인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜
2015년 11월 16일
구개 편도선은 B와 T 림프구의 풍부한 공급원입니다. 여기에서는 인간 구개 편도선에서 B 림프구와 T 림프구를 분리하기 위한 쉽고 효율적이며 빠른 프로토콜을 제공합니다. 설명된 방법은 편도선염으로 알려진 편도선 염증의 바이러스 병인학 연구에 특별히 적용되었습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 인간 편도선 샘플에서 BNT 림프구 분획을 얻는 것입니다. 이 방법은 외과적 제거 후 3시간 이내에 바이러스성 질환의 발병기전에서 BT 림프구 분획의 역할은 무엇인지와 같은 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 얼음처럼 차가운 멸균 HBSS가 함유된 보충제로 채워진 50ml 원심분리기 튜브에 편도선 조직을 넣어 실험실로 운반합니다.
그런 다음 인체 조직 취급에 권장되는 적절한 생물 안전성 절차를 사용합니다. HBSS가 함유된 새로운 보충제로 조직을 적시고 편도선을 얼음 위의 60mm 플라스틱 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 겸자를 사용하여 눈에 보이는 혈전이나 지방 및 결합 조직을 제거한 다음 편도선을 5밀리리터의 HBSS와 보충제가 들어 있는 새로운 60mm 플레이트로 옮깁니다.
다음으로, 잘라냅니다. 편도선 조직은 3-10mm 조각으로 뭉친 다음, 플라스틱 주사기의 플런저 끝을 사용하여 10ml의 신선한 HBSS와 보충제가 들어 있는 새로운 60mm 세포 배양 플레이트의 100마이크로미터 플라스틱 세포 여과기로 조각을 부드럽게 옮깁니다. 세포 여과기를 통해 조직 조각을 짜내고, 모든 조직이 침식되었을 때 편도선 조각이 HBSS에 완전히 잠긴 상태로 남아 있는지 확인하고, 여과기를 버리고 생성된 세포 현탁액을 얼음 위의 50ml 플라스틱 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
새로운 HBSS 함유 보충제를 사용하여 세포 용액을 최종 부피 35ml로 가져온 다음 10ml의 실온 밀도 구배 용액을 50ml 원뿔형 튜브 몇 개에 추가합니다. 밀도 구배(density gradient) 위에 세포 현탁액을 부드럽게 오버레이하고, 용액을 혼합하지 않도록 주의한 다음 원심분리로 세포를 분리합니다. 단핵 세포는 적혈구, 섬유아세포 및 튜브 바닥의 침전물에 위치한 세포 파편과 경계면에서 푹신한 흰색 층으로 분리됩니다.
10ml 피펫을 사용하여 단핵 세포층을 조심스럽게 수집하고 새로운 50ml 튜브에서 단핵 세포를 당깁니다. 그런 다음 각 세척마다 25ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척하고 15ml의 PBS에 최종 펠릿을 재현탁합니다. 생존 가능한 세포의 수를 세고 나서, 세포를 얼음 위에 올려 놓고, 마그네틱 비드 분리를 통해 톤저 T 세포를 분리한다.
단핵 세포 현탁액을 스핀다운하고 펠릿을 7개의 세포에 1배 10배당 80마이크로리터의 얼음 냉간 분리 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 멸균 2 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 1 시간 동안 CD 3 자성 항체 20 마이크로리터에서 배양하여 배양이 끝날 때 세포와 현탁액을 유지하기 위해 연속적으로 부드러운 혼합을 한 다음 세포를 5 밀리리터의 얼음 냉간 분리 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮기고 세척하는 동안 세척합니다. 자기 분리기를 스탠드에 부착하고 자석에 컬럼을 로드합니다.
500마이크로리터의 얼음 냉분리 버퍼로 컬럼을 세척한 다음 컬럼 위에 40마이크로미터 스트레이너를 놓습니다. 이제 세포 펠릿을 500마이크로리터의 신선한 분리 완충액에 다시 현탁시키고 스트레이너를 통해 세포를 컬럼에 로드하여 EIT를 포함하는 B-세포를 15ml 원뿔형으로 수집합니다. 모든 세포가 수집 튜브로 통과했을 때 두 개의 본 아이스.
500마이크로리터의 분리 버퍼로 7개의 셀에 10회씩 4회 세척하고 컬럼 저장소가 비워질 때까지 기다렸다가 다음 세척을 적용합니다. 마지막 세척 후 컬럼을 새 15ml 수집 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 컬럼 플런저를 사용하여 컬럼을 통해 튜브로 2ml의 분리 버퍼를 눌러 CD 3 양성 T 세포 분획을 수집합니다.
분리된 B 및 t 톤 세포 분획을 분석하기 위해, CD 3개의 양성 세포 분획과 CD 3개의 음성 세포 분획을 펠렛화하고 두 번째 스핀 후 0.2% BSA 또는 PBSA가 보충된 1밀리리터의 PBS로 두 세트의 세포를 세척합니다. 팩스 라벨링을 위해 적절한 수의 튜브에 세포와 PBSA의 100마이크로리터 분취액을 분배하고 각 튜브에 적절한 양의 플루오로 4접합 단클론 또는 대조 항체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 잠시 와류로 만들고 배양이 끝날 때 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.
새로운 PBSA로 튜브를 두 번 세척한 다음 1% 파라폼 알데히드로 염색된 세포를 고정하여 PCR로 세포 내 아데노바이러스 DNA의 존재를 감지합니다. 적절한 사이클링 조건에서 PCR 증폭을 수행하여 생성된 PCR 증폭 산물을 1.5%AGROS 겔 및 관심 EDTA 완충액에서 분리합니다. 마지막으로, 적절한 핵산 염색이 있는 결과 밴드를 시각화합니다.
표준 프로토콜에 따르면, tonsor mononuclear cell의 성공적인 분리는 b 및 t 림프구 집단을 각각 검출하기 위해 anti CD 20 및 anti CD 2 항체를 사용한 유세포 분석에 의해 확인된 바와 같이 BNT 림프구의 고도로 정제된 하위 집단을 생성합니다. 대조적으로, 단핵 세포의 비효율적인 분리는 b 림프구와 t 림프구의 세포가 혼합된 세포 분획을 초래합니다. 하위 집단, DNA 및 RNA는 방금 시연된 바와 같이 다운스트림 분석을 위해 b 및 t 림프구로 분리된 자기 비드에서 추출할 수 있습니다.
예를 들어, 여기에서 PCR로 검출된 TONSOR T 림프구에서 아데노바이러스 DNA의 특이적 검출은 고품질 세포질로 표시됩니다. RNA는 분리된 톤소 B NT 림프구에서도 추출할 수 있습니다. 일단 괴물이 되면 두 개의 편도선 샘플을 이 기술이 제대로 수행되면 6시간 이내에 처리할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 편도선 샘플을 가능한 한 빨리 처리하는 것이 중요합니다. 세탁 단계의 수와 세탁 버퍼의 부피도 좋은 결과를 위한 중요한 매개변수입니다. 이 절차에 따라 QPCR 및 R-T-Q-P-C-R과 같은 다른 방법을 수행하여 개발 후 바이러스 DNA 및 mRNA의 정량적 존재에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.
이 기술은 바이러스학 분야의 연구자들이 인간 림프 조직에서 다양한 바이러스 종의 발병 기전과 잠복기를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 편도선 샘플에서 BT 림프구 분획을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 혈액 및 조직과 같이 선별되지 않은 인체 유래 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.
따라서 적절한 안전 수칙을 따라야 합니다.
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개요
이 문서는 인간의 구개 편도에서 B 및 T 림프구를 분리하기 위한 신속한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 편도염의 바이러스 원인에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 설계되었습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 면역학
- 바이러스학
- 세포 생물학
배경
- 구개 편도는 B 및 T 림프구의 중요한 공급원입니다.
- 편도염은 조사가 필요한 바이러스 원인을 가질 수 있습니다.
- 바이러스 질병에서 림프구의 역할을 이해하는 것은 바이러스학 발전에 중요합니다.
- 림프구의 효율적인 분리는 연구에 필수적입니다.
연구 목적
- 림프구 분리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.
- 바이러스 병원성에 대한 연구 능력을 향상시킵니다.
- 편도염에서의 면역 반응에 대한 연구를 지원합니다.
사용된 방법
- 얼음 위에 무균 HBSS에서 편도 조직을 수송합니다.
- 눈에 보이는 혈전 및 결합 조직을 제거합니다.
- 인간 조직을 취급할 때 적절한 생물 안전 절차를 사용합니다.
- 처리 전에 HBSS 보충제로 조직을 적시합니다.
주요 결과
- 이 프로토콜은 생존 가능한 B 및 T 림프구의 분리를 허용합니다.
- 분리된 림프구는 추가 바이러스학 연구에 사용될 수 있습니다.
- 결과는 바이러스 감염에서 림프구의 역할 조사를 지원합니다.
- 이 방법은 효율적이며 수술 후 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 편도염을 연구하는 연구자들에게 귀중한 도구입니다.
- 바이러스 감염에 대한 면역 반응 이해에 기여합니다.
- 미래 연구는 이 방법을 기반으로 림프구 기능을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid isolation of purified B and T lymphocyte fractions from human tonsil tissue, supporting mechanistic studies of viral pathogenesis in lymphoid tissues. By providing a reproducible method to obtain viable immune cells within three hours of surgical resection, it facilitates target validation and assay development for antiviral therapeutics. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by enabling direct interrogation of human lymphocyte responses to pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding lymphocyte-specific viral tropism and immune evasion mechanisms.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for isolating pure B and T cell populations from the same tissue sample, reducing variability in downstream functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly purified lymphocyte subsets suitable for quantitative infection assays and pathogen-host interaction studies.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent cell yield and viability, enabling reliable compound screening against viral targets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates direct applicability to studying human adenovirus infection in tonsillar T cells, bridging discovery to mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enables extraction of DNA and RNA from isolated lymphocytes for downstream PCR and qPCR analysis of viral load and gene expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing in immunology and virology before progressing to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports functional validation of lymphocyte roles in viral pathogenesis through isolated cell fractions.
- Screening: Delivers standardized, viable lymphocyte preparations for reproducible infection and drug response assays.
- Analytics: Enables quantitative readouts via flow cytometry and PCR to assess purification efficiency and pathogen presence.
- Translational Research: Provides a human-relevant system for studying lymphocyte-pathogen interactions, informing preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for multiple lymphoid tissue studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lymphocyte-virus interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of immune cell isolation for high-throughput applications.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early human-relevant data on target engagement and pathogen specificity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on lymphocyte-specific efficacy and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic handling of human tissue and magnetic bead separation techniques.
- Dependent on access to sterile HBSS, density gradient solutions, and CD3 magnetic antibody conjugates.
- Necessitates standardized washing protocols and temperature control to maintain cell viability and purity.
- Adaptation to other lymphoid tissues may require optimization of enzymatic digestion and filtration parameters.
- Practical limitations include tissue availability and the need for rapid processing within six hours of resection to prevent degradation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Mononuclear Cell (MNC) Isolation from Human Palatine Tonsils
2:45
Tonsillar T Lymphocyte Positive Selection
4:24
Isolated Tonsillar B and T Lymphocyte Flow Cytometric and PCR Analysis
5:39
Results: Representative Tonsillar B and T Lymphocyte Isolation
6:34
Conclusion
