Name: 액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 액적 병합 후 형광 복구 기법을 이용하여 인지질 단분자막의 이차원 확산 계수를 측정하는 방법을. 형광 현미경으로 DOPC 단분자막의 확산을 직접 관찰하고 생물물리학 연구에 활용하세요.

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이 작품은 2014 KAIST 투자 K-밸리 레드 &amp; B 프로젝트 및 기초 과학 연구 프로그램 한국 연구 재단을 통해 (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023)에 의해 지원됩니다.

주의 : 발암 아세톤, 클로로포름을 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 플랫 공기 - 물 인터페이스에서 인지질 단층 1. 준비 <ol><li> 인지질 단층의 형성 <ol><li> 인지질 용액의 제조 <ol><li> 아세톤, 에탄올, 탈 이온수 3 회 이상을 사용하여 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 코팅 캡 유리 병, 물을 제거하기 위해 유리 병에 충분히 질소 가스를 불어 ㎖로 4를 청소합니다. </li><li> 인지질을 1 ㎎을 용해 (예 dioleoylphosphatidylcholine, DOPC) 바이알에 클로로포름 1 ㎖에 1 밀리그램 / ㎖의 농도를 얻었다. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. 인지질 솔루션의 낮거나 높은 농도 (필요한 경우)를 사용합니다. </li><li> 추가 염료는 인지질 태그 (예를 들면, 로다 민 dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 로다 민 DPPE) 인지질 SOLU의 1 몰 %와기, 형광 현미경으로 인지질 단층을 시각화하기 위해서. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. </li><li> 용매의 증발을 방지하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 테이프로 감싸 바이알, 및 -20 ℃에서 냉동고에 샘플을 저장한다. </li></ol></li><li> 공기 - 물 인터페이스 상에 인지질의 증착 <ol><li> 배양 접시 (직경 55mm, 높이 12mm) 에탄올, 및 탈 이온수 3 회 이상 세척. </li><li> 공기 - 물 계면을 만드는 탈 이온수 10 ml의 배양 접시를 채운다. </li><li> 원하는 표면 압력을 달성하고 종래 실험 일에, 용매를 완전히 증발 적어도 30 분간을 기다려야 깨끗한 인터페이스 상에 마이크로 주사기 인지질 용액 몇 ㎕를 확산. 주 : 랭 뮤어 통은 표면 압력의 정밀 제어가 필요한 경우 대신 페트리 접시로 사용될 수있다. </li></ol></li></ol></li><li> 스와rface 압력 측정 <ol><li> 윌 헬미 플레이트 장력과 인지질 단분자막의 표면 압력을 측정한다. 여과지 빌헬 판으로서 사용되는 경우 여과지 충분히 습윤 얻을 적어도 30 분 동안 기다려. 자세한 프로토콜은 쿤 등에서 사용할 수 있습니다. (20). </li><li> 정확히 표면 압력을 제어하는​​ 인지질의 퇴적 량을 조정한다. ~ 5 mN의 / m 면압의 경우 계면의 30.25 cm 2 - 지역 상 DOPC 용액 (1 ㎎ / ㎖) 4 μl를 추가하는 것이 요구된다. 주 : 여과지가 완전히 습윤되지 않는 경우, 표면 압력 때문에 여과지의 중량 변화를 실험의 처음 30 분 동안 극적으로 변화시킨다. </li></ol></li><li> 단층의 대류 유동을 최소화 <ol><li> 페트리 접시의 큰 부분에 연결된 두 개의 얇은 채널을 3mm 저수지를 포함하는 원뿔 모양의 장치를 사용하여,의 대류 흐름을 억제모폴로지 촬상 표면 압력 측정을 방해 할 수 단층. </li><li> 인지질은 공기 - 물 계면에 인지질을 증착하기 전에 전체 영역에 걸쳐 자유롭게 이동되도록 원추형 장치의 내부와 외부 사이의 수위 일치하십시오. </li></ol></li></ol> 방울의 곡면에 인지질 단분자막 2. 제조 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관의 프로세스 테이퍼 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러의 모세관 홀더에 유리 모세관 (외경 1mm, ID 0.78 mm, 길이 100mm)을 놓습니다. </li><li> (: 차, 램프 : 60, VEL : 70, 지연 : 열 (70) 및 압력 200) 적절한 매개 변수 값으로 모세 혈관을 당겨위한 프로그램을 설계 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 설계 프로그램과 모세 혈관을 잡아 당깁니다. 주 : 모세관이 수 마이크로 미터 직경으로 끝나는 것은 APPL 의해 100 μm의 방울을 형성 할 필요가있다~ 10 kPa의 압력을 가진 잉. 모세관의 선단이, 훨씬 높은 압력,&gt; 600 kPa의 너무 작은 경우는 너무 큰 모세관 선단으로 소적의 크기를 제어하기 어려운 반면, 적을 얻기 위해 요구된다. </li></ol></li><li> 액적 표면에 흡수 인지질 주 : 방울의 만곡 계면 인지질 단층을 형성하기 위해, 염료없이 인지질 용액을 첨가 절차 (1)에 의해 제조, 플랫 단층에 대하여, 강도 콘트라스트를 얻기 위해 사용 두 절차 2.2.1 및 2.2 인지질 태그 .2 여기에 허용됩니다. 액적 표면에서의 표면 압력의 정밀 제어가 필요한 경우, 절차 2.2.2 추천된다. 그러나 그렇지 않은 경우, 절차 2.2.2보다 훨씬 쉬운 방법입니다 절차 2.2.1, 유용합니다. <ol><li> 팁 끝 부분에 인지질의 과정을 코팅 <ol><li> 아세톤, 에탄올, 및 탈 이온수를 적어도 세 번 사용하여 슬라이드 유리를 청소. </li><li> 경기 수세정 슬라이드 글래스에 테이퍼 모세관 에이스, 및 선단부와 슬라이드 글라스를 만지고 촉진하는 모세관 기울. </li><li> 유리 주사기를 사용하여 유리 슬라이드에 부착 모세관의 선단에 인지질 용액 (1 ㎎ / ㎖)을 몇 방울 떨어 뜨리 및 용매를 완전히 증발 적어도 30 분을 기다린다. 주 : 매우 선단 둘레 만 모세관 력에 의해 선단 인지질 방울을 잡고 너무 작아서 절차 2.2.1.3 중에 유리 슬라이드에 모세관의 선단을 부착 권장한다. </li></ol></li><li> 소포 용액의 제조 <ol><li> 유리 병을 청소하고, 절차 1.1.1.1에 소개 된 바와 같이, 유리 병에서 물을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 질소 가스를인가함으로써 인지질 용액 (1 ㎎ / ㎖)의 2 mL의 부피를 건조하고 잔류 용매를 제거하기 위해 1 시간 동안 실온에서 유리 병을 건조하는. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. </li><li> 2 추가바이알 내로 ml의 탈 이온수는 지질을 건조시키고, 1 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 바이알을 배양 함유. </li><li> 유리 병 여러 번 흔들어하고, 초음파 처리 (HF 주파수 : 40 kHz에서, 전원까지 : 370 원) 소포를 얻기 위해 30 분. </li><li> 단 분산 단일 층 소포를 얻기 위해 압출 및 동결 해동 과정을 수행합니다. 제조 소체 대한 상세한 프로토콜은 메이어 외. (21)에 대하여 설명한다. 주 : 액적 계면의 면압 단 분산 단층 소포를 포함하는 액체 방울을 형성 한 후에 대기 시간을 조절함으로써 정확하게 제어된다. 펜던트 드롭 방식 (22)을 이용하여, 사전에 실험을하고, 시간에 따른 면압의 변화를 측정하는 것이 필요하다. </li></ol></li></ol></li><li> 곡면에 인지질 단층을 포함 액적 형성 <ol><li> procedur에서 탈 이온수 10 μL와 테이퍼 모세관를 입력전자 2.2.1. 대안 적 절차에서 2.2.2 소포 용액 10 μL를 사용한다. </li><li> 방울을 형성하는 압력을 제공하기 위해 자동화 된 마이크로 인젝터 모세관 연결한다. </li><li> 정확하게 모세관의 위치를​​ 제어하도록 미세 조작기에 마이크로 인젝터에 접속되어 모세관 마운트. </li><li> CCD 카메라와 모세관의 측면도을 이미징 (10X 현미경 NA 0.3 1 대물​​ 렌즈)를 명 시야 현미경을 준비한다. 따라서 1 현미경 Z 축을 따라 적의 정확한 위치를 관찰하고 액 적의 크기를 추정 할 수있다. </li><li> ~ 100 (적절한 크기까지 모세관의 선단과 변압 (~ 100 고전력 증폭기)을 선단의 측면도 잘 미세 조작기를 사용하는 현미경 (1)에 의해 가시화되는 위치에 선단부를 이동 적용 액적 지름 μm의)이 형성된다. 참고 : 자동화 된 마이크로 인젝터 및 미세 조작기를 사용하는 것이 좋습니다D는 방울의 크기와 위치의 정밀한 제어가 필요하고, 경우. 그것은 수동 것을 사용하는 것도 가능하다. </li></ol></li></ol> 물방울 병합 후 3 이미징 형광 복구 주 :이 프로토콜의 기본 원리는 액적 유착 과정을 제외 FRAP 기술의 그것과 동일하다. FRAP의 상세한 프로토콜 및 관련 이론 A. 로페즈 등. (15)와 D 악셀로드 등. (16)에서 사용할 수 있습니다. <ol><li> 모니터링 및 액체 방울의 위치를​​ 제어 <ol><li> 로다 민 - DPPEs (560 nm에서 여기, 583 nm에서 방출)에 대한 적절한 필터 세트와 형광 현미경을 모두 할 수 있습니다 (: 10 배 NA 0.3, 튜브 렌즈 초점 거리 17cm 현미경 2, 대물 렌즈)를 설정 거꾸로 현미경을 준비 및 명 시야 현미경. 형광 현미경으로 액적 m의 평면도를 시각화 여기 CCD 카메라를 사용하여송시와 밝은 필드 현미경 모드. </li><li> Z 축을 따라 평면 공기 - 물 계면에 인지질로 피복 한 방울을 이동하지만, 미세 조작기를 이용하여, 아직 액체 방울을 병합하지 않는다. 방울의 측면보기를 시각화하는 현미경 1을 사용합니다. </li><li> 미세 조작기를 사용하여 평면 단일 층의 평면도의 중심에 방울을 찾습니다. 평면 단일 층의 평면도를 시각화하는 현미경 2의 밝은 필드 현미경 모드를 사용합니다. </li></ol></li><li> 평면 공기 - 물 인터페이스에 방울을 병합 <ol><li> 방울이 미세 조작기를 사용하여 인터페이스 상에 병합 될 때까지 평탄 계면을 향해 상기 액 적을 이동. 병합 프로세스가 성공적으로 수행 된 경우, 흰색 배경에 의해 둘러싸인 원형과 어두운 영역은 현미경 (2)의 형광 모드를 이용하여 관찰된다. </li><li> 극소의 형광 모드를 사용하여, 액체 방울을 병합 한 후 시간에 따른 형광 이미지의 시리즈를 녹화2. 여기서 단층의 확산 시간 스케일보다 더 빠른 프레임 레이트를 사용하여 극복. DOPC 단층에서 완전히 200 μm의 어두운 영역으로 확산하는 데 몇 분 정도 걸립니다. </li></ol></li></ol> 4. 영상 분석에 의한 확산 계수 결정 주의 : 아래에 설명한 바와 같이 일련의 이미지에서의 확산 계수를 결정하기 위해 이미지 분석 용 맞춤 프로그램이 내장되어있다. 이 프로그램의 자세한 소스 코드 조브 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. <ol><li> 관심의 원형 영역의 검출 <ol><li> 관심 영역의 중심 검출 <ol><li> 원형 어두운 영역 및 백색 배경을 포함하는 복구 처리 중에 기록 된 형광 일련의 이미지를 획득하고, 참조 화상과 같은 시리즈의 첫 번째 이미지를 설정한다. 여기서, D는 R 기준 화상에서 어두운 영역의 반경이다. </li><li> 흰색 원으로 참조 이미지를 나선상 사람SE 강도가 전체 영역에 걸쳐 균일하다. 여기 맞춤형 프로그램 라인 (124)의 소스 코드와 같이 컨벌루션위한 &#39;CONV2&#39;라는 기능을 사용하여 매립, 흰색 원의 반경 R에 D보다 약간 작다. </li><li> 컨볼 루션 연산에 최소치를 나타내는 위치를 찾아 내고, 기준 영상에서 관심 영역의 중심이 위치를 설정한다. </li></ol></li><li> 관심 영역의 반경을 결정 <ol><li> 전체 영역에 걸쳐 균일 한 절차 4.1 강도에 의해 결정된 중심 위치를 포함 흰색 원과 참조 화상을 나선상. 여기서, S는 R 흰색 원의 반경이다. 이러한 반복 사용 &#39;대&#39;또는 사용자 정의 프로그램 라인 102-109의 소스 코드에 도시​​ 된 바와 같이 흰색 원을 만드는 원의 방정식 &#39;하면서&#39;등. </li><li> 약간이 다른 흰색 원으로 참조 이미지를 나선상R의 S보다 큰 반경 (5 % -10 %), R의 L,. 맞춤형 프로그램 라인 113-120의 소스 코드에 나타낸 바와 같이 동그라미를 만드는 절차 4.1.2.1과 동일한 방법을 사용한다. </li><li> 4.1.2.1 및 4.1.2.2의 두 회선 계산 사이의 값의 차이를 가져옵니다. </li><li> 화소 레벨로의 S와 R R L의 양을 증가시킴으로써, R S = 2R D에 R R S = D / 2에서 상술 한 과정을 반복한다. 반복 4.1.2.3에 절차 4.1.2.1에서 전체 소스 코드를 포함하는 반복합니다. </li><li> 두 회선 계산 사이의 값의 최대 차이를 나타내는 R (S)의 반경을 찾을 수 있습니다. 이 R 따라서 참조 화상에서 어두운 영역의 반경을 나타내는 S (149)로 정의 프로그램 라인 (148)의 소스 코드와 같이 반경을 찾기 위해 맥스 &#39;라는 용도 임베디드 함수의 값은 최대 차를 나타낸다. </li></ol></리&gt; </ol></li><li> 분수 강도의 계산 <ol><li> 관심 영역으로서 4.1 절차에 의해 결정된 중심 위치 및 반경을 포함하는 원을 설정한다. </li><li> 시간에 따른 형광 이미지의 시리즈에서 관심 영역의 평균 강도를 계산한다. 관심의 영역과 각 프레임을 나선상 평균 강도를 계산하는 데 관심 영역의 면적을 나눕니다. 세부 사항은 주피터 웹 사이트에서 사용할 수있는 사용자 정의 프로그램의 소스 코드에서 사용할 수 있습니다. </li><li> F (t)는 시간에 따라 관심 영역 인 원의 평균 강도는 다음 식으로 정의 부분의 강도를 계산, F i는 원의 초기 강도 및 F o를의 강도 흰색 배경. F (t) = (F (t) - F에서 I) / (O F - F에서 I) (식 1). </li></ol></li><li> F 피팅FRAP 이론 ractional 강도 <ol><li> I 1 피팅 프로그램을 사용하여, 베셀 함수를 수정, τ는 시간 확산 특성 및 I 0이고 다음 식으로 분별 강도를 맞춘 τ를 얻기 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (수학 식 2). </li><li> D는 확산 계수이고, 어두운 영역의 반경의 관계, τ에 기초하여 확산 계수 = 2 / 4 D를 얻었다. 주 : 피팅 과정은 복구 과정이 이미 화상을 기록하기 전에, 시작되면 시간축 분수 강도 프로파일을 이동시킬 수있다. </li></ol></li></ol>

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<li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet%3A+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid%2Ffluid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

FRAM은 특히 특정 지역 표백 후 형광 회복을 측정하기위한 FRAP와 기본 원리를 많이 공유하지만 FRAM은 표백 된 영역을 형성하도록 평면 인터페이스에 액적 병합 대신 집중 조명을 적용하는 방법을 사용한다. 병합 프로세스는 따라서 FRAM에서 가장 중요한 단계이며, 특히, 액적 병합 후 평면 단층에서 어두운 얼룩 형상 확산율 측정의 정확도를 결정한다. 구체적으로는, 현재의 방식에 기초하여, 우리는 단지 절차 4에 도시 된 어두운 얼룩의 평균 강도를 계산하기 위해 관심 영역으로 반경 R과 원을 설정하고, 원형에서 너무 많은 편차가 존재하는 경우, 이는 확산 계수의 정확한 측정을 방해 할 것이다. 따라서, 원형의 어두운 영역을 구할 필요가 있지만, 비 원형 형상은 여러 가지 이유로 인해 때때로 형성되어있다. 먼저, 동물의 대류 흐름이 존재한다면RI 요리는, 어두운 영역의 형상은 유동 방향을 따라 연장된다. 절차 1.3에서 언급 한 바와 같이, 원뿔 형상 장치는 대류 흐름을 억제하는 데 도움이 연신은 최소화 될 것이다. 모세관의 선단은 병합 과정 평면 인터페이스에 접촉하면 캐 필러 리 끝 병합 프로세스를 중단 이후 둘째, 어두운 영역은 다양한 형상으로 형성된다. 오직 모세관의 끝에서 걸려 방울을 구함으로써, 간섭이 방지 될 수있다. 특히, 모세관의 소수화 처리는 모세관의 끝에서 앉아 방울을 돕는다. 따라서, 위의 문제 총격 및 수정이보다 정확하게 확산 특성을 측정 할 수있게. 이 잘 troubleshot 과정은 따라서 FRAM은 FRAP를 통해 몇 가지 중요한 장점을 가지고 있습니다. 첫째, FRAM은 FRAP에 비해 간단한 장비를 필요로한다. FRAM, 그것은 단순한 마이크로 형광을 사용하는 것으로 충분하다대신 파장 염료의 흡수 스펙트럼과 일치해야 고출력 레이저 비싼 공 초점 현미경, 대처. 또한, FRAM은 액체 방울의 크기 또는 액적 표면에서의 표면 압력을 조정함으로써 용이하게 된 영역의 크기를 제어하면서, FRAP의 표백 된 영역의 크기를 조정하기위한 추가 장치를 사용할 필요가있다. 둘째, FRAM에 다양한 종류의 염료를 사용할 수있다. FRAP는 누구의 표백 공정 확산 공정보다 훨씬 빠른 염료 분자를 사용합니다. 염료의 확산 표백 과정에서 발생하는 경우, 정확하게 확산 특성을 추정하기 어렵다. FRAM은, 그러나, 염료 표백 공정을 필요로하지 않으며, 따라서 이는 형광 이미징 염료의 다양한 유형의 사용을 가능하게한다. 또한, FRAP 추가 고출력 레이저를 필요로하며, 필터는 FRAM에 필터 세트를 대체하는 것만이 필요하다 반면, 염료 종을 변경 설정한다. 최종적으로FRAP만을 측정하는 동안, 액적 표면과 평평한 계면 단층 때문에, 따라서 상호 확산의 연구를 가능하게하거나 형에게 B 형 단층에 단층을 병합하여 두 개의 서로 다른 지질 단층 사이 혼합 독립적으로 형성 될 수있다 단층의 자기 확산. 이러한 장점에도 불구하고, 평탄 공기 - 물 계면에 액 적을 병합 프로세스는 잠재적으로 인해 이러한 두 단층 사이의 면압 불일치, 병합 프로세스의 시간 스케일로서 관심사가 될 수있는 몇 가지 문제에이 기술을 제한 할 수있다 액적들을 병합 후 평면 단층의 표면 압력 및 증가. 이러한 문제는, 그러나, 다음과 같은 이유로 크게 확산 측정에 영향을 미치지 않는다. 첫째, 두 개의 서로 다른 단층에서의 표면 압력이 상당히 다른 경우에도, 평형 처리가 복구 프로세스 동안 매우 이른 단계에서 완성된다. 예를 들어, t면압 평형화까지 그 액적 표면에 단층의 압력 평면 공기 - 물 계면에 단층의 표면보다 높은, 어두운 영역은 확장된다. 이 프로세스가 10 밀리 초 이내에 완료이기 때문에 크게 확산 공정에 영향을 미치기 전에, 면압 평형화한다. 병합 처리의 시간 스케일이 충분히 빠른 경우 둘째, 전혀 확산 측정치를 제한하지 않는다. 다행히도, 전형적인 병합 프로세스는 10 밀리 초 이내에 완료된다. 마지막으로, 통의 표면적 보낸 면압을 증가시키지 않는 평면 인터페이스 상 액 적의 병합 심지어 여러 방울의 면적보다 훨씬 크다. 프로토콜에 기재된 저점 방울의 크기에 따라 분자 당 면적은 방울을 병합하여 0.015 % 이하로 증가한다. 따라서 의한 분자 당 면적의 변화에​​ 표면 압력의 증가는 negligibl 인 0.1 % 미만이며윌 헬미 플레이트 장력에 의해 측정 된 전자는 또한, 면압 전형적인 에러보다 훨씬 작기 때문에. 요약하면, 우리는 평면 인터페이스에 액적 단층을 병합하여 인지질 단분자막의 측면 확산 특성을 측정하는 새로운 방법을 도입했다. 이 기술은 비교적 간단한 장비를 필요로하며, 또한 염료 종의 다양한 종류를 사용할 수있다. FRAM 따라서 유체 - 유체 계면에서 인지질, 블록 공중 합체, 심지어 단백질 나노 입자를 포함한 모든 계면 활성제, 확산의 측정을위한 잠재적으로 적용 가능하다. 또한, 우리는 FRAM은 두 개의 서로 다른 계면 활성제 사이에 혼합 간 확산 또는 공부를 할 수있는 새로운 방법을 제공합니다 기대합니다.

<html> 인지질 주요 세포막의 구성 요소와 세포 소기관의 막이며, 이들 층의 막 유동성 종종 막 단백질 (1)의 활성을 변경하여 세포 기능에 영향을 미친다는 3 -. 예, 막 들어 &#160; 지질 항상성은 막 단백질에 의해 검출되고, 막 유동성을 조절함으로써 달성되어, 유동성의 비정상적인 레벨은 간 지방증 및 담즙 4와 같은 심각한 질환을 야기한다. 또한, 공기 폐포 액 계면에서 인지질 단분자막의 유동성이 그 기능에 중요한 의미를 갖는다. 낮은 유동성이 호기 5,6 동안 폐포 내에서 머물 수있는 층을 가능하게하는 반면 폐 계면 활성제 인지질 단일 층의 높은 유동성, 흡입시 층의 확산을 용이하게한다. 그것은 자신의 역할을 이해하는 인지질 층의 유동성을 평가하는 것이 중요하다. _content &quot;&gt; 유동성의 직접적인 측정은 점도이고, 인지질 층의 점도는 미크론 크기의 콜로이드 7 자성 바늘 8,9, 자성 마이크로 6,10,11 버튼을 이용하여 측정하고있다. 그러나, 이들 기술 비교적 경질 막에 한정되고, 덜 점착성 필름을 측정 할 수있다. 이러한 경우에서, 확산율이 인지질 층의 유동성을 계량하는 대안이 될 것이다. 수십 년 동안, 인지질 층의 확산 특성을 측정하기위한 다양한 기술이 개발되어왔다 이러한 형광 소광 법 (12), 펄스 전계 구배 NMR (13), 및 형광 상관 분광법 (FCS) 가장 대표적인 방법 (14). 하나로 (FRAP) 15,16 photobleaching에 후 형광 복구이다. 측정 절차 및 관련의 단순성으로 인해 인지질 층의 확산 특성에 대한 이론, 여러 연구 FRAP를 사용하여 수행되어왔다 <suP&gt; 17-19을. 그러나 FRAP 보통 고출력 레이저 공 초점 현미경 비싼 설정을 요구한다. 여기서, 우리는 (FRAM)를 병합 한 후 형광 복구 되나 인지질 단분자층의 측면 확산을 측정하는 새로운 방법을 제시한다. FRAP FRAM과의 주요 차이점은 광표백 단계가 드롭 합체로 대체된다는 것이다. 형광 표지 된 평면 단층에 비 형광 단층에 의해 덮여 방울을 병합하여 광표백 단계와 같은 초기 상태를 설정, 밝은 평면 단일 층에 원형 어두운 얼룩을 남긴다. 우리는 그 측면 확산을 측정하는 시간에 어두운 얼룩에 형광 관찰을 회복. 액적 유착하여이 새로운 &quot;표백&quot;단계 FRAP에 비해 상당한 이점을 제공한다 : FRAM은 형광 현미경보다는 FRAP에 필요한 고출력 레이저 비싼 촛점 현미경을 필요로한다. 나는그것은 광표백 공정을 포함하지 않기 때문에, N의 첨가는, FRAM은 형광 염료의 다양한 종류가있다. 마지막으로, 두 개의 서로 다른 단층, 액적 단층과 평면 단층, 따라서 FRAP만을 단층의 자기 확산을 측정하면서 상호 확산이 측정 될 수 있도록, 독립적으로 제조 될 수있다. FRAM은 거의 점성 재료 고점도 물질로부터 확산 측정 폭넓게 제공한다. 확산 액적 유착 과정 (~ 10 밀리 초)의 시간 동안 지역 100 ㎛ 100 ㎛의 걸쳐 발생하는 경우 원칙적으로, FRAM은 기존 기술에 필적 106 μm의 2 / 초, 최대 확산 계수를 측정 할 수있다. 단분자층은 고체 아니라면 또한 느린 확산 처리를 쉽게 측정 할 수있다. FRAM은 한 적절한 형광 태그 분자로서 사용할 수있는 계면 활성제 중 어느 한 종류의 재료에 대해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>아세톤</td><td>OCI 주식회사</td><td>아세톤 3.8L 엑스트라 퓨어</td><td>순도: &ge; 99.5%, 사용 전에 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>OCI corporation</td><td>에탄올 3.8L 엑스트라 퓨어</td><td>순도: &ge; 94%, 사용 전에 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>디올레올오일포스파티딜콜린, DOPC</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850375C</td><td>사용하기 전에 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오. 클로로포름은 발암성입니다.</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>LiChrosolv</td><td>클로로포름 초순수(A3633)</td><td>순도: &ge; 99.8%, 사용하기 전에 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오. 발암성</td></tr><tr><td>로다민 DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>광표백을 방지하기 위해 직사광선 노출을 피하십시오.</td></tr><tr><td>Wilhelmy 플레이트 장력계</td><td>R& K 초박형 유기 필름 기술</td><td>Wilhelmy 장력계</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>현미경 1</td><td>대물 렌즈: Olympus</td><td>대물 렌즈: UPlanFl 10x</td><td>대물 렌즈: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>현미경 2</td><td>대물 렌즈: 올림푸스, 튜브 렌즈: Thorlabs</td><td>대물 렌즈: UPlanFl 10x</td><td>대물 렌즈: 10X NA 0.3, 튜브 렌즈: 현미경 1용 초점 거리 17cm</td></tr><tr><td>CCD Jai</td><td>CV 950 카메라</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 2</td>용 <td>CCD Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>필터 세트</td><td>크로마 기술</td><td>카탈로그 세트 49004: ET545, T565, ET605</td><td>염료 분자에 적합한 준비</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

우리는 유체-유체 계면에서 계면활성제 단층의 측면 확산성을 측정하는 새로운 방법을 도입했는데, 이를 병합 후 형광 회수(FRAM)라고 합니다. FRAM은 특히 특정 영역의 표백 후 형광 회수율을 측정하는 데 FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching) 기술과 동일한 원리를 채택하지만, FRAM은 염료 분자의 화학적 전위 구배를 유도하기 위해 광표백 염료 분자 대신 방울 병합을 사용합니다. 우리의 기술은 FRAP에 비해 몇 가지 장점이 있습니다 : 고출력 레이저가 장착 된 컨 포칼 현미경이 아닌 형광 현미경 만 필요합니다. 그것은 본질적으로 형광 염료의 선택으로부터 자유롭습니다. 또한 측정된 확산 영역을 정의할 수 있는 훨씬 더 많은 자유가 있습니다. 또한, FRAM은 액적 표면과 평평한 공기/물 계면의 단층이 서로 다른 종으로 독립적으로 준비될 때 두 가지 다른 계면활성제의 혼합 또는 상호 확산을 연구하기 위한 경로를 잠재적으로 제공합니다.

도 1에 나와있는 바와 같이, 형광 화상의 시리즈는 평면 DOPC 단층 상 DOPC 단층 도포 액적 병합 후 회복 과정에서 시간에 따라 수득 하였다. 평평한 공기 - 물 계면에서 DOPC 단층는 소량으로 도핑 된 로다 민 - DPPE하고,이 때문에 가능 밝은 색상과 새로 평면 인터페이스에 추가 어두운 영역과 배경을 시각화했다. 거기에서, 복구 프로세스는 고정 면압 23 mN의 / m에서 관찰되었다. 시간에 따른 부분의 강도 변화에 대한 방정식 (1)의 착용감이 맞는 R 2 값은 0.999이다.도 2에 도시되고, 착용감이 여전히 더 낮은 또는 높은 표면 압력에서 잘 작동한다. 이 피트로부터 얻어지는 DOPC 단층의 확산 계수는 면압 23 mN의 / m에서 27.54 ㎛의 2 / 초였다. FRAM의 추가 검증, DO의 확산 계수에 대한PC 및 디 팔미 토일 포스파티딜콜린 (DPPC) 단층은 표면 압에 따라 측정 하였다. 도 3에 도시 된 바와 같이, FRAM 9 ~ mN의 / m 면압, LC (액체 응축) 여기에서 DPPC 단층의 확산 계수의 급격한 저하를 캡처 - LE (액체가 팽창) 위상 천이 (10)를 발생하여, 값 확산 계수는 피터스 등. (19)에 의해 이전에 측정과 잘 일치한다. 또한 면압과 확산 계수의 지수 형 감쇠는 DOPC 단층에서 관찰되었고, 이러한 경향은 카루소 외. (12)에 의해 측정 된 하나와 거의 동일하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> 그림 1. (A) FRAM의 도식 그림 (병합 후 형광 복구) 기술. 입술로ID 단층 코팅 방울 평면 공기 - 물 인터페이스에 통합되어, 형광없이 지질 단층 지질 평면 형광 지질 단층에 삽입 태그. 면압 23 mN의 / m (스케일 바 = 100 ㎛)에서 DOPC 단층의 회복 과정에서 시간 (B) 형광 현미경 이미지. DOPC 단일 층의 어두운 영역이 완전히 몇 분 이내에 확산 프로세스에 의해 회수한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> 대 시간 2. 소수 강도를 그림. 검은 원과 회색 점선은, 시간으로 분별 강도에 화상 해석 (절차 4.1 4.2) 및 식 (1)의 끼워 맞춤 부분으로부터 얻어진 강도의 값을 나타내고절차 4.3에 표시된 각각. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC (삼각형)과 DPPC (빈 사각형) 표면 압력의 함수로 단일 층의 그림 3. 확산 계수. 밝은 회색 컬러와 어두운 회색 컬러 라인은 이전 피터스 등에 의해보고 된 확산 계수의 값을 나타낸다. 그리고 카루소 등., 각각. 이 수치는 정 등. (23)에서 수정되었습니다. 정 등. 랭 뮤어. (30) (48), 14369-14374에서 허가 재판. 저작권 2014 미국 화학 학회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

우리는 액적 단층을 평평한 단층으로 병합하여 유체-유체 계면에서 표면 활성 종의 측면 확산을 측정하는 새로운 기술을 제시합니다.

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

이 기술의 전반적인 목표는 서로 다른 두 계면활성제의 2차원 혼합을 관찰하고 이를 통해 확산 계수를 추출하는 것입니다. 이 기술은 세포막 내 서로 다른 종의 유동성과 상호작용뿐만 아니라, 표면 활성 엔진 간의 상호작용과 같은 생물물리학 및 표면 과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 임의의 두 표면 활성 단분자층의 혼합을 직접 관찰할 수 있다는 점입니다.두 장치 모두 매우 간단한 구성을 통해 인지질 단일층을 형성하도록 독립적으로 제어됩니다. 먼저, PTFE 코팅 캡이 있는 4L 바이알을 세척하여 인지질 용액을 준비합니다. 아세톤, 에탄올, 탈이온수로 각각 최소 3회 이상 헹굽니다.그 다음, 바이알 내부에 질소 가스를 충분히 불어넣어 수분을 제거하고, 1 mg의 인지질을 1 mL의 클로로포름에 녹여 1 mg/mL 농도로 조제합니다. 다음으로, 인지질 용액의 1% 미만 분량의 dag 인지질을 첨가합니다. 형광 현미경으로 인지질 단분자층을 관찰하기 위해, 용매 증발을 방지하도록 바이알을 폴리테트라플루오로에틸렌 테이프로 감싼 후, 샘플을 -20 °C 냉동고에 보관하여 공기-물 계면에 인지질이 증착되도록 합니다.먼저, 페트리 접시를 에탄올과 탈이온수로 최소 3회 이상 세척합니다. 그런 다음 페트리 접시에 탈이온수 10 milliliters를 채워 기-액 계면을 형성합니다. 마이크로 시린지를 사용하여 인지질 용액 수 µL를 깨끗한 계면에 도포하여 원하는 표면압을 구현하고, 실험을 수행하기 전 용매가 완전히 증발하도록 최소 30분 동안 기다립니다.Wilhelm plate 텐시오미터(Tensiometer)를 사용하여 인지질 단분자층의 표면압을 측정합니다. 단분자층의 대류 흐름은 형태, 이미징 및 표면압 측정에 방해가 될 수 있으므로, 이를 억제하기 위해 3 mm 저장조와 페트리 접시의 넓은 구역으로 연결되는 두 개의 얇은 채널이 포함된 원뿔형 장치를 사용합니다. 테이퍼형 유리 모세관의 끝단에 인지질을 코팅합니다.먼저, 아세톤, 에탄올, 탈이온수를 사용하여 유리 슬라이드를 최소 3회 세척합니다. 테이퍼드 모세관을 깨끗한 유리 슬라이드 위에 놓고, 모세관의 끝부분이 유리 슬라이드에 닿을 수 있도록 기울입니다. 유리 시린지를 사용하여 유리 슬라이드에 밀착된 모세관 끝부분에 인지질 용액을 몇 방울 떨어뜨리고, 용매가 완전히 증발하여 곡면으로 인지질 단분자층을 포함하는 액적(droplet)이 형성될 때까지 최소 30분 동안 기다립니다.테이퍼형 모세관에 탈이온수 10 µL를 채웁니다. 액적을 형성하는 데 필요한 압력을 가하기 위해 모세관을 자동 마이크로 인젝터에 연결합니다. 모세관의 위치를 정밀하게 제어할 수 있도록 마이크로 인젝터에 연결된 모세관을 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다.CCD 카메라를 사용하여 모세관의 측면 뷰를 촬영할 수 있도록 명시야 현미경을 준비합니다. 이는 현미경 1로 사용되며, Z축을 따라 액적의 정확한 위치를 관찰하고 액적의 크기를 추정할 수 있게 합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 팁 끝부분이 측면에서 보이는 위치로 이동시킵니다.현미경 1로 끝부분을 잘 관찰하면서, 모세관 끝단으로 가변적인 압력을 가해 적절한 크기의 액적이 형성될 때까지 조절합니다. 액적의 위치를 모니터링하고 제어하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 현미경 2로 사용할 도립 현미경을 준비합니다. 인지질로 코팅된 액적을 Z축을 따라 평평한 공기-물 계면으로 이동시키되, 아직 액적을 병합하지는 마십시오.현미경 1을 사용합니다. 액적의 측면도를 시각화하기 위함입니다. 평면 단층의 상단 뷰 중앙에 액적을 위치시킵니다.마이크로 매니퓰레이터를 사용합니다. 현미경 2의 명시야 현미경 모드를 사용하여 평면 단층의 상단 뷰를 시각화하십시오. 확산 계수를 더 정확하게 계산하려면, ness가 병합되어 형성된 Tacho 영역이 원형이어야 하므로, 페트리 접시 내의 흐름을 제한하고 팁 끝이 인터페이스에 닿지 않도록 하는 것이 중요합니다.액적을 평평한 기-수 계면에 병합하려면, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 액적이 계면에 병합될 때까지 평평한 계면 쪽으로 더 이동시킵니다. 현미경의 형광 모드를 사용하여 액적 병합 후의 시간에 따른 일련의 형광 이미지를 기록합니다. 두 번째로, 이미지 분석은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.회복 과정 동안 시간 경과에 따른 일련의 형광 이미지를 얻었습니다. A-D-O-P-C 단분자층으로 코팅된 액적을 평평한 DOPC 단분자층 위에 병합한 후, 23 mN/m의 고정 표면압에서 회복 과정을 관찰하였습니다. 시간에 따른 분율 강도 변화의 적합 결과가 여기에 제시되어 있습니다.이 피팅의 R squared 값은 0.999입니다. 이 피팅을 통해 얻은 DOPC 단분자층의 확산 계수는 표면압 23 mN/m에서 27.54 µm²/s였습니다. 이를 추가로 검증하기 위해, 여기에서 보여주는 바와 같이 표면압에 따른 DOPC 및 DPPC 단분자층의 형광 회복 후 측정(FRAP) 또는 확산 계수를 측정하였습니다. FRAP은 액체 응축-액체 확장 상전이가 일어나는 약 9 mN/m의 표면압에서 DPPC 단분자층의 확산 계수가 급격히 감소하는 것을 포착합니다.확산 계수 값은 이전 측정 결과와 잘 일치했습니다. 또한, DOPC 단일층에서 표면압에 따른 확산 계수의 지수적 감소가 관찰되었으며, 이는 이전에 발표된 연구 결과와 일치합니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라, 두 가지 서로 다른 지질 종 간의 혼합은 두 개의 서로 다른 단분자층(하나는 게르만 표면에, 다른 하나는 평평한 화살표 계면에 형성)을 생성함으로써 관찰할 수 있으며, 이를 통해 각 전개 후 서로 다른 지질 종 간의 상호작용과 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 생물물리학 및 표면 과학 분야의 연구자들이 세포막 내 서로 다른 종의 유동성과 상호작용뿐만 아니라 표면 활성제 간의 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.클로로(chloro)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 흄 후드(film hood) 사용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서에서 우리는 photobleaching 후 다중 광자 형광 복구를 사용하여 확산 계수를 측정하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 샘플에 대한 광학 경로를 따라 레이저를 정렬하고 적절한 실험 매개 변수를 결정함으로써 시작되며, 다음 발생을 계속하고 마지막으로 피팅 형광 복구 곡선.

Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

형광 상관 분광법(FCS)을 사용하여 일차 면역 세포의 막에서 단백질 확산을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 논문에서는 형광 표지를 위한 항체의 사용에 대해 설명합니다.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

학습하세요 액적 병합 후 형광 복구 기법을 이용하여 인지질 단분자막의 이차원 확산 계수를 측정하는 방법을. 형광 현미경으로 DOPC 단분자막의 확산을 직접 관찰하고 생물물리학 연구에 활용하세요.

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

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