멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

이 나노 구조 칩 기반 플랫폼의 전반적인 목표는 고도로 병렬적인 방식으로 단일 분자 수준에서 막 단백질 기능을 분석하는 것입니다. 단일 단백질을 분해하는 능력을 통해 막 수송 및 플럭스에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 특히 비전기성 화물과 같은 단일 채널 또는 운송체의 전도도 또는 수송 거동과 같은 멤브레인 단백질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 나노 구조 칩 설계에서 파생된 높은 평행도이며, 수십만 개의 나노 기공이 특징이며 형광성은 수송 이벤트에서 판독됩니다. 이 기술의 의미는 막 단백질에 대한 효과적인 라이브러리의 최상의 분석을 만드는 것까지 확장됩니다. 칩 기반 플랫폼은 고도의 병렬 및 자동 운송 기록을 가능하게 하기 때문입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 제시된 기술을 다루는 방법을 빠르게 배울 것입니다. 관심있는 모든 사람이 채택 할 수 있도록 사용자 친화적 인 분석을 만드는 데 항상 중점을 두었습니다. 이 멤브레인 수송 분석법은 반응 이온 에칭을 사용하여 설계된 절연 웨이퍼에 실리콘을 사용합니다.

대략 1개는, 000의 분석실험 칩이 각 웨이퍼에서 날조된다. 각 칩에는 250, 000 마이크로 캐비티가 포함되어 있습니다. 이러한 공동은 관심 수송 단백질을 포함하는 지질 이중층으로 밀봉됩니다.

멤브레인은 센서 인터페이스를 구성합니다. 초기에, 형광 물질은 지질 이중층의 한쪽 면에 함유되어 있으며, 이는 이들이 구성되는 리포좀의 내부에 해당합니다. 각 캐비티는 다중 스펙트럼 형광 판독을 통해 처리할 수 있습니다.

불투명한 상층은 버퍼 저장소의 형광 신호를 차단하여 바이오 칩이 도립 형광 현미경과 호환되도록 합니다. 원자력 현미경을 사용하여 균일하게 배열된 이산화규소 층의 기공 개구부와 표면 거칠기를 소포 융합에 최적화된 3.6나노미터로 측정했습니다. 주사 전자 현미경 검사는 실리콘 칩 내부의 펨토리터 공동에 액세스하는 나노포어를 통한 단면을 보여줍니다.

이 비디오는 프로테오리포좀(proteoliposomes)의 준비, 분석을 위한 칩의 준비 및 기본 분석 실행을 보여줍니다. 에탄올로 세척된 둥근 바닥 플라스크를 회전 증발기에 연결합니다. 300mbar, 섭씨 30도의 수조 온도 및 최대 회전 속도에서 40분 동안 지질 필름을 건조시켜 플라스크의 유리 벽에 균일한 지질막을 형성합니다.

그런 다음 고진공 펌프를 사용하여 실온에서 30분 더 지질막을 건조시킵니다. 다음으로, 플라스크에 5ml의 완충액과 8개의 에탄올 세척 유리 구슬을 추가하여 다층 소포를 만듭니다. 플라스크를 회전 증발기에 연결하고 최대 속도로 섭씨 50도에서 진공 없이 회전합니다.

45분 후 용액은 유백색으로 나타나고 벽에 잔류 지질막이 없습니다. 불활성 가스 하의 플라스크를 초음파 수조로 옮기고 실온에서 4 분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리는 리포솜을 파괴하여 단층체로 만듭니다.

이제 LUV 용액을 1ml 분취액으로 분할하고 액체 질소와 섭씨 40도의 수조를 사용하여 5번의 동결 해동 주기를 수행합니다. 이것은 리포솜의 파열, 재배열 및 성장으로 이어집니다. 마지막 동결 단계에서 모든 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

LUV 분취액을 재구성하기 전에 미니 압출기를 사용하여 400나노미터 폴리카보네이트 필터 멤브레인에 분취액을 17회 통과시켜 리포좀을 압출합니다. 그런 다음 용액에 0.25%에 대해 4%Triton X-100을 추가하여 LUV를 불안정하게 만듭니다. 혼합물을 섭씨 50도에서 5분 동안 배양합니다.

이제 정제 및 변형된 MscL 1부를 세제 포화 리포좀 20부에 혼합하고 30분 동안 배양을 계속합니다. 배양 후 100마이크로리터 분취액을 취하고 30밀리몰 칼신 1부피를 추가합니다. 이 혼합물을 섭씨 50도에서 5분 동안 배양합니다.

이제 소성 처리 및 처리되지 않은 샘플에서 세제를 제거하십시오. Tris buffer에 젖은 바이오 비드를 각각에 첨가하고 회전하는 플레이트에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 실험 전에 활성 분석을 사용하여 제제를 테스트합니다.

시작하려면 엘라스토머 베이스를 경화제에 혼합하고 혼합물을 완전히 건조시켜 놀라게 합니다. 접착제는 준비가 되면 30분 이내에 사용해야 합니다. 한편, 예방 조치를 취하면서 유리 주사기에 도포한 클로로포름 5ml를 사용하여 커버 유리 슬라이드를 청소하고 슬라이드를 건조시킵니다.

이제 10 마이크로 리터 피펫을 사용하여 준비된 접착제를 커버 유리에 놓습니다. 그런 다음 가는 핀셋을 사용하여 웨이퍼 보드에서 칩을 조심스럽게 제거합니다. 칩의 코팅된 면이 위로 향하게 하여 접착제에 칩을 올려 놓고 슬라이드에 부드럽게 문질러 접착제를 고르게 분포시킵니다.

기포가 아래에 갇히거나 접착제가 칩 위로 올라가지 않도록 하십시오. 또한 8 챔버 슬라이드 홀더에 맞도록 어셈블리를 만드십시오. 이제 캐비닛 건조기에서 섭씨 65도에서 2시간 동안 어셈블리를 건조시킵니다.

나중에 섭씨 54도에서 몇 번의 솔벤트 세척으로 칩의 보호 층을 제거하십시오. 먼저 장착된 칩을 슬라이드 홀더에 넣습니다. 그런 다음 3개의 용매 수조에서 각각 10분 동안 배양합니다.

이소프로판올, 아세톤 및 이소프로판올. 다음으로, 초순수로 칩을 조심스럽게 철저히 씻으십시오. 부드러운 질소 가스 흐름에서 칩을 건조시켜 프로세스를 완료하십시오.

이제 8웰 끈적끈적한 슬라이드를 준비하고 벤치에 거꾸로 놓습니다. 그런 다음 칩이 우물을 향하도록 덮개 슬라이드를 조심스럽게 들어 올려 접착 슬라이드에 밀어 넣습니다. 계속하기 전에 어셈블리를 몇 분 동안 그대로 두십시오.

전좌 분석을 진행하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 칩 어셈블리를 철저히 세척하고 Tris 버퍼 수조로 마무리합니다. 다음으로, 수조 용액을 5 밀리몰 염화칼슘과 1 마이크로 몰 Oy647 염료가 함유 된 DOPEd Tris 완충액으로 교환합니다. 다음으로, 최종 농도가 밀리리터당 1밀리그램이 되도록 프로테오리포좀을 칩 챔버에 추가하고 1시간 동안 기다립니다.

한 시간 후, 400마이크로리터의 칼슘이 없는 트리스 완충액으로 칩을 네 번 헹굽니다. 이제 조절된 염료를 각 웰에 5마이크로몰에 첨가하고 분석을 진행합니다. 다음으로, 칩 홀더를 에피 형광 현미경에 장착하고 나노포어 칩의 가장자리에 초점을 맞춰 미세 공동을 찾습니다.

마이크로 캐비티에 초점이 맞춰지면 나노포어 어레이에서 가장 높은 천장 비율을 표시하는 영역을 스캔합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. 리포솜을 준비하고 크기 분포 및 분산을 확인했습니다.

제조된 리포좀은 분석을 위한 공극 직경보다 컸으며, 이는 필수적입니다. 단분산 리포좀도 바람직합니다. 실험 전에 리포솜 제제의 변형된 MscL 단백질을 형광 소멸 분석을 사용하여 확인했습니다.

활성 변형 MscL을 함유하는 리포좀의 비율은 전좌 실험을 진행하기에 적절했습니다. 바이오칩에서, 변형된 MscL 채널을 통한 형광 타겟의 용질 전좌가 관찰되었습니다. 화학 변조기인 MTSET는 정전기 반발을 통해 엔지니어링된 MscL 채널을 여는 데 사용되었습니다.

캐비티 공간 내부의 형광의 후속 감소를 모니터링했습니다. 이 프로세스는 매우 일관된 유출 이벤트와 함께 재현성이 높은 것으로 입증되었습니다. 그 결과 유출 곡선은 단일 채널 또는 다중 채널 전좌 이벤트에 해당하는 두 개의 별개의 개체군에 클러스터링되었습니다.

이 시스템은 실시간 분석을 통해 최대 3개의 고유한 형광 염료를 추적할 수 있었습니다. 이를 통해 긍정적인 결과, 단일 지수 유출 이벤트, 복잡한 역학, 지질 관입 및 막 파열을 정확하게 구별할 수 있습니다. 일단 마스터되면 이 기술은 칩 준비, 샘플 준비, 이미징 및 분석의 연속적인 단계로 실행할 수 있으므로 전체 프로토콜을 모듈화할 수 있습니다.