필요한 양을 결정 주 : 부착 / 내재화 분석이 수행되기 전에, 그 시료의 모든 세포를 감염시킬 필요 비오틴 바이러스의 양을 결정하는 것이 중요하다. <ol><li> 문화 및 제조자의 지시에 따라 세포를 Trypsinize A549. 셀 챔버를 사용하여 세포를 카운트. FACS 피펫 200,000 A549 세포 튜브 deepwell. 스핀 450 X g에서 3 분. 200 μL PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 쿨 세포 아래로 얼음에 10 분 동안. </li><li> bioti의 5 배 연속 희석을 준비감염 PBS에서 nylated 바이러스 재고. </li><li> 450 x g에서 3 분 동안 4 ℃에서 세포를 포함하는 스핀 튜브. 100 μL 바이러스 함유 감염 PBS로 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 바이오틴 바이러스없이 모의 제어 사용 감염 PBS로. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 품어. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 고정 용, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다. </li><li> 투과성으로 들어, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. 0.5 % 트리톤 X-100을 포함하는 100 μl의 PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 실온에서 6 분 동안 품어. 그런 다음, 2.4에 설명 된 세척 단계)를 반복합니다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거PBS가 STV-Cy3에 함유 희석 50 μL, 2 %의 BSA 등. (참고, STV-Cy3에 적절한 농도는 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다 (1)의 농도로 시작합니다. 배 2 희석 최대 1 200 시험 :. 2400 우리의 손에, 1의 희석 : 입증 1,000 최적합니다.) </li><li> 실온에서 어둠 속에서 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에서 설명하지만 PBS에 희석 200 μL 2 % BSA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 16 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. Cy3에 양성 인구에 문입니다. A549 인구를 Cy3 양성 세포의 최대 수의 결과 비오틴 화 바이러스의 최저 농도를 선택한다. </li></ol> 3. 스트렙 타비 딘의 필수 양을 결정 주 : 세포 바이러스로부터 유래 된 차단 신호의 효율 분석의 검출 범위를 결정한다. 따라서, 가능한 한 많이 STV-Cy3에 신호를 폐지하는 것이 중요하다. 목STV의 필요량이 필요 전자는 (섹션 2에서 결정)를 사용 바이오틴 바이러스 주식의 양에 따라 달라집니다. <ol><li> 단계 2.1-2.4를 수행하지만, 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용합니다. </li><li> PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 STV의 5 배 희석액을 준비한다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 50 μL STV 희석에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 모의 제어 사용함없이 PBS STV는 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨을 함유. 얼음에 30 분 동안 튜브를 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명. </li><li> 단계 2.5-2.9를 수행합니다. 국제화 분석의 경우, (더 STV가 존재하지 않는에서 샘플에 비해)를 Cy3 신호의 강력한 블록의 결과 STV의 가장 낮은 농도를 선택합니다. 이를 위해, CY3 양성 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. 이상적 STV - 처리 샘플의 신호를 Cy3 모의 감염된로부터의 신호에 가까워 야가능한 세포. </li></ol> 4. 첨부 파일 / 내면화 분석 참고 : 분석을 시작하기 전에 모든 시약을 준비해야합니다. 프로토콜에 대한 세 가지 제어 결과 섹션 (모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 사전 처리 된 세포 및 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포)에 제시된 그룹 작은 변화가 필요합니다. <ol><li> 각각 200,000 A549 세포를 함유하는 16 deepwell 튜브를 준비한다. 다음 4 관으로 구성된 실험 세트, 3 제어 조건, 각각의 요구 4 튜브가 : 모의 감염된 세포, 뉴 라미니다 아제 (NA) -pretreated 세포와 아 지드 화 나트륨 처리 된 세포. 각 그룹은 &#39;0 분&#39;, &#39;0 분 + STV&#39;, &#39;30 분 &#39;, &#39;30 분 + STV&#39;로 표시 4 관으로 구성되어 있습니다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 450 X g에서 4 ℃에서 원심 튜브. 뜨는에 resuspend 펠 제거0.3 % BSA, 20 mM의 HEPES, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (배양 배지)을 함유하는 200 ㎕의 DMEM에서 등. 37 ℃에서 30 분 동안 품어. 주 : 사용 세균 뉴 라미니다 아제 (시알 리다 아제 예 비브리오 콜레라부터) ml의 세포를 재현 탁하는 배양 배지에서 희석 / 200 무 농도 : 뉴 라미 제어 옵션. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. 200 μL PBS에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 아래로 그리고,이 단계 시원한 튜브를 한 번 더 반복한다. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 원심 튜브. (감염 PBS에 희석 섹션 2에서 결정된 바이러스 농도를 사용) 바이러스를 비오틴 100 μL에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 얼음에 1 시간을 품어. 그런 다음, 반복 세척 단계는 2.4에 설명. 참고 : 사용하여 감염 PBS 바이러스없이 : 모의에 감염된 제어하십시오. 아 지드 화 나트륨 컨트롤 : 감염 PBS에 희석 사용 바이러스 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li><li> 찬성얼음에 감염 후 샘플의 cessing : <ol><li> 다른 샘플이 고정 될 때까지 &#39;0 분&#39;샘플은 4 ℃에서 단계 2.5 저장 샘플을 따르십시오. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 0 분 + STV &#39;샘플, 스핀 튜브하십시오. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. </li><li> 450 X g에서 3 분간 4 ℃에서 &#39;30 분 &#39;샘플, 스핀 튜브하십시오. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. 주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li><li> &#39;30 분 + STV &#39;샘플 450 x g에서 3 분 동안 4 ° C에서 튜브를 회전. 200 μL PBS가 2 % BSA를 포함에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. 37 ° C에서 30 분을 품어. 그런 다음, 450 x g에서 3 분 4 ° C에서 스핀 튜브. PBS는 2 % BSA 및 0.1 % 나트륨 아 지드를 함유하는 희석 된 50 μL의 STV (섹션 3에서 결정된 농도를 사용하여)에 뜨는 재현 탁 펠렛을 제거 (샘플을 처리하는 동안 내재화를 방지하기 위해). 얼음에 30 분을 품어. 4 ° C에서 단계 2.4-2.5 저장 샘플을 따르십시오. 주 : 아 지드 화 나트륨 제어의 경우 : PBS는 37 ° C에서 30 분간 인큐베이션을위한 2 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충. </li></ol></li><li> 단계 2.6-2.8에 따라 유동 세포 계측법에 의해 샘플을 분석 할 수 있습니다. 각 샘플에 Cy3에 양성 세포의 비율을 결정한다. </li><li> 비율 부착 바이러스 및 내면화 바이러스의 상대적인 양을 계산합니다. <ol><li> 첨부 된 바이러스의 양을 계산하기 위해,는 Cy3-positi의 비율을 사용하여게이트 된 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도를했습니다. 비교를 위해, 100 % (그림 4B)에 처리되지 않은 세포를 설정합니다. 참고 : 첨부 된 바이러스의 비율이 &quot;0 분&quot;샘플에 의해 설명되어 있습니다. </li><li> 내재화 된 바이러스의 양을 계산하기 위해, &quot;30 분&quot;의 샘플 (도 5B)에 「30 분 + STV &quot;시료의 비율을 취. 주의 : 전술 한 바와 같이, 양의 게이트를 Cy3 세포 또는 Cy3에 신호의 평균 형광 강도의 비율이 사용될 수있다. </li></ol></li></ol>

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우리의 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 바이러스 첨부 파일 및 내재화를 측정하는 쉬운 방법을 설명합니다. 또한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 사용에 비해 더 가깝게 모방하는 바이러스 감염 표지 야생형 바이러스의 사용을 허용한다. 우리 프로토콜 IAV의 부착 및 내재화를 측정하는 데 최적화되어 있지만 이는 다른 바이러스를 쉽게 적용 할 수있다. 유동 세포 계측법은 판독에 사용되는 바와 같이 또한, 공동 착색을 용이하게 목적 단백질의 과발현 다음 최저 또는 발현 수준을 테스트하기 위해 프로토콜 등을 첨가 할 수있다. 따라서, 분석은 개인의 필요에 따라 프로토콜의 변형을 허용한다. 참고로, 분석은 또한 운동 시간 정보를 통해 바이러스 내재화를 측정하고 얻기 시점 일련에 대하여 수행 될 수있다. 분석 알 수없는 국제화 반응 속도와 다른 바이러스 적용 할 것 인 경우에 특히 중요 할 수 있습니다. 하우버전, 그것의 검출 창 인해 바이러스 복제의 부재에의 부착 또는...

인플루엔자 바이러스 (IAV)의 엔트리 (1) 표적 세포의 세포막 수용체에 바이러스의 결합으로 시작 다단계 공정이다. IAV의 수용체는 당 단백질과 당지질의 큰 다양성에 존재하는 시알 산이다. 바이러스 엔벨로프에 존재 IAV의 헤 마글 루티 닌 (HA) 단백질은 시알 산에 결합함으로써 표적 세포 (2)의 세포막에 바이러스 입자의 부착을 매개한다. 바이러스는 3-6 설명되었다 클라 트린 매개 엔도 시토 시스를 통하여 세포뿐만 아니라, macropinocytosis 같은 대체 입력 경로를 들어간다. HA 및 시알 산 사이의 상호 작용은 모두 중재 첨부 파일 및 바이러스 입자 (7)의 내재화를 유발하기에 충분한 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 엔트리 수용체가 제안되었으며, IAV 항목의 역할은 현재 1,8,9을 연구되고있다. 똥개다발 적 노력 시급 신규 항 바이러스 요법 10-12을 개발 목표로 바이러스의 라이프 사이클에 관여하는 숙주 요인을 파악하게된다. 바이러스 엔트리는 그 최초의 지점에서 바이러스 감염을 차단하기 위해 IAV 성장 타겟팅 유리한 공정이 될 것이다. 바이러스 보통 다량 들어오는 바이러스를 검출하는 데 필요한대로 IAV 항목의 여러 단계를 측정하는 것은 실험적으로 도전. 또한, 바이러스 엔트리의 변화를 검출 범위 인해 바이러스 복제의 부족 만 선형이다. 이것은 고감도 분석에 대한 필요성을 강조한다. 우리는 여기에 제시 분석은 세포 - 관련 바이러스의 총량에 대해서, 세포 표면에 부착 된 바이러스의 검출뿐만 아니라 내면화 바이러스 검출 할 수있다. 비오틴 야생형 바이러스의 사용은 유동 세포 계측법에 의해 STV-Cy3에있는 염색 및 판독을 통해 편리하게 측정 할 수있다. 바이오틴 바이러스는 세포에 냉간 바인딩S는 첨부 파일을 허용하지만, 바이러스 입자의 국제화를 방지합니다. 세포를 고정 및 투과 화 바이러스 부착을 측정하는 STV-Cy3에 염색 할 수있다. 블로킹 단계는 세포가 비 - 표지 된 스트렙 타비 딘 (STV)와 함께 배양 된 정착 전에 적용하는 경우 외, 첨부 된 비리 온으로부터 신호가 폐기 될 수있다. 다음 단계에서, 바이오틴 IAV 부착 다음, 온도는 37 ° C로 시프트하고, 바이러스 입자의 내재화가 일어나는 것이 허용된다. 내면화 입자함으로써 외의의 뜻과 세포 내 바이러스 사이의 차별을 허용하는 STV의 결합으로부터 보호됩니다. 실험 조건 당 4 개의 샘플이 필요한 &#39;0 분&#39;첫번째 샘플, 표지 된 &#39;0 분&#39;, 세포 표면에 결합 된 초기 바이러스를 측정하는 방법이다. &#39;0 분 + STV&#39;: 제 2 샘플, &#39;0 분 + STV&#39;표시는, 실험의 기준 신호 강도를 제공한다. 첨부 된 바이러스는 재치 차단시간 STV와 STV-를 Cy3와 신호 다음 염색 &#39;0 분&#39;샘플에 비해 훨씬 낮은해야합니다. &#39;30 분 &#39;세 번째 샘플, &#39;30 분&#39;이 때문에 30 분 동안 37 ° C의 온도 변화에 부착 바이러스를 내면화 포함되어 있습니다. &#39;30 분 + STV &#39;네 번째 샘플, &#39;30 분 + STV&#39;조치 바이러스의 세포 내 부분. STV 차단 단계는 30 분 잠복기 후에 적용됩니다. 결과적으로, 세포 표면에 바이러스 입자가 STV-Cy3에 염색 만 내재화 바이러스 가능한 이탈 STV에 구속된다. 내재화 바이러스의 상대적인 양은 &#39;(샘플 &#39;30 분 설명) 바이러스의 총량으로 나눈 값 (샘플 &#39;30 분 + STV 측정)&#39;내재화 바이러스의 비율로 계산 될 수있다. 컨트롤로서 우리는 모의 감염된 세포를 포함하는 것이 좋습니다. 모의 - 감염된 세포의 STV-Cy3에 염색 다음 신호는 배경을 준다염색 프로토콜의 결과. IAV 부착용 제어 세균 뉴 라미니다 제 (NA)와 세포의 전처리이다. 세포 당 단백질의 시알 산 오프 NA 클리브는함으로써 세포 표면 수용체에서 부착을 제거하는 단계를 포함한다. 아 지드 화 나트륨 (SA)의 강력한 억제제 인 대사시켜 블록 (13)은 세포 내 이입. 아 지드 화 나트륨으로 처리 된 세포는 국제화를위한 바인딩 바이러스 양성하지만 부정적인해야한다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </A></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad 단백질 바이오 분석</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>딥웰 튜브 (1.2 ml 마이크로튜브)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; 루세르나 화학&nbsp; 전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>세균성 뉴라미니다아제/ 시알리다제</td><td>시그마-알드리치</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의해 a549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

표적 세포에 대한 부착 후 내재화는 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 수명 주기의 첫 번째 단계입니다. 여기에서는 인간의 폐 상피 세포주인 A549 세포에 부착하는 바이러스 입자의 양과 세포에 내재화된 입자의 양에 대한 상대적 변화를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 당사는 Cy3 표지 스트렙타비딘(STV-Cy3)으로 염색한 후 쉽게 검출할 수 있는 비오틴화 바이러스를 사용합니다. 우리는 널리 사용되는 IAV 실험실 균주인 A/WSN/33의 성장, 정제 및 비오틴화에 대해 설명합니다. A549 세포의 저온 결합 비오틴화 IAV 입자는 STV-Cy3로 염색되고 유세포 분석을 사용하여 측정됩니다. 바이러스 입자의 흡수를 조사하기 위해 저온 결합 바이러스는 37°C에서 내재화할 수 있습니다. 외부 바이러스 입자와 내부화된 바이러스 입자를 구별하기 위해 차단 단계가 적용됩니다: 세포 표면에 부착된 바이러스의 비오틴에 있는 자유 결합 반점은 표지되지 않은 스트렙타비딘(STV)에 의해 결합됩니다. 이후 STV-Cy3로 세포를 투과하고 염색하면 내부화된 바이러스 입자를 검출할 수 있습니다. 내재화된 바이러스의 상대적인 양을 결정하기 위한 계산을 제시합니다. 이 분석은 IAV의 부착 또는 내재화에 대한 약물 치료 또는 기타 조작의 효과를 측정하는 데 적합합니다.

네 개의 다른 실험 조건을 나타내는 만화는도 1에 도시되는 대표적인 실험의 결과는도 2에 제시된다 -. 5. &quot;0 분&quot;샘플에서 바이오틴 바이러스 초기 바인딩 된 STV-Cy3에 염색으로 가시화 될 수있는 세포를 대상으로 (도 1 및도 2). ( &quot;0 분 + STV&quot;샘플에서) 차단하는 단계가 적용되는 경우, 세포 표면에서 바이러스가 더 이상 STV-Cy3에 염색에 의해 검출 될 수 없다. 결과적으로, &quot;0 분 + STV&quot;샘플 신호 강도가 강한 (도 1 및 2) &quot;0 분」시료에 비해 감소된다. 37 ° C까지 온도를 상승시, 첨부 된 바이러스는 세포 ( &quot;30 분&quot;샘플)에 흡수된다. 내면화 바이러스는 &amp; #에서 신호 강도에 덜 극적인 하락을 초래 레이블이없는 STV...

우리는 인플루엔자 A 바이러스가 A549 세포에 부착하는 것과 유세포 분석을 통해 바이러스 입자가 표적 세포로 내재화되는 것을 모두 측정하기 위한 반정량적 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

이 절차의 전체적인 목표는 A549 폐 상피 세포로의 인플루엔자 A 바이러스의 부착 및 내부화를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 A549 세포에 인플루엔자 A 바이러스를 저온 결합시켜 달성하며, 이 과정을 통해 바이러스 입자의 부착은 허용하되 섭취는 방지합니다.다음으로, 온도를 37°C로 변경하여 바이러스가 세포 내부로 유입되도록 합니다. 그 후, 부착된 바이러스와 내부로 유입된 바이러스 입자를 구분하기 위해, 표지되지 않은 strp Aden을 세포 표면에 결합시키는 블로킹 단계를 수행합니다.마지막으로, 세포와 결합된 비오틴화 바이러스를 Cy3 표지 스트렙타비딘과 함께 배양하고, 유세포 분석법을 사용하여 염색된 바이러스를 검출합니다. 최종적으로, 부착 및 내부화된 바이러스의 상대적 양을 계산합니다. 이 방법은 5 0 9 세포에 부착 및 내부화되는 바이러스인 인플루엔자의 상대적 양에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 다른 세포주나 다른 바이러스를 사용하는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 비오틴화된 바이러스를 생성하고, 텍스트 프로토콜에 따라 라벨링된 바이러스, strep din 및 SI three labeled strep din의 필요량을 결정한 후, 각각 200,000개의 A 5 49 세포가 포함된 4개의 딥웰 튜브를 준비하십시오. 튜브를 0분, 0분 + STV, 30분, 30분 + STV로 라벨링하십시오. 그다음, 튜브를 원심분리하십시오.상층액을 제거하고 200 µL의 PBS를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 튜브를 다시 원심분리한 후, 200 µL의 5 49 표준 성장 배지를 사용하여 세포를 재현탁하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 원심분리하고 펠렛을 200 µL의 PBS에 재현탁합니다. 세척 과정을 한 번 더 반복한 후, 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 냉각합니다. 튜브가 냉각되면 다시 원심분리하고, 감염용 PBS에 희석된 100 µL의 biotinylated virus를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양한 후, 원심분리를 반복하고 PBS로 두 번 세척하며, 0분 샘플의 경우 가능한 한 많은 샘플을 병렬로 처리합니다.원심분리 후, 100 µL의 3.7% 파라포름알데히드(paraform aldehyde) 또는 PFA를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 원심분리하고, 고정 후 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 모든 샘플의 처리가 완료될 때까지 4 °C에서 보관하십시오.0분 및 STV 처리 시료를 처리하려면, 튜브를 원심 분리하고 상청액을 제거한 후, 15 µL의 STV 2%BSA 및 0.1% sodium azi-PBS를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁하고 얼음 위에서 30분 동안 배양하십시오. 그 다음 원심 분리하고, 앞서 시연한 것과 같이 PFA로 고정한 후 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척하며, 30분 시료의 경우 4°C에서 보관하십시오. 원심 분리 후 상청액을 제거하고, PBS 2%BSA를 사용하여 시료를 용해하십시오.PBS로 세척하고 PFA로 고정하기 전, 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 샘플을 4 °C에서 30분 동안 보관하며, 이는 STV 샘플도 마찬가지입니다. 펠릿화(pelleting) 후, 37 °C에서 30분 동안 배양한 다음, 샘플을 200 µL의 2% BSA 함유 PBS에 현탁합니다.세포를 원심 분리한 후 50 µL의 STV 2% BSA 0.1% Sodium azi in PBS에 재현탁하고, 세척 및 고정 전 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 텍스트 프로토콜의 상세 내용에 따라 모든 샘플을 STV SI three로 투과화 및 염색한 뒤, 샘플을 4 °C에서 보관합니다. 마지막으로 유세포 분석기를 통해 샘플을 분석합니다.각 샘플에서 CY three 양성 세포의 백분율을 결정합니다. 부착된 바이러스의 백분율과 내부화된 바이러스의 상대적 양을 계산합니다. 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라, 0분 샘플에서 부착된 바이러스는 St.V.SI three 염색으로 시각화된 바와 같이 표적 세포에 냉결합(cold bound)됩니다.STV를 블로킹 단계로 적용하면 세포 표면의 바이러스를 더 이상 S St.V.SI three 염색으로 검출할 수 없게 되어 신호가 크게 감소합니다. 온도를 37°C로 높이면 부착된 바이러스가 세포 내로 흡수됩니다. 세포 내로 유입된 바이러스는 표지되지 않은 STV 블로킹에 영향을 받지 않으므로, 제시된 30분 이상 STV 처리 샘플에서는 신호 강도의 감소 폭이 덜 극적으로 나타납니다.이 비디오에서 설명한 모든 실험 조건에 대한 SI 3 양성 세포의 백분율은 다음과 같습니다. 모의 감염(Mock infected) 세포는 실험의 배경 신호 강도를 나타내며, 바이러스 부착에 대한 음성 대조군 역할을 합니다. 또 다른 대조군인 뉴라미니다아제(neuraminidase)는 처리되지 않은 세포와 비교하여 IAV 부착을 90% 강력하게 억제합니다.TP를 고갈시켜 엔도사이토시스를 억제하는 Sodium azi는 감염 중과 후에 모두 바이러스 입자의 내부화를 억제하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, sodium azi 처리 후 37°C에서 30분 동안 배양한 세포는 동일한 조건에서 배양한 미처리 세포에 비해 내부화가 급격히 감소했습니다. 이 영상을 시청한 후에는 5 0 9 세포에서 인플루엔자 바이러스의 부착 및 내부화를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석기를 통해 편리하게 판독할 수 있으며, 다른 실험 설정에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

이 비디오에서는 CIT50과 바이러스 감염의 다양성 사이의 상관 관계에 대해 논의합니다. 바이러스에 감염된 세포는 세포병성 효과를 나타내어 세포를 사멸시키고 금 미세전극에서 분리되어 임피던스를 감소시킵니다.

인플루엔자 바이러스 감염의 다양성을 측정하기 위한 임피던스 기반 세포 분석

이 비디오는 형광 현미경 기반 이미징을 사용하여 숙주-병원체 상호 작용의 역학을 연구하기 위해 상피 세포 배양에 대한 GFP 태그 박테리아 부착을 평가하는 박테리아 부착 분석을 보여줍니다.

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 숙주 세포에 대한 박테리아 부착 감지)

이 비디오는 T 세포 효과기 기능의 항체 매개 활성화를 측정하는 분석을 보여줍니다. HA를 발현하는 형질주입된 포유류 세포에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 특이적 단일클론 항체를 추가하면 HA와 함께 면역 복합체가 형성됩니다. Fc 수용체를 발현하는 조작된 T 세포와 루시페라제 리포터를 도입하면 T 세포는 항체-HA 복합체에 의해 활성화되며, 이러한 활성화는 루시페라제 기질을 추가하고 생성된 생물 발광을 측정하여 검출됩니다.

HA 항체에 의한 Fc 매개 효과기 기능의 활성화 측정

아레나바이러스 수명 주기의 첫 번째 단계는 바이러스 입자를 숙주 세포에 부착하는 것입니다. 아레나바이러스 부착 이벤트의 초고감도 검출 및 정량화를 위한 정량적 (q)RT-PCR 기반 분석을 보고합니다.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

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효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

여기에 보고된 감염한 세포의 전기 임피던스 에 대한 실시간 모니터링을 이용한 전염성 바이러스 입자의 정량화를 위한 프로토콜이 있다. 이 방법의 실용적인 적용은 환경 조건을 모방하는 다른 물리화학 적 매개 변수하에서 인플루엔자 A 바이러스 부패를 정량화하여 제시된다.

실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

학습하세요 유동 세포 계측법을 이용하여 A549 폐 상피 세포에서 인플루엔자 A 바이러스의 부착 및 내부화를 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 항바이러스 전략 개발에 중요한 바이러스-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

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