Name: 멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 배우세요 나노 기공 어레이 칩을 활용한 단일 분자 수준 막 단백질 기능 분석 방법을. 고병렬 형광 판독 기술로 막 운송 역학과 통로 전도성을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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SOP를 수립하는 데 도움을 준 Barbara Windschiegl에게 감사드립니다. Dennis Remme는 NanoCalcFX 소프트웨어에 대한 작업을 해왔으며 Alina Kollmannsperger, Markus Braner 및 Milan Gerovac은 원고에 대한 유용한 제안을 제공했습니다. DFG와 독일 연방 교육연구부(Federal Ministry of Education and Research)가 R.T.에 제공한 독일-이스라엘 프로젝트 협력(DIP)과 R.T. 및 Nanospot GmbH에 대한 연방 경제기술부(ZIM R&D Project)가 이 작업을 지원했습니다.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 제시된 기술은 막 단백질 수송의 고도의 병렬 분석을 할 수 있습니다. 재구성 세포막 단백질 시스템은 직접 이론적마다 막 수송 체의 적응을 가능 또는 채널은 바이오 칩에 적용될 수있다. 전송 분석은 직접 형광 변화 (형광의 전위 또는 형광 표지 된 기판) 또는 간접 형광 변화 (pH 민감성 염료, 보조 효소 반응)을 통해 중, 형광 판독 시스템의 구축에 의해 제한된다. 후자는 그러나 아직 확립되어야한다. 단일 단백질 수준에서 막 채널 또는 운송의 기능 특성이 기술의 주요 초점이다. 자동화 현미경과 결합하여 단백질 이펙터 선별 애플리케이션의 구축이 가능하다. 분석 설정은 각각의 칩에 여러 개의 분석 포인트, 최대 8 개의 칩을 병렬 녹화를 할 수 있습니다. 때문에 칩의 완전한 분리, 그것은 조건이 설정 한 후에는 여러 실험적인 반복은 하나의 실험 실행에 컨트롤을 포함하여 허용, 진정으로 평행하다. 실험 설정시 중요한 단계...

막 단백질의 분석은 지난 20 년 동안 기본 및 제약 연구에 대한 관심이 증가되고있다. 신약 개발은 현재 제한 요인 중 하나 인, 식별 및 새로운 목표의 상세한 특성에 의존한다. 모든 약물 표적의 약 60 %는 단백질 막 한 사실이 기술의 개발은 그 기능이 가장 중요 규명 할 수있다. 4 - 과거 electrogenic 채널 및 수송을 연구하는 기술이 다수 개발되었다. 반면에 비 electrogenic 기판은 더 어려운 과제를 제시한다. 그들은 캐스케이드 5 시그널링 키 수용체로서 세포막 기능 및 전체 용질 및 영양소의 유동을 제어하는대로 그러나 프라임 약물 표적으로서 특별한 관심이다. 상당한 노력이 t의 개발에 투입하고있다echniques은 막 수송 단백질 (6), (7)의 기능을 연구한다. 몇 가지 이름 고체 지원 지질 이중층, 닿는 이중층 11, 12, microblack 지질 막 13, 14 및 기본 소포 어레이 (15, 16)을 포함하여 10 일 - 고체 지원 멤브레인을 사용하는 시스템은이 분야 8로 가장 유망한 도구가 등장했다. 그들 중 일부는 상업 설정 17, 18으로도 사용할 수 있습니다. 몇 가지 예는 고도의 병렬 14, 19, 심사 애플리케이션을위한 전제 조건에서 하나의 막 단백질을 연구 할 수있는 능력을 결합 발표되었다. 그러나 이러한 방법은 거의 산업 환경에 대한 기초 연구에서 다리 없다. 어려움은 종종 자동화가 될 수있는 시스템의 능력, 비용 집약적 생산 및 / 또는 준비에 수고 거짓말. 접근 오위에서 언급 한 모든 장애물을 vercoming하는 최종 목표이다. 22 - 여기에 제시된 기술은 단일 단백질 수준 (20)에 제어 된 환경에서 시험 관내에서 막 채널 수송을 연구하기 위해 개발되었다. 26 검은 지질 막 (27) - LUVs로 정제 막 단백질의 재구성 훨씬 더 GUVs (23)에 대한 비교 방법보다 설정됩니다. 이들은 직접 이중층의 형성이 자기 ​​조립 과정을 통해 이루어지고, 칩 표면에 적용될 수있다. 나노 다공성 칩 (도. 1)의 유리 바닥 디자인은 시스템의 간단한 자동화 허용 공기 현미경을 허용한다. 전동 스테이지와 함께 다중 칩 분석 밀봉 공동 수천 함유 뷰의 각 필드와 동시에 측정 될 수있다. 그림 1. 다중화 된 나노 기공 바이오칩의 설계. A)는 실리콘 - 온 - 인슐레이터 (SOI) 웨이퍼에 반응성 이온 에칭에 의해 구성된다. 약 1,150 개별 칩은 동일한 특성 및 품질. B) 각각의 칩은 나노 구멍에 25 ​​만 개별 마이크로 공동을 포함하는 각각의 웨이퍼에서 제조된다. 스케일 바 :. 200 μm의 C) 각 공동 멀티 스펙트럼 형광 판독을 통해 주소입니다. 반전 된 형광 현미경. D) 원 자간 력 현미경으로 바이오칩 호환 만들기는 불투명 한 상부층 블록 버퍼 탱크에서 형광 신호 (AFM) 촬상 균등 (세공 개구 3.6 nm 인 이산화 규소 층의 표면 거칠기를 배치 계시 N = 소포 융합 40) 최적. 스케일 바 :. 5 μm의 E) 주사 전자 마이크roscopy (SEM) 이미지는 실리콘 칩 내부 femtoliter 캐비티에 대한 액세스를 허용 나노 기공을 통한 단면을 도시한다. 이 그림은 (21)로부터 허가를 재사용했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 모든 데이터 분석은 최종 사용자가 제한되지 않은 액세스를 실현 프리웨어를 사용하여 수행된다. 시계열없는 화상 처리 소프트웨어 맞춤 제작 곡선 분석 소프트웨어 있도록 배치 프로세싱 곡선 여러 형광 채널 수천 대용량 데이터의 직접적인 상관 관계를 이용하여 분석 하였다. 이 프로토콜에서 사용되는 모델 단백질은 E. 유래의 컨덕턴스 (후 MsCl) 채널 단백질의 채널이다 mechanosensitive 대장균. 그것은 본질적으로 삼투압 충격을 해제하기위한 밸브로서 기능하지만 SYNT 합리적으로 설계하는 방식으로 수정hetic 기능은 공유 채널 수축 측에 부착 될 수있다. 나노 밸브를 만드는 채널이 열 트리거되는 공유 결합 활성제 (MTSET)의 전하 반발, 비아. 이온, 물, 작은 단백질뿐만 아니라, 작은 형광체 같은 작은 분자는 채널을 통해 투과 할 수있다. 여기서, 단백질은 단백질 - 매개 전위를 검출하기위한 시스템의 능력을 증명하기위한 모델로서 사용된다.

<table><tbody><tr><td><강>시약</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(트리메틸암모늄)에틸] 메탄에티오설포네이</td>트 <td>토론토 연구 화학제품 Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; 물에 의해 가수화됩니다. 건조 분말 부분 표본을 -80 &deg;C로 유지하십시오. 완충액에 가용화 후 즉시(30분) 사용하십시오.</td></tr><tr><td>1ml 기밀 주사기</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10ml 원형 플라스크</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.7mm 유리 비즈</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30cm Luer-Lock 확장 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 흡착제</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td>은 <td>처음 사용하기 전에 활성화해야</td></tr> 합니다. <tr><td>CaCl2 Dihydrat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td>는 <td>-20°C에서 어둡게 보관합니다. C</td></tr><tr><td>클로로포름 시약 등급</td><td>VWR 화학 물질</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>-20 &deg에서 어둡게 저장; C</td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt 일회용 주사기</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F 일회용 주사기</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck 클립</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>5416016 -20°C에서 불활성 가스 아래에 저장합니다. C</td></tr><tr><td>NaCl 99.5% 정제</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 웨이퍼/칩</td><td>Micromotive (Mainz/Germany)</td><td></td> <td>요청 시 사용 가능</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>상점 -20 &deg에서 어둡다. C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml; nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>매장 어둡게 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Rotilabo-syringe 여과, 비멸균, 기공 크기 0.22 &마이크로; m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>컬럼 재료 크기 배제 크로마토그래피용</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>다우코닝</td><td></td><td>경화제 커버 유리 지지대에 칩 고정용</td></tr><tr><td>접착 슬라이드 8-웰</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>멀티 웰 챔버 유리 슬라이드(칩 홀더)에 장착하기 위한 3</td></tr><tr><td>방향 스토콕 블루</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro; m 셀룰로오스 질산염 멤브레인 필터</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi 461 수조</td><td>B&uuml; 치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml; chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse 형광 분광계&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast 미니 압출기</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 펌프&nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight 나노 입자 추적 현미경</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE 현미경</td><td>Synentec</td><td></td><td>요청시 사용 가능</td></tr><tr><td>펌프 제어</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기 목욕 Sonorex RK100H</td><td>Brandelin 전자</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프 RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>수조 W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너 PDC-37G</td><td>Harrick 플라즈마</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>오픈 소스</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>과학적 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>프리웨어</td><td></td> <td>대규모 수송 키네틱 데이터 세트를위한 http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ 데이터 분석 / 평가 소프트웨어</td></tr><tr><td>NTA 2.3 분석 소프트웨어</td><td>나노 입자 추적을위한 Nanosight</td><td></td><td>데이터 수집 및 분석 소프트웨어 현미경</td></tr><tr><td>NTA 2.3 온도 통신</td><td>나노 입자 추적 현미경 용</td> <td>Nanosight</td><td></td> 온도 제어 소프트웨어</tr></tbody></table>

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

전좌 기판 비 electrogenic 경우 단일 단백질 수준에서 세포막 단백질 수송 여전히 상세한 분석을 기피한다. 상당한 노력이 분야에서 제조되었지만, 막 수송의 분석에 필요한 무용제 지질 이중층 기술과 조합하여 높은 처리량 자동 반송 분석을 가능 기술들은 드물다. 운송의이 클래스는 그러나 세포 항상성에 중요한 따라서 신약 개발과 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법론의 주요 대상이 절실히 필요하다. 여기에 제시된 논문은 단일 트랜스 해상도 세포막 단백질 매개 수송 과정의 분석을위한 신규 한 바이오칩의 확립 및 처리를 설명. 바이오칩은 설계에서 매우 평행하고 산업 등급과 양으로 제조 할 수 나노 기공으로 둘러싸인 미세 공동으로 구성된다. 단백질 형질 리포좀에 직접 적용 할 수있다SSM-기술을 이용하여 자기 조립 기공 걸친 지질 이중층을 구성하는 칩면 (고체 지질 막을 지원됨). 막의 일부가 자립으로 또는 실시간 다중 분광 형광 판독 하였다 가능 캐비티 공간에서 기판 전위에 대한 인터페이스를 제공하는 세공은 스패닝. 표준 작업 절차 (SOP)의 설립은 기능적으로 재구성 될 수있는 거의 모든 막 단백질 칩 표면에 단백질 형질 지질 이중층의 간단한 구축을 허용한다. 유일한 필수 비 electrogenic 기판 반송 용 형광 판독 시스템의 구축이다. 하이 콘텐츠 스크리닝 응용 병렬 다중 칩 녹화 자동 반전 된 형광 현미경을 사용하여 accomplishable이다. 큰 데이터 세트는 자유롭게 사용할 맞춤 설계 해석 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수있다. 세 가지 색 멀티 스펙트럼 형광판독 또한 거짓 긍정적 인 결과를 제거, 다른 이벤트 클래스로 편견 데이터 차별을 허용합니다. 칩 기술은 현재의 SiO2 표면을 기반으로하지만, 금 코팅 칩 표면을 사용하여 추가로 작용하는 것도 가능하다.

기공 멤브레인 스패닝 쉽게 자기 조립 방식으로 나노 칩 표면 상에 생성 될 수있다. 그러나 기본 프로세스는 여전히 섬세하고 리포좀의 크기, 리포좀 인구, lamellarity, 지질 및 소금 농도와 화학적 표면 특성의 단 분산 같은 많은 매개 변수에 의해 영향을 받는다. 이러한 매개 변수의 대부분은주의 깊게 특징 및 위의 프로토콜 표준화되었다. 그러나 모든 새로운 제조시 확인해야 다른 매개 변수, 성공적인 실험을 보장합니다. 이러한 리포솜 크기 분포 및 인구 분산도 (도.이 A)이다. 최적의 기공 스패닝 제막과 잘 공경 상기 캐비티 공간 리포솜 크기로 리포좀의 침입을 방지하기 위해 필수적이다. 또한, 단 분산 리포좀 제제는 확산 및 FUSI 막에서 최상의 결과를 생성하는 것으로 나타났다에. 모든 제조 확인하는 또 다른 중요한 단계는 재구성 후 단백질 활성이다. 후 MsCl <su...

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

이 나노 구조 칩 기반 플랫폼의 전반적인 목표는 단일 분자 수준에서 막 단백질 기능을 고도의 병렬 방식으로 분석하는 것입니다. 단일 단백질을 분해하는 능력을 통해 막 수송 및 플럭스(flux)에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 특히 비전기생성 화물을 수송하는 경우와 같이, 단일 채널 또는 수송체의 전도성이나 수송 행동과 같은 막 단백질 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 수십만 개의 나노포어와 수송 이벤트의 형광 판독을 특징으로 하는 나노 구조 칩 설계에서 기인한 높은 병렬성입니다. 이 기술의 영향은 막 단백질을 위한 효율적인 라이브러리의 최적 분석법 구축으로까지 확장됩니다. 이는 칩 기반 플랫폼이 고도로 병렬화된 자동 수송 기록을 가능하게 하기 때문입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들도 제시된 기술의 처리 방법을 빠르게 익힐 수 있습니다. 관심 있는 모든 이들이 도입할 수 있도록 사용자 친화적인 분석법을 만드는 것에 항상 중점을 두었습니다. 이 막 수송 분석법은 반응성 이온 식각(reaction ion etching)을 통해 제작된 절연체 위 실리콘(silicon on insulated) 웨이퍼를 이용합니다.각 웨이퍼에서 약 1,000개의 분석 칩이 제작됩니다. 각 칩에는 250,000개의 마이크로 공동(microcavity)이 포함되어 있습니다. 이 공동들은 관심 대상인 수송 단백질을 포함하는 지질 이중층에 의해 밀봉됩니다.막은 센서 인터페이스를 구성합니다. 초기에는 형광 물질이 지질 이중층의 한쪽, 즉 이를 구성하는 리포좀의 내부 쪽에 포함되어 있습니다. 각 공동은 다중 스펙트럼 형광 판독을 통해 개별적인 접근 및 분석이 가능합니다.불투명한 상단 층이 버퍼 저장조의 형광 신호를 차단하여, 바이오칩을 도립 형광 현미경과 호환 가능하게 합니다. 원자간력 현미경을 사용하여 실리콘 이산화물 층의 균일하게 배열된 기공 개구부와 표면 거칠기를 측정한 결과 3.6 nanometers로 나타났으며, 이는 소포 융합에 최적화된 수치입니다. 주사 전자 현미경으로 촬영한 나노공의 단면은 실리콘 칩 내부의 펨토리터 공동으로 연결되는 구조를 보여줍니다.이 영상에서는 프로테오리포좀의 제조, 분석용 칩의 준비 및 기본적인 분석 수행 과정을 보여줍니다. 에탄올로 세척한 라운드 바텀 플라스크를 회전 증발기에 연결하십시오. 플라스크의 유리 벽면에 균질한 지질 막을 형성하기 위해 300 millibar, 수조 온도 30 degrees Celsius, 최대 회전 속도로 40분 동안 지질 막을 건조시키십시오.그 다음, 고진공 펌프를 사용하여 상온에서 지질 막을 30분 동안 추가로 건조합니다. 이어서, 다층 소포(multilamellar vesicles)를 만들기 위해 플라스크에 완충액 5 mL와 에탄올로 세척한 유리 비드 8개를 넣습니다. 플라스크를 회전 증발기에 연결하고, 진공 없이 50 °C에서 최대 속도로 회전시킵니다.45분 후면 용액이 우윳빛으로 변하며, 벽면에 잔류 지질 막이 남지 않게 됩니다. 불활성 기체 하에서 플라스크를 초음파 세척기로 옮겨 실온에서 4분 동안 초음파 처리하십시오. 초음파 처리는 리포좀을 파괴하여 단일층 리포좀으로 만듭니다.이제 LUV 용액을 1 mL씩 분주하고, 액체 질소와 40 °C 항온수조를 사용하여 5회의 동결-융해 사이클을 수행합니다. 이 과정은 리포좀의 파열, 재배열 및 성장을 유도합니다. 마지막 동결 단계 후에 모든 시료를 -80 °C에서 보관하십시오.LUV 분주액을 재구성하기 전에, 미니 압출기를 사용하여 분주액을 400 nanometer 폴리카보네이트 필터 막에 17회 통과시켜 리포좀을 압출하십시오. 그런 다음, 용액 내 농도가 0.25%가 되도록 4% Triton X-100을 첨가하여 LUV를 불안정화하십시오. 혼합물을 50 degrees Celsius에서 5분 동안 배양하십시오.이제 정제되어 변형된 MscL 1분량을 계면활성제가 포화된 리포좀 20분량과 혼합하고, 30분 동안 배양을 계속합니다. 배양이 끝나면 100 µL의 분주액을 취해 30 mM calcine을 동일한 부피로 첨가합니다. 이 혼합물을 50 °C에서 5분 동안 배양합니다.이제 calcine 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플에서 세제를 제거하십시오. 각각에 Tris 완충액에 담긴 젖은 bio-beads를 첨가하고, 회전판 위에서 4°C로 하룻밤 동안 배양하십시오. 실험 전, 활성 분석을 통해 준비물을 테스트하십시오.먼저, 경화제에 엘라스토머 베이스를 섞고, 혼합물이 완전히 건조될 때까지 충분히 건조시킵니다. 접착제는 준비 후 30분 이내에 사용해야 합니다. 그동안 주의 사항을 준수하며, 유리 주사기로 클로로포름 5 mL를 도포하여 커버 글라스 슬라이드를 세척하고 슬라이드를 건조시킵니다.이제 10 µL 피펫을 사용하여 준비된 접착제를 커버 글라스 위에 도포합니다. 그런 다음, 정밀 핀셋을 사용하여 웨이퍼 보드에서 칩을 조심스럽게 떼어냅니다. 칩의 코팅된 면이 위로 향하게 하여 접착제 위에 올리고, 접착제가 고르게 퍼지도록 슬라이드에 부드럽게 문지릅니다.공기 방울이 아래쪽에 갇히거나 접착제가 칩 위로 올라가지 않도록 주의하십시오. 또한, 어셈블리가 8-챔버 슬라이드 홀더에 맞도록 제작하십시오. 이제 캐비닛 건조기에서 65 °C로 2시간 동안 어셈블리를 건조하십시오.나중에 54°C에서 몇 차례의 용매 세척을 통해 칩의 보호층을 제거합니다. 먼저 장착된 칩을 슬라이드 홀더에 넣습니다. 그런 다음, 세 개의 용매 배스에서 각각 10분 동안 배양합니다.이소프로판올, 아세톤, 그리고 이소프로판올 순으로 세척합니다. 다음으로 초순수로 칩을 조심스럽게 그리고 철저히 세척합니다. 질소 가스를 부드럽게 흘려 칩을 건조시켜 과정을 마무리합니다.이제 8-웰 점착 슬라이드를 준비하여 벤치 위에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음, 커버 슬라이드를 조심스럽게 들어 올려 칩이 웰을 향하도록 하여 점착 슬라이드 위에 누릅니다. 다음 단계로 진행하기 전에 조립된 상태로 몇 분 동안 둡니다.전위 분석을 진행하기 전에, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 칩 어셈블리를 철저히 세척하고 마지막으로 Tris 버퍼 조(bath)로 마무리하십시오. 다음으로, 조 용액을 5 mM calcium chloride와 1 µM Oy647 염료가 포함된 DOPEd Tris 버퍼로 교체하십시오. 이어서, 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 칩 챔버에 프로테오리포좀을 첨가하고 1시간 동안 기다리십시오.한 시간 후, 400 µL의 칼슘 제거 Tris 완충액으로 칩을 네 번 헹굽니다. 이제 각 웰에 제어 염료를 5 µM 농도가 되도록 첨가하고 분석을 진행합니다. 다음으로, 칩 홀더를 에피형 형광 현미경에 장착하고, 나노포어 칩의 가장자리에 초점을 맞추어 마이크로 공동을 찾습니다.마이크로 공동(microcavity)의 초점이 맞으면, 천장 비율(ceiling ratio)이 가장 높게 나타나는 영역을 찾기 위해 나노포어 어레이를 스캔하십시오. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다. 리포좀을 준비하고 크기 분포와 분산 상태를 확인하였습니다.준비된 리포좀은 분석에 필수적인 조건인 기공 직경보다 더 컸습니다. 또한 단분산 리포좀이 바람직합니다. 실험 전, 형광 탈소광 분석(fluorescence dequenching assay)을 통해 리포좀 내에 준비된 변형 MscL 단백질을 확인하였습니다.활성형 변형 MscL을 포함하는 리포솜의 비율은 전위 실험을 진행하기에 적절했습니다. 바이오칩 상에서 변형된 MscL 채널을 통한 형광 표적 물질의 용질 전위가 관찰되었습니다. 정전기적 반발력을 통해 엔지니어링된 MscL 채널을 개방하기 위해 화학적 조절제인 MTSET이 사용되었습니다.이후 공동 공간 내부의 형광 감소를 모니터링하였다. 이 과정은 매우 일관된 유출 이벤트와 함께 높은 재현성을 보이는 것으로 나타났다. 결과적으로 얻은 유출 곡선은 단일 채널 또는 다중 채널 전위 이벤트에 해당하는 두 개의 뚜렷한 집단으로 분류되었다.이 시스템은 실시간 분석을 통해 최대 세 가지의 고유한 형광 염료를 추적할 수 있었습니다. 이를 통해 양성 결과, 단일 지수적 유출 이벤트, 복잡한 역학, 지질 침입 및 막 파열을 정밀하게 구별할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 칩 준비, 시료 준비, 이미징 및 분석이라는 연속적인 단계로 실행할 수 있어 전체 프로토콜을 모듈화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

생명 전좌 실험 용액에 고체 상태의 나노 기공을 제조하는 방법이 제시된다. 높은 전기장의 짧은 펄스를인가함으로써, 나노 기공 직경이 나노 미터 이하로 제어 정밀도로 확대 될 수 있고 그 전기적 잡음 특성이 크게 개선되었다. 이 절차는 실험 조건 하에서 표준 실험실 장비를 사용하여 반응계 내에서 수행된다.

크기를 미세 조정 및 고체 나노 세공의 잡음을 최소화

여기서, 우리는 생물학적 나노기공 기반 전자 플랫폼을 사용하여 단일 분자 한계에서 이산 금속 산소 클러스터, 폴리옥소메탈레이트(POMs)를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 이러한 분자의 연구에 사용되는 전통적인 분석 화학 도구에 대한 보완적인 접근법을 제공합니다.

단일 금속 나노 입자의 고분해능 물리적 특성화

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3  를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

나노 기 공 시퀀싱은 원격 지에서 비용 효과적인 시퀀싱을 허용 하는 새로운 기술 이며 리소스 부족 설정입니다. 여기서, 우리는 이러한 조건과 호환 되는 전 혈에서 mRNAs의 시퀀싱을 위한 프로토콜을 제시 한다.

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여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

배우세요 나노 기공 어레이 칩을 활용한 단일 분자 수준 막 단백질 기능 분석 방법을. 고병렬 형광 판독 기술로 막 운송 역학과 통로 전도성을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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