Name: 인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 인간 편도선에서 B 및 T 림프구를 효율적으로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 바이러스성 편도선염 연구에 필수적인 면역학 및 바이러스학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 스웨덴 암 학회(11 0253, 13 0469), 스웨덴 연구 위원회(K2012-99X-21959-01-3), 마르쿠스 보그스트룀스 재단 및 스웨덴 연구 위원회의 지원을 받았으며 웁살라 RNA 연구 센터(2006-5038-36531-16)에 대한 보조금을 받았습니다. 우리는 FACS 분석에 많은 도움을 준 웁살라 대학의 BioVis 핵심 시설에 빚을 지고 있습니다.

이 프로토콜은 인간의 환자 물질로부터 림프 세포의 분리를 설명하고, 따라서 윤리적 승인을 필요로한다. 본 연구에서 수행 된 작업은 웁살라 윤리 심의위원회 (DNR. 387분의 2,013)에 의해 부여했다. 인간 팔라티노 편도선에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 분리 주의 : 혈액, 조직 또는 체액과 같은 인간 기원의 모든 차폐 재료는 잠재적 감염 물질로 간주되어야한다. 따라서, 인간의 조직을 처리하기위한 권장 바이오 안전성 관행에 따라야한다. 참고 : 오염을 방지하기 위해 모든 솔루션 및 세포 배양 장비는 멸균해야합니다. 모든 버퍼와 솔루션은 사전 냉각 얼음에 보관해야합니다. 편도 조직과 분리 된 세포는 보관하고 얼음에 처리되어야한다. <ol><li> 편도 또는 tonsillotomy (그림 2)을받은 환자에서 신선한 편도선을 얻습니다. 조직 clum 플 런지5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 글루타민, 0.05 밀리그램 / 젠타 마이신 및 1 % 항생제 - 안티 곰팡이 믹스 ㎖ (페니실린 빙냉 멸균 된 행크스 평형 염 용액 (HBSS)으로 가득 50 ㎖ 원심 분리 관에 추신 스트렙토 마이신 및 암포 테리 신 B). </li><li> 얼음에 항상 잠겨 편도 조직 샘플 튜브를 유지한다. 가능한 빨리 편도선을 처리하려고없고 나중에 제거 수술 후 3 시간 이상. </li><li> 얼음에 60mm 플라스틱 세포 배양 접시에 편도선을 놓고 HBSS에 적신 조직을 유지. 편도선 표면에서 깨끗한 집게로 볼 혈전, 지방과 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 5 ㎖의 HBSS를 함유하는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트를 사용한다. 가위 및 / 또는 메스의 멸균 쌍을 사용하여 3~10mm의 조각으로 편도선 조직 덩어리를 잘라. </li><li> HBSS 10 ㎖를 함유하는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트를 준비하고, HBSS 용액에 100㎛의 플라스틱 셀 스트레이너를 배치했다. </li><li> DISS 이동멸균 집게와 셀 스트레이너에 반사된다 편도 조각. 플라스틱 주사기의 플런저의 단부를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통하여 상기 조직 절편을 짠다. 편도 조각이 완전히 HBSS에 몰입되어 있는지 확인합니다. </li><li> 티슈 남아있는 셀 스트레이너를 폐기하고 50 ㎖ 플라스틱 원심 분리 튜브에 세포를 60mm 배양 접시에서 얻어진 세포 현탁액을 전송. 단계 1.8 및 1.9를 진행하는 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. </li><li> 편도선 큰 경우, 크기가보다 큰 2cm (도 2), 스트레이너 메쉬에서의 막힘을 방지하기 위해 두 개의 셀 스트레이너에 편도선 단편을 짠다. </li><li> 세포 현탁액 35 ml를 최종 부피를 얻었다. 주 :이 단계에서 그것은 동결 보존 (섹션 2 참조) 세포 현탁액을 제조 할 수있다. </li><li> 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 피콜 같은 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 조심스럽게 세포 suspens 오버레이이온 밀도 구배 용액의 상단에 (단계 1.9). 세포 현탁액 및 밀도 구배 용액의 혼합을 피한다. 주 : 밀도 구배 용액을 RT로 가온되어야한다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 700 XG에서 스윙 아웃 로터의 세포 현탁액을 원심 분리기. 그라데이션을 방해 할 수 있습니다 빠른 제동과 원심 분리기에 브레이크 기능을 활성화하지 마십시오. 또한, 원심 분리기에서 사용할 수있는 가장 낮은 가속 기능을 사용합니다. 주 :이 원심 분리 단계 이후에, 상기 튜브의 하단에 퇴적물로서 계면에서 무성 백색 층, 및 적혈구, 섬유 아세포와 같은 세포 파편 다국적 관찰. </li><li> 조심스럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 다국적 층을 수집한다. 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 세포 현탁액에 얼음처럼 차가운 PBS의 25 ML을 추가하고 4 ℃에서 스윙 아웃 회에서 5 분 동안 300 XG에 튜브를 회전. </li><li> 25 ML의 피펫을 이용하여 상층 액을 제거세포 펠렛 세척 단계를 두 번 더 반복한다. 마지막으로 15 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 주 : 최종 세척 단계 후에, 세포 현탁액을 (섹션 2 참조) cryopreserve하는 것이 가능하다. </li><li> 혈구 세포 계수 챔버에 세포 현탁액 10 μL를 적용하고 현미경으로 세포 수를 계산. 세포의 적절한 양을 분배 (예, 2-3 X 107) 이후의 자성 비드의 분리를 위해 15 ml의 원심 분리 튜브에. 단계 3.2까지 얼음이 나누어 보관하십시오. </li></ol> 편도 세포의 2. 냉동 보존 <ol><li> 냉동 매체 (90 % FBS 10 % DMSO)를 준비하고 얼음에 보관하십시오. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 냉동 보관 매체. </li><li> 혈구 세포 계수 챔버 (단계 1.15)를 이용하여 세포의 수를 결정한다. 냉동 원하는 세포 밀도에 따른 동결 배지의 요구량을 계산한다 (예를 들어, 107 셀S 동결 배지 / ㎖). </li><li> 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 경사 분리하고 (단계 2.1) 빙냉 동결 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 액체 질소에 장기 저장을 위해 설계 멸균 바이알에 세포 현탁액을 1 ml의 분취 량을 분배. 이소프로판올 실에서 튜브를 동결 및 -80 ° CO / N에 저장합니다. 장기 보존을위한 저장 탱크 또는 -140 ° C 세포를 함유하는 냉동 액체 질소로 튜브를 옮긴다. </li><li> 냉동 세포와 튜브를 해동, 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 그들을 따뜻하게. 해동시 바로, (보충제 단계 1.1) 예열 된 HBSS 10 ㎖에 균체 현탁액을 분산 15ml를 원심 분리 관에. (단계 1.1, 보충제), 5 분 동안 300 XG에 스핀 HBSS 튜브를 제거하고 HBSS에서 원하는 세포 밀도에서 세포 펠렛을 재현 탁. 참고 : 다국적 기업의 AF의 가능성을터 해동은 사균의 존재 정제 된 B 및 T 림프구의 최종 수율이 감소하기 때문에, 중요하다. 주 : 세포 분리 효율을 감소시킬 것이다 세포 생존율이 80 % 이하 후 경험하는 방법. </li></ol> 편도 다국적 기업에서 T 림프구 인구 3. 긍정적 인 선택 주 1 :이 프로토콜은 CD3 항체에 결합 된 자성 비드를 이용하여 편도 다국적로부터 인간 CD3 + T 림프구의 포지티브 선택에 기초한다. 그것은 신선한 (1 절) 또는 냉동 (제 2) 다국적 기업에서이 부분을 시작하는 것이 가능하다. 주 2 : 3 × 10 7 다국적 기업과 함께 시작합니다. 분리 컬럼은 막힐 수 있고, 이는 분리 효율을 줄일 수 있기 때문에,이 세포의 수를 초과하지 않는다. 이상의 셀이 처리 될 경우 더 큰 열을 사용합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 양을 실험적 우리 세포의 수에 대해 최적화 된우리의 실험 설정에서 에드. <ol><li> 분리 완충액 [PBS (PH 7.2), 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM EDTA]를 준비한다. 4 ° C에서 0.45 μm의 필터와 저장소를 통해 분리 버퍼를 필터링합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 다국적 기업 서스펜션 (단계 1.14)를 스핀. 빙냉 분리 완충액 240 μL로 얻어진 세포 펠렛 (107 세포 당 80 μL)을 재현 탁. 멸균 2 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 셀 솔루션 CD3 자기 항체의 20 μl를 추가합니다. 서스펜션에 세포를 유지하기 위해 지속적으로 부드러운 혼합하여 4 ℃에서 1 시간 동안 튜브를 품어. </li><li> 세포를 세척하기 위해 5 ㎖ 빙냉 분리 완충액을 함유하는 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 모두 전송할. </li><li> 스윙 아웃 회에서 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 한편 자기 분리기 및 열을 설정합니다. 스탠드에 자기 분리기를 부착하고 separ에 열을 배치ATOR. 빙냉 분리 완충액 500 μL를 적용하여 컬럼을 세척 하였다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 열 아래에 새 15 ml의 수집 튜브를 놓습니다. 얼음에 포집 관을 유지합니다. </li><li> 피펫으로 상층 액 (단계 3.5)을 폐기하고 부드럽게 500 μL 분리 버퍼에서 세포 펠렛을 재현 탁. 사전 세척 칼럼의 상단에있는 세포 현탁액을 적용하고 그것을 통해 실행하자. 주 : 세포 덩어리가 열을 막히게함으로써 유량을 감소시킬 수있다. 이 문제를 방지하기 위하여, 컬럼의 상단에 40 μm의 플라스틱 셀 스트레이너를 배치했다. 이 메쉬를 통해 셀을 통과하는 고도로이 방법의 효율성을 향상시킬 것이다. </li><li> 분리 버퍼의 1.5 ㎖ (10 7 세포 500 μL)으로 열을 4 회 반복한다. 다음 세척 단계를 적용하기 전에 (어떤 액체가 열에서 관찰 될 수 없습니다) 비어있는 열 저장 기다립니다. 주 : B 림프구 분획으로서 간주 CD3 표지 된 세포를 얻는, 그들이 그대로포집 관에 용출. </li><li> 새로운 15 ml의 수집 관에 분리 및 장소에서 열을 제거합니다. 피펫 컬럼 상 분리 완충액 2 ㎖. T 림프구의 비율로 간주된다 긍정적 선택된 T 림프구를 용출 컬럼 공급 플런저 사용. </li><li> 정제 세포 (단계 1.15) 필요한 경우의 수를 결정합니다. 세포 현탁액은 지금 하류 실험에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 절연 4. 유동 세포 계측법 분석 편도 B와 T 림프구 주의 : 파라 포름 알데히드 용액을 자극 의심되는 발암 물질이다. 적절한 보호 복, 보호 장갑과 눈 / 안면 보호구를 착용 할 것. 주 1 :이 프로토콜은 (FACS) 분석 정리 형광 활성화 된 세포에 의해 격리 된 B 및 T 세포의 염색을위한 직접적인 방법을 설명한다. 이 단계의 주요 목적은 인구 AF를 격리 세포의 순도를 평가하는 것이다터 CD3 자기 항체 분리. 이 목적을 확립 B 및 T 세포 마커에 대해 형광 공역 모노클로 날 항체 및 CD20-FITC CD2-APC가 사용된다. 또한 이소 제어 항체 포함 높게 CD2 및 CD20 항체 (단계 4.8 참조)의 결합 비특이적 &quot;배경&quot;을 구별 할 것을 권장한다. 2 주 : 염색 할 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드에 어둠 속에서 (PFA) 솔루션을 정제 된 세포 분획을 유지할 수있다 (예를 들면, 다음 날.). 염색 및 FACS 분석 간의 시간 간격이있는 경우에도 동일한 방법을 적용한다. 두 경우 모두에서 세포가 PBSA 염색 또는 FACS 분석하기 전에 버퍼 (PBS가 0.2 % BSA를 포함) 제대로 세척해야 함을 기억하십시오. <ol><li> 단계 3.10에서 단계 3.9와 T 림프구 분획에서, B 림프구 분율 (이전 컬럼에 적용하기) 단계 1.15에서 다국적 기업의 6 × 10 6 세포를 꺼내. </li><li> 세포를 스핀스윙 아웃 로터를 사용하여 4 ℃에서 5 분 300 XG에 현탁액. </li><li> 피펫으로 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 PBSA 1 ㎖로 한번 세포 펠렛을 세척 하였다. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 스핀. 피펫으로 상층 액을 제거하고를 재현 탁 얼음처럼 차가운 PBSA 버퍼 600 μL 세포. </li><li> FACS 튜브의 바닥에 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다. </li><li> PBS는 각 튜브에 10 %의 열 불 활성화 된 인간 혈청을 포함하는 100 μl를 추가, 잘 섞어 ~ 실온에서 1 분 또는 얼음에 20 분 동안 품어. 참고 : B 림프구가 된 Fc 수용체를 실시한다. 된 Fc를 차단하기 위해 정제 된 세포 분획을 10 % 열 불 활성화 인간 혈청과 함께 인큐베이션 수용체. 인간 혈청을 1 시간 동안 56 ℃에서 배양함으로써 열 불 활성화이다. -20 ℃에서 냉동 작은 분량 씩 저장에 열 불 활성화 혈청을 나눈다. </li><li> 자상 한 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기보내고 아웃 로터. </li><li> 피펫으로 상층 액을 제거하고 1 ml의 PBSA와 세포 펠렛을 씻는다. 원심 분리 (4 ℃에서 5 분 300 XG)를 반복합니다. </li><li> 얼음에 각각의 튜브에 100 μL PBSA를 추가합니다. 제조자의 권고에 따라, 형광 공역 단클론 항체의 적절한 양을 추가 (예컨대, 항 -CD20 20 μL 및 / 또는 PBSA 100 ㎕의 항 - CD2 항체의 5 μL). 참고 : FACS 분석을위한 충분한 제어 튜브를 할당하는 것을 잊지 마십시오. 이 프로토콜에서 다음 컨트롤 포함한다 : 개별적 안티 CD2 및 항 CD20 항체로 염색 1) 세포를 첨가하지 않은 개별 안티 CD2 및 항 CD20 아이소 타입 컨트롤 항체 및, 3) 세포 염색 2) 세포 항체. </li><li> 간단히 튜브 와동과 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> PBSA와 함께하는 과정을 2 회 반복한다. 샘플 1 % PFA 용액 2 ㎖를 추가합니다. 셀 4에서 PFA 용액에 남아 있도록76; FACS 분석시까지 어두운 C. </li><li> 즉시 외과 기계에서 샘플을 실행하기 전에, (4 ℃에서 5 분 동안 300 XG)를 PBSA와 셀을 2 회 반복한다. 1 ㎖의 PBS와에 재현 탁 샘플은 이전의 흐름 cytometer의 분리, 빛으로부터 보호, 4 ° C (또는 얼음)하시오. </li><li> 제조업체 흐름 cytometer에서 프로토콜 다음 FACS 정렬 작업을 수행합니다. </li></ol> 고립 된 편도 B와 T 림프구에서 아데노 바이러스의 DNA 5. PCR 검출 주 1 : 아데노 hexon 유전자 AdRJC1 프라이머 (5&#39;-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 &#39;)이고 AdRJC2 (5&#39;-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3&#39;) 11. 이 프라이머는 139 BP의 증폭 물을 생성한다. 호스트 18S rRNA 유전자는 프라이머 tp206 (5&#39;-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 &#39;) 및 tp207 (5&#39;-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3&#39;)로 검출 할 수있다. 예상 amplicon의 크기는 300 BP이다. 주 2 : 모든 PCR실행은 음성 대조군 (증류수 H 2 O) 및 인간 아데노 바이러스 5 형 (12)에 감염된 인간 B 세포주 (BJAB)로부터 얻어지는 포지티브 컨트롤 DNA를 포함한다. <ol><li> 실리카 막 기반 열 정화 방법을 사용하여 (최소 1 × 10 6 세포 단계 3.11에서) DNA를 추출합니다. 페놀 및 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 솔루션 (13)를 사용하여 RNA를 추출합니다. </li><li> 1X HF 완충액, 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트 믹스 0.2 밀리미터 (의 dNTP), 0.25 각 프라이머 μM 및 20 ㎕의 총 부피에서 고성능 DNA 중합 효소 1 U를 함유하는 반응 혼합물 B 및 T 림프구로부터 100ng의 DNA를 추가한다. </li><li> 다음 사이클의 조건에서 PCR 증폭을 수행 10 초, 67 ° C (hexon) 또는 58 ° C (18S rRNA의) 30 초 72 ° C 98 ° C의 30주기 다음 98 ℃에서 30 초 변성, 30 초 동안. PCR 반응은 72 ℃에서 7 분의 최종 신장 단계를 종료 하였다. </li><li> 결과의 PCR 충전 앰프를 분리1X TBE에서 1.5 % 아가 로스 겔상에서 주시죠 제품 버퍼 핵산 염색으로 염색하여 예상 밴드를 시각화. </li></ol>

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이 프로토콜의 결과에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나는 출발 물질로서 신선한 편도 물질의 사용이다. 따라서, 편도선 샘플은 수술 후 3 시간 이내에 처리해야한다. 편도선은 어른과 어린이 모두에서 얻을 수있다. 어린이에서 편도 물질로 인해 편도선 (tonsillotomy)의 부분 제거 수술에 일반적으로 작다. 따라서, 다국적의 수가 적은 편도선 샘플 (1 × 10 8 -2 × 109)과 비교된다 tonsillotomy 샘플 (1 × 10 7 × 10 -1 8)로부터 획득. 그러나, 세포 분리 과정없이 수술의 종류와 동일한 것이다. 방법을 정렬 자기 활성화 된 세포에서 얻은 세포 개체군의 순도를 극대화 약간의 최적화가 필요합니다. 자기 CD3 항체 량 및 인큐베이션 시간과 열에 적용 다국적의 수는 선택되어야 주요 요인imized. 너무 많은 셀을 적용하면 열 및 세포 개체군의 비효율적 인 농...

편도선은 상부 공기-소화관의 상피 아래에 있고 접촉하는 불완전하게 캡슐화된 림프 조직의 집합체입니다. 일반적으로 "편도선"이라는 용어는 인두의 구강 부분의 측벽에 위치한 구개 편도선을 나타냅니다. 쌍을 이룬 구개 편도선은 비인두 편도선(아데노이드), 쌍을 이룬 난관 편도선 및 설측 편도선과 함께 소위 "발데어 고리"를 구성합니다. 후자는 흡입 또는 섭취 된 병원체와 공기 소화관의 림프 조직 사이의 초기 접촉을 담당합니다1,2. 실제로, 수많은 보고에 따르면 박테리아 항원과 바이러스 항원이 모두 구개 편도선 조직 샘플2-6에서 검출될 수 있습니다.
구개 편도선은 성층화된 편평 비각질화 상피로 덮인 조밀한 림프 조직으로 구성되어 있습니다. 편도선에는 수많은 소낭선(crypt), 상피 침습(epithelial invaginations)이 있으며, 이는 실질(parenchyma)을 관통하여 표면적을 증가시킵니다. 조직학적으로, 구개 편도선에는 B 세포 성숙 및 분화(B 세포 영역)를 위한 장소인 생식 중심이 있는 수많은 림프 여포가 있습니다. 마찬가지로, 구개 편도선은 주로 여포 외 영역(T 세포 영역)에 위치한 T 세포를 포함합니다. B 세포와 T 세포 외에도 다양한 여포 수지상 세포가 구개 편도선에서 검출될 수 있습니다1,2. 
해부학적 위치로 인해 구개 편도선은 외과적 개입으로 쉽게 접근할 수 있습니다. 예를 들어, 편도선 절제술로 알려진 편도선 절제술은 전 세계적으로 일상적으로 시행되고 있다7. 편도선 증식증이 있는 소아의 경우 편도선을 부분적으로 제거하는 수술(편도절개술)이 때때로 사용되어 환자의 수술 후 통증을 줄여줍니다. 편도선에 다양한 병원체가 축적되어 있다는 점을 고려할 때, 수술로 제거된 편도선은 편도선 림프구 기능에 대한 바이러스 및 박테리아 제제의 영향을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다2,8. 또한, 일부 병원체가 특정 세포 하위 집단에 거주하는 것을 선호하는지 연구할 수 있습니다9. 또한, 편도선은 B 림프구의 풍부한 공급원이기 때문에, 분리된 편도선 B 림프구는 다른 B 세포 하위 집단의 활성을 연구하는 데 효율적으로 사용될 수 있다10. 그러나 구개 편도선에는 여러 세포 유형이 혼합되어 있기 때문에 서로 다른 세포 하위 집단을 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 
여기에서는 자기 활성화 세포 분리 기술을 사용하여 인간 구개 편도선에서 편도선 B 및 T 세포 집단을 효율적이고 신속하게 분리하는 간단한 방법을 설명합니다(그림 1). 여기에 설명된 방법은 구개 편도선과 같은 인간 림프 기관에서 다양한 감염원의 역할을 평가하려는 과학자들에게 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>행크스 균형 소금 용액 (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>은 5% 소 태아 혈청(FBS), 10mM 글루타민을 함유하고 있습니다. 0.05 mg/ml 겐타마이신 및 1% 항생제-항진균제 혼합물</td></tr><tr><td>냉동 매체</td><td></td><td></td><td>90% FBS 및 10% DMSO</td></tr><tr><td>MACS 완충액</td><td></td><td></td><td>PBS (pH 7.2), 0.5% BSA 및 2mM EDTA</td></tr><tr><td>PBSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.2% BSA</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td>함유 PBS 1% 파라포름알데히드(PFA) 함유 PBS. 신선하게 만드십시오. PFA는 발암 물질로 의심됩니다. 장갑과 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>항생제-항진균 혼합물</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petridish</td><td>Nunc</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>해부 포</td>셉스 <td>Fisher Scientific</td><td>1381241</td><td></td></tr><tr><td>직선 홍채 가위&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12912055</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Swann-Morton</td><td>REF 0501</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m 플라스틱 셀 스트레이너</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M 플라스틱 셀 스트레이너&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 플라스틱 주사기</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>15 ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>SARSTEDT</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원추형 원심분리기</td><td>튜브 SARSTEDT</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>저속 원심분리기 고정각도 또는 스윙잉 버킷 로터</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&ndash; Hypaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415-50ML</td><td>Ficoll 용액</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>생물학 산업</td><td>040071A</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS 컬럼&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS human CD3 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-881</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리기 (Octo MACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1120180100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AnalaR NORMAPUR</td><td>20302.293</td><td></td></tr><tr><td>CD2 알로피코시아닌에 접합 ( CD2-APC)&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>560642 CD20은 플루오레세인 이소티오시아네이트(CD20-FITC)와 결합</td>되었습니다.<td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td>556632</tr><tr><td>휴먼 세럼&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>SARSTEDT</td><td>72379</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII 유량계</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 4.1 소프트웨어</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레오스핀 블러드&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740951.50</td><td>DNA 분리 키트</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; 시약</td><td>Life technologies</td><td>15596</td><td>RNA 분리 시약</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>0610030</td><td>cell counter device</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>핵산 겔 염색&nbsp;</td></tr></tbody></table>

인간 팔라티노 편도선에서 b와 t 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

편도선은 면역 체계의 일부를 형성하여 흡입된 병원체에 대한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 일반적으로 "편도선"이라는 용어는 인두의 구강 부분의 측벽에 위치한 구개 편도선을 나타냅니다. 외과적으로 제거된 구개 편도선은 외부 병원체와 숙주 면역 체계 간의 상호 작용을 연구하기 위해 B 및 T 림프구의 편리한 접근 가능한 공급원을 제공합니다. 이 비디오 프로토콜은 수술로 제거된 인간 구개 편도선의 해부 및 처리에 대해 설명한 다음 동일한 조직 샘플에서 개별 B 및 T 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다. 항체 의존성 친화성 프로토콜(antibody-dependent affinity protocol)을 사용하여 편도선 B 및 T 림프구를 효율적으로 분리하는 방법을 제시합니다. 또한, 우리는 인간 아데노바이러스가 편도선 T 세포 분획을 특이적으로 감염시킨다는 것을 입증하기 위해 이 방법을 사용합니다. 확립된 프로토콜은 일반적으로 편도선 B 및 T 세포 집단을 효율적이고 신속하게 분리하여 편도선 면역 반응에서 다양한 유형의 병원체의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

B와 T 림프구의 고순도 소집단에서 편도 다국적 결과의 효율적인 분리. 이는 B 및 T 림프구 집단 각각 (도 3a)을 검출하기 위해 항 -CD20 및 항 CD2 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 확인 하였다. 한편, B 및 T 림프구 아 집단 (도 3b) 모두에서 세포의 혼합물이다 세포 분획 다국적 결과 비효율적 분리. 절연 편도의 B 및 T 림프구 (도 3A) 핵산 분리 등 하류 분석을위한 충분한 품질의이다. 현재 프로토콜에서 DNA와 RNA는 B로부터 추출 및 T 림프구 아데노 바이러스 DNA 및 세포 RN​​A의 검출에 이용된다. 결과는 편도 T 림프구에서 아데노 바이러스 DNA의 특정 검출을 (그림 4)를 보여줍니다. 편도 B와 T 림프구에서 또한 고립 된 RNA를 downstrea 충분한 질과 양입니다<html> M 응용 프로그램 <stron...

구개 편도선은 B와 T 림프구의 풍부한 공급원입니다. 여기에서는 인간 구개 편도선에서 B 림프구와 T 림프구를 분리하기 위한 쉽고 효율적이며 빠른 프로토콜을 제공합니다. 설명된 방법은 편도선염으로 알려진 편도선 염증의 바이러스 병인학 연구에 특별히 적용되었습니다.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 편도 샘플로부터 BNT 림프구 분획을 얻는 것입니다. 이 방법은 바이러스성 질환의 병태생리에서 BT 림프구 분획의 역할은 무엇인가와 같이 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 외과적 제거 후 3시간 이내에, 첨가제가 포함된 얼음처럼 차가운 멸균 HBSS가 채워진 50 milliliter 원심분리 튜브에 편도 조직을 넣어 실험실로 운반하십시오.그 다음, 인체 조직 취급에 권장되는 적절한 생물 안전 절차를 따릅니다. HBSS가 포함된 신선한 보충액으로 조직을 적신 후, 편도선을 얼음 위에 놓인 60 mm 플라스틱 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 눈에 보이는 혈전이나 지방 및 결합 조직을 제거한 다음, 보충제가 포함된 HBSS 5 mL가 들어 있는 새로운 60 mm 플레이트로 편도선을 옮깁니다.다음으로, 편도 조직 덩어리를 3~10 mm 크기의 조각으로 자릅니다. 그 후, 플라스틱 주사기의 플런저 끝을 사용하여 조각들을 보충제가 포함된 신선한 HBSS 10 mL가 담긴 새로운 60 mm 세포 배양 플레이트 위의 100 µm 플라스틱 세포 스트레이너로 부드럽게 옮깁니다. 조직 조각들이 HBSS에 완전히 잠겨 있도록 주의하며 세포 스트레이너를 통해 조직 조각들을 밀어내어 분쇄합니다. 모든 조직이 분쇄되면 스트레이너를 폐기하고, 생성된 세포 현탁액을 얼음 위에 놓인 50 mL 플라스틱 원심분리 튜브로 옮깁니다.첨가제가 포함된 신선한 HBSS를 사용하여 세포 용액의 최종 부피를 35 milliliters로 맞춘 다음, 상온의 밀도 구배 용액 10 milliliters를 몇 개의 50 milliliter 원추형 튜브에 넣습니다. 용액이 섞이지 않도록 주의하며 세포 현탁액을 밀도 구배 위에 조심스럽게 층을 이루어 올린 후, 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 단핵구는 적혈구, 섬유아세포 및 세포 파편이 튜브 바닥의 침전물로 위치하는 인터페이스 부분에서 솜털 같은 흰색 층으로 분리됩니다.10 mL 피펫을 사용하여 단핵세포층을 조심스럽게 수집하고, 단핵세포를 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 회당 25 mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 3회 세척하고, 최종 펠릿을 15 mL의 PBS에 재현탁합니다. 생존 세포 수를 측정한 후, 자기 비드 분리법으로 편도 T 세포를 분리하기 위해 세포를 얼음에 둡니다.단핵세포 현탁액을 원심 분리하고, 세포

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

이 동영상에서는 non-B 세포 및 스트렙타비딘 접합 자성 마이크로비드에 특이적인 비오틴화 항체를 사용하여 인간 말초 혈액에서 B 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

인간 말초 혈액에서 B 세포의 분리 및 정제

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

여기에서는 말초 Vδ1+CD4+ T 세포의 희소한 T 세포 개체, 즉 최근에 보여준 바와 같이 흉선 외 αβ T 세포 전구 세포의 분리 및 복제를 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 체외 배양에서 이러한 세포를 정량적으로 분리, 복제 및 효율적으로 확장할 수 있습니다.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

본 의정서에서는, 점막 조직에 있는 바이러스성 감염을 모방하고 활성화시 선천적인 면역 반응을 공부하기 위하여 부분적인 외과 편도선 절제술을 겪고 있는 건강한 인간에게서 편도선 단핵 세포를 쉽게 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다.

편도선 단핵 세포의 격리는 인간 점막 림프구 조직에서 Ex Vivo 타고난 면역 반응을 연구합니다

배우세요 인간 편도선에서 B 및 T 림프구를 효율적으로 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 바이러스성 편도선염 연구에 필수적인 면역학 및 바이러스학 연구에 활용됩니다.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

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