Name: 인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 학습하세요 인간 기증자 눈에서 Bruch's membrane을 농축하는 조직 분리 기법을 통해 단백질 및 탄수화물 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 황반변성 등 안과 질환의 면역조절 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 박사 이삭 잠브라노와 인간의 기증자의 안구 조직의 공급에 대한 맨체스터 안과 병원 안구 은행의 직원, H &amp; E 염색 이미지 생명 과학 조직학 시설의 학부 씨 피트 워커를 인정하고 싶습니다. 특별 감사는 현미경으로 그의 도움 씨 로저 메도우로 이동합니다. SJC는 의료 연구위원회의 수신자 (MRC) 경력 개발 원정대 (MR / K024418 / 1)이고 저자는 또한, MRC (G0900538 및 K004441)에서 다른 최근의 연구 자금을 인정 시력 (1866)과 황반 사회를위한 싸움.

연구 목적으로 동의 인간의 눈의 조직을 이식 각막의 제거 다음 맨체스터 로얄 안과 병원 안구 은행에서 얻어졌다. 연구를위한 인체 조직의 사용은 인체 조직의 법 (2004) 지침에 따라, 그리고 대학 연​​구 윤리위원회의 승인 (11305 참조). 전체 부르크 막 1. 심화 <ol><li> 주위의 작​​업 공간을 청소하고 1 %의 살균제와 해부 현미경 아래 (v / v),이어서 70 % (v / v)의 에탄올로 닦아. </li><li> 확인 손을은 다음과 같습니다 (A, B 및 C로 여기에 나열된 자료 목록 참조) 하나의 새로운 일회용 메스, (일반적으로 조직 배양에 사용되는) 두 무균 세포 스크레이퍼와 핀셋 세 쌍. </li><li> 나중에 사용하기 위해 뚜껑을 유지, 일회용 페트리 접시에 눈 글로브를 놓습니다. 새로운 일회용 메스를 사용하여, 플랫 MO를 생성을 방해 할 수있는 임의의 잔여 시신경 삭제조직의 UNT. 다음, 확인 네 절개는 동일하게 3 부 (황반 부르크 막 농축)로 진행하는 것은 황반 영역을 통해 절단하지 않는 경우, 네 개의 사분면을 만들 이격. <ol><li> 가장 안쪽의 감각 신경 망막 (NSR)에서, 맥락막과 공막 (눈의 흰색)을 통해 - 절개가 안구 조직의 전체 깊이를 확장 있는지 확인합니다. 절개에게 시신경에 아이 컵의 여백에서 눈 라운드 모든 방법을 계속합니다. 이 아이 컵은 (그림 1B 참조) 평평 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 평면화 세안 컵의 일 사분면을 잡고 중심을 향해 이동 (맥락막 박리를 방지하기 위해) 그립 큰 집게 B에게 유리체 및 하부 NSR을 사용하고 주변부터 멀리 망막 색소 상피 (RPE)에서이 조직을 끌어 열린 아이 컵의 다음 상대 측에. 일반적으로,하지만 항상 유리체와 NSR 모두 하나로 분리하지. scalpe를 사용하여L은 시신경 유두에 고정 잔여 NSR을 절제합니다. </li><li> 다시 말하지만, 집게를 사용 장소에 조직 중 하나 사분면을 들고하는 동안, 부드럽게 아이 컵의 전체 내부 표면에서 망막 색소 상피 단일 층을 제거하기 위해 무균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. 이 세포는 쉽게 분리하고 어두운 갈색 색소 덩어리를 볼 수 있습니다. 부드럽게 아이 컵에서 멀리 빠질 망막 색소 상피 세포를 씻어 PBS로 씻어. </li><li> 다음, 가볍게 4 눈 사분면에서 (브루흐의 막과 맥락막 모두 포함) 위에 놓인 어두운 붉은 조직을 벗겨 집게를 사용합니다. 깨끗한 접시에 절제 조직을 놓습니다. </li><li> 하나의 셀 스크레이퍼의 평평한 가장자리를 사용하여, 장소에서 적출 된 조직을 잡고 부드럽게 조직을 긁어 두 번째 스크레이퍼를 사용합니다. 가능한 한 많은 과잉 물질을 제거, 이상 조직을 켜고 반복합니다. 결국, 반투명 막이 남아 :이 조잡 농축 브루흐의 막이다. 20X 배율의 최소 해부 현미경을 사용하는 것이다브루흐의 막 맥락막과 농축의 제거를 돕는 필수적. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 간단하게 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 막 배치하기 전에 잔류 맥락막과 혈액을 제거하기 위해 초순수와 브루흐의 막을 린스. </li><li> 어떤 오염 세포 문제를 용균 수 있도록 약 1 ml의 초순수 및 와류 간단히 (약 15 초)에 농축 부르크 막 일시 중단 (그림 2 참조). 막 펠렛과 뜨는을 대기음 30 초 동안 500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 참고 : 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 또는 저장 (섹션 2 아래에 설명 된대로) 나머지 풍부한 부르크 막 가용화를위한 준비가되었습니다. </li></ol> 전체 농축 브루흐의 막과 서양 얼룩 분석 2. 가용화 <ol><li> 500 μL 8 M UR의 조직을 침지시켜 풍부한 부르크 막에서 단백질을 추출1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (그림 3A)에 실온에서 6 시간 동안 개. </li><li> 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 용해 된 샘플은 남아있는 세포 외 물질을 펠렛. 상층 액을 제거하고 3,500 다 MWCO 투석 막에 전송 한 후 4 ℃에서 16 시간 동안 dialyse하는 PBS의 1 L에 샘플을 배치합니다. </li><li> 각 샘플에 대해, 단백질 분리 비드 40 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 샘플 / 비드 혼합 (회전 믹서에서 20 RPM)로 회전한다. </li><li> 5 분 10,000 XG에 원심 분리기 샘플은 구슬을 펠렛. (/ V) 글리세롤 승, 0.01 % 브로 모 페놀 블루, 3 % β-머 캅토 에탄올 (65.8 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 2.1 % SDS 26.3 %)을 30 μL 배 샘플 로딩 버퍼에 구슬에 결합 된 단백질을 상층 액을 제거하고 용해. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 샘플을 인큐베이션하고, 5 분 나머지 비드 펠렛 위해 10,000 XG 원심 분리기. </li><li> 프리 캐스트에에 출시 된 단백질을 포함하는 상층 액을로드 SDS-단백질 분리를위한 페이지 그라데이션 젤 (자료 목록 참조). </li><li> 예를 들어, 일반적인 염색 프로토콜, 쿠마 블루를 사용하여 분리 된 단백질 밴드를 시각화. <ol><li> ((W / V), 50 % 메탄올, 10 % 빙초산, 40 % 물, 0.1 % 브릴리언트 블루) 겔, 및 교반과 함께 RT에서 30 분 동안 간단히, 브릴리언트 블루 염색 20 ㎖를 추가 부화 . </li><li> 염색 액을 버리고 배경 염색 충분히 염색 된 단백질 밴드를 시각화 할 수 있도록 감소 될 때까지, 탈 이온수로 염색 겔 씻는다. </li><li> 아래에 설명 된대로 또는, 전송, 서부 분석을 위해 니트로 셀룰로오스에 단백질 밴드를 분리. </li></ol></li><li> 전송은 전송 버퍼의 반 건조 이송 장치 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 10 % [v / V를 메탄올)를 사용하여 2.5 시간 동안 80mA에서 니트로 셀룰로오스 막에 단백질 밴드를 분리. </li><li> 10 ml의 PBS, 10 %에 막을 차단 일 전에 4 ℃에서 16 시간 동안 우유, 0.02 % (W / V) BSA (/ V W)단백질 검출을위한 소정의 일차 항체 E 첨가. 참고 : 여기에 예를 들어, 그림 3c는 보완 캐스케이드, 인수 H-같은 단백질 1 (FHL-1)의 조절에 대한 탐색 할 세 가지 별도의 기증자로부터 가용화 부르크 막의 대표적인 면역을 보여줍니다. </li></ol> 3. 농축 황반 브루흐의 멤브레인의 <ol><li> 전술 한 바와 같이 1.3 - 단계 1.1를 따릅니다. </li><li> NSR 자리에 여전히 동안 중앙 황반 영역 (그림 4 참조) 나타내는 노란색 중심와의 착색을 찾습니다. 멸균 6mm 생검 펀치를 사용하여 중심와 영역 위에 배치 단단히 황반에 잘라. <ol><li> 대신 생검 펀치 유지 깨끗한 생검을 달성하기 위해 주위의 눈 재료를 벗겨, 생검 펀치 블레이드의 가장자리에 아이 컵의 가장자리에서 메스 별도의 절개를 한 후 집게 B를 사용. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 C, 제거깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 펀치와 장소에서 조직의 6mm 디스크. 해부 현미경 페트리 접시의 뚜껑과 황반 펀치를 놓습니다. </li><li> (조직 검사의 정확성을 추론하는 노란색 중심와​​ 염색 검사) 얇은 NSR 디스크를 제거합니다. 부드럽게 망막 색소 상피 세포를 제거하는 살균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. </li><li> 트위터 A의 팁을 사용하여 공막을 통해 황반 디스크를 고정하고 천천히 맥락막과 트위터 다 다시를 사용 부르크 막 복합체를 벗겨, 브루흐의 막에서 원치 않는 맥락막 혈액 물질을 제거하는 세포 스크레이퍼를 사용합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 황반 부르크 막 넣고 1ml의 초순수에 일시. 소용돌이 짧게 (약 15 초) 어떤 오염 세포 문제를 용균 도움이됩니다. 막 펠렛과 뜨는을 대기음 30 초 동안 500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 주 : 황반 분리 농축 부르크 막 해주기 단백체 위해 사용될 수있다alysis는 사용자가 선호하는 소화 프로토콜을 사용. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에서 우리는 추가 분석이 서양 블롯 (11), 질량 분석 및 활용 수정 챔버 11,14 Ussing 브루흐의 멤브레인의 확산 특성을 포함한 이후의 분석을 허용하는 브루흐의 멤브레인의 농축에 대해 설명합니다. 중요한 단계는) 눈의 내면의 철저한 긁고 세탁 부르크가 붕괴를 발생시키지 않고 모든 RPE 세포 b) 하부 맥락막의 반복 및 조심 긁어 제거하고, 초순수에서 적출 부르크의 c) 세척 포함 잔여 세포의 용해를 확인합니다. 농축 부르크 막 단백질체 분석에 이용 될 것인지 또한, 우레아 처리하여 단백질을 추출 기계적 균질화 같은 다른 방법에 비하여 탄성이 조직을 분해에 가장 효과적이다. 풍부한 부르크 막의 조직학은 맥락막 모세의 ECM이 제거되지 않음을 나타냅니다. 이 전 할 것입니다pentilaminar 부르크 막의 외층은 예견했던 맥락막 모세 내피 세포의 기저막에 의해 형성된다. 실제로는 변화가 터미널 보완 복잡한 / 막 공격 복합체 (MAC) (15)의 증착을 포함한 AMD이에서 발생하는 맥락막 모세의 ECM이 남아 유리할 수있다. 그것은 공막, 맥락막, 및 부르크 막의 존재 단면 경우 부르크 막 상세한 조직 학적 분석을 위해, 그것의 구조가 잘 보존 될 것이라는 점에 유의해야한다. 실제로,도 2에 제시된 조직학는 전적으로이 원고에 기재된 기술로부터 얻어진 농축의 정도를 설명하기위한 것이다. 황반 부르크의 농축은 NSR 특히 황반이 손상되지 않도록 보장, 아이 컵의주의 절개가 필요합니다; 그렇지 않으면 식별 및 황반의 이렇게 분리가 불가능합니다. tissu의 무결성전자는이 과정에 중요하며 따라서 48 시간 사후 시간에서 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 농축 정도는 도너 사이에서 변화하고 도너 연령, 사후 시간, 및 안구 병변의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 농축 된 용어의 사용은이 &#39;정제&#39;또는이 방법을 사용 부르크 막 &#39;차단&#39;은 단순히 불가능하다고되고, 기술의 한계를 인정할 의도적이다. 실제로, 맥락막 모세의 ECM은 브루흐의 막으로 병합 주어진 것은이 완전한 분리는 가능하지 않습니다. 각각의 안구 조직의 생화학 적 변화를 이해하는 것은 눈 질병의 진행을 이해하는데 필수적이다. 브루흐의 멤브레인의 독특한 농축이 이해를 용이하게; 진행중인 연구는 AMD의 다른 단계에서 질량 분석법을 이용하여 농축 된 황반 부르크 막 프로테옴을 조사다른 유전자형을 가진 환자에서 발생하는 샘플에서 AMD의 분자 병리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 이미 기술 된 기법을 성공적으로 농축 부르크 막에 부르크 막 (11) 및 추가 연구의 주된 보체 조절 제로 FHL-1을 식별하는 데 사용 된 AMD의 분자 병리에 더 많은 새로운 통찰력을 초래할 가능성이있다.

안과 연구의 사후 부검 인간의 눈 조직의 사용은 안과 질환의 발병 기전의 이해를위한 귀중한 자원이다. 인간의 기증자 눈의 분석은 서구 세계 1 실명의 주요 원인 인 노인성 황반변 성 (AMD)을 뒷받침하는 메커니즘을 분별하는 중요한 기여를했다. 전 세계적으로, AMD는 모든 실명의 약 8.7 %를 차지하고과 점점 고령화와 함께, 그것은 중심 시력의 손실에서 2020 2. AMD 결과에 의해 196,000,000명에 영향을 미칠 것으로 예상되고, 환자의 독립성과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다 3. 초기 AMD 드루 젠이 형성되는 것을 특징으로하며 (또한, 혈관 신생 또는 &quot;습식&quot;AMD 라 함) (때로는 &quot;건식&quot;AMD 라 함) 지리적 위축, 또는 황반변 성으로 진행할 수있다. 안티 VEGF 동안 주사는 안정하거나 신생 혈관 AMD의 IT 내가 시력을 향상치료가 아니다, 그리고 현재 어떤 치료는 지리적 위축에 대한 존재하지 않습니다. 특정 유전자 변이가 AMD의 위험 4 수정하는 것으로 나타났다 동안 - 8, 이하 이러한 변형은 생화학 적 수준에서 황반에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 알려져있다. AMD의 발병 기전에 중요한 사이트는 브루흐의 막이다. 이 구조와 다양한 연구 내에서 드루 젠 형태와 AMD 9 부르크 막 주위 보체 활성화의 증거를 제공했다. 부르크 막 맥락막으로부터 망막 색소 상피 세포를 분리하는 세포 외 기질의 시이트이고, 약 4 ㎛의 두께이다. 부르크 막 맥락막 모세로 병합 유창 모세 혈관이 외부를 포함 맥락막의 층은 큰 혈관 (10) (도 1a)을 함유하는 층이다. 브루흐의 멤브레인은 별도의 pentilaminar 시트입니다세포 기질 (ECM), 그리고이 방법은 적혈구와 크게 decellularized 무료 인 (이하, 부르크 막 농후 함)의 기본 맥락막 모세 ECM과 함께, 부르크 막 분리 방법 자세히. 농축 부르크 막 후 웨스턴 블 롯팅 및 조직학 실험에 사용 하였다. 또한, 눈의 황반 지역에서 유일하게 브루흐의 멤브레인을 풍부하게하기위한 방법이 설명되어 있습니다, AMD의 생화학 적 측면을 조사하는 사람들에게 특히 관심이 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>보조 대물렌즈 0.5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>전체 눈의 저배율 이미징에 유용한(필수는 아님) 편평</td></tr>한 <tr><td>산 생검 펀치 6mm</td><td>Oncall 의료 용품</td><td>SCH-33-36</td><td>6mm 생검 펀치</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>멤브레인 농축용</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>멸균, 개별 포장된 Swann-Morton 메스.</td></tr><tr><td>30cm 암에 듀얼 구즈넥 LED 스포트 라이트</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>해부 및 이미징에 필수적인 유연한 광원</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>D8537</td><td>황반이 건조해지는 것을 방지하고 막 농축 중에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>(A) 집게</td><td>과학 실험실 용품</td><td>INS4280</td><td>(A) 세밀(100mm) 및 직선</td></tr><tr><td>(B) 집게</td><td>과학 실험실 용품</td><td>INS4272</td><td>(B) 넓고 뭉툭한(150mm). 샘플의 많은 부분을 들어 올리는 데 유용합니다</td></tr> <tr><td>(C) 집게</td><td>과학 실험실 용품</td><td>INS4323</td> <td>(C) 직선 미세 점</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 디지털 컬러 카메라 & GT-Vision 소프트웨어</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sterilin</td><td>101VR20</td><td>90mm, 샘플</td></tr> <tr><td>접시로 사용단백질 분리 비드 (Strataclean 수지)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경 GXMXTL3T (배율 범위 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>해부 중 사용 편의성을 위해 붐 스탠드에 부착 된 실체 줌 현미경</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

연령 관련 황반 변성 (AMD)은 선진국에서 시각 장애의 주요 원인이다. 질병은 중심 시력의 손실의 결과, 망막 황반의 호출 센터의 파괴로 드러난다. 초기 AMD는 지리적 위축 (AMD 건조) 또는 혈관 신생 (젖은 AMD)으로 늦은 AMD에 진행 할 수 있습니다 부드러운 드루 젠이라는 작은, 황색 병변의 존재에 의해 특징입니다. 임상 적 변화가 잘 설명하고 있으며, AMD의 위험을 부여에 유전 적 영향에 대한 이해가 더욱 상세한지고 있지만, 주요 진행 상황을 결여 한 영역은 유전 적 위험의 생화학 적 결과에 대한 이해이다. 이것은 부르크 막, 혈액 공급으로부터 물질의 생물학적 필터 및 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층이있는 지지체 역할을 매우 얇은 세포 외 기질의 생화학을 이해하는데 어려움을 부분적으로 기인한다. 드루 젠 F브루흐의 막과 자신의 존재 내에서 ORM은 망막 색소 상피 세포에 영양분의 흐름을 방해. 만 다른 단백질이 상호 작용하는 방식 참으로 브루흐의 막 단백질 성분을 조사,에 의해, 연구진은 드루 젠 형성, 개발 AMD의 이후 시력 상실을 뒷받침 생화학 적 메커니즘을 해명 희망 할 수 있습니다. 이 문서는 하류 생화학 적 분석에 사용, 이것은 이미 부르크 막 생화학의 이해를 변경하는 방법의 예를 제공 할 수 있도록, 전체 브루흐의 막, 또는 단지 황반 영역에서 하나를 풍부하게하기위한 방법을 자세히 설명합니다.

상기 프로토콜 부르크 막, 맥락막 모세의 ECM의 고립 부르크 막 농축하고 결과 RPE를 모두 포함한 세포 / 세포 파편 (도 2)의 대부분을 제거 생성한다. 물에 농축 부르크 막의 세척 남아있는 맥락막 세포를 용균의 핵심 단계이다. 맥락막의 폐기시에 가해지는 압력은 브루흐의 막 (그림 2B)로 정의 된 영역으로 몇 가지 남아있는 세포 핵의 일부를 압축 나타납니다. 농축 부르크 막의 용해 화는 단백질 함량의 하류 분석을 허용한다. 4 사용 부르크 막 농축 가용화에서 단백질 밴드의 분리 - 단백질 함량을 식별 그 자체 동안 유용하지 12 % 구배 SDS-PAGE 겔, 아칸소 오염 혈액 단백질을 최소화하기 위해이 기술의 능력을 입증하지E 비특이적 결합 (도 3B). 농축 부르크 공막의 조직 학적 분석이도에 도시 된 2에도 대응이 점에있어서, 상기 단백질을 겔 실행에서 하나의 현저한 결근 인간 혈청 알부민의 상당한 대역 달리 후속 웨스턴 해석하기 어려운 블로 팅을 할 수있다 (~ 66 kDa의 분자량)이며 이. 작품의 일부는 이전 11 설명 된대로 실제로, 개인 기부자의 시리즈에서 브루흐의 막 서쪽 블로 팅 (그림 3C)를 통해 특정 항체를 사용하여 단백질의 번호를 프로빙 된 가용화. 여기에 도시 된 경우, (OX23 지칭) 항체에 12라는 보체 인자 H (FH)을 사용하고, 선천성 면역의 155 kDa의 레귤레이터에 대해 지시 분리되는 세 부르크 막 샘플에 저 분자량 밴드의 존재를 입증 기증자 (그림 3C). 이는이어서 인수 H 형 단백질을 1로 밝혀졌다 (FHL-1), 49 kDa 단백질에 관한 FH와 동일한 유전자 (13)의 접합부에서 발생하는 변화. FHL-1은 브루흐의 막 (11)의 주요 보수 레귤레이터 존재하는 것으로 나타납니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> 부르크 멤브레인의 인간의 눈과 보충도 1의 해부. (A) 부르크 막 외 매트릭스 장벽이다. 맥락막은 (맥락막 모세 불림) 연속적 부르크 막에 병합 유창 모세관 층을 포함하고, 이러한 생리적 시각 세포를지지하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층에서 (큰 혈관을 포함) 맥락막의 나머지 부분을 분리 감각 신경 망막 (NSR). (B)의 인간 접안부에 포 절개는 평면 실장 만들 개방 될 수 있도록 제조된다. 그만큼유리체는 핀셋을 사용하여 제거 할 수있다. NSR은 유리체와 함께 빠질 수뿐만 아니라 핀셋으로 제거 할 수 있습니다. 셀 스크레이퍼는 여전히 맥락막과 공막에 고정되는 동안 브루흐 막에서의 RPE 세포 층을 제거하기 위해 사용된다. 부르크 막 / 맥락막 착체 멀리 공막로부터 박리 될 수 있고, 새로운 셀 스크레이퍼를 사용하여, 외부 맥락막 제거 할 수있다. 초순수의 최종 세척이 남아있는 세포 문제를 lyses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> 그림 2. 고순도 워싱턴에서 브루흐의 막 세척에서 외부 맥락막 구조를 긁어 브루흐의 막과 (A) 전에 맥락막. H &amp; E 염색 섹션의 조직학과 후 (B)터가 브루흐의 막 농축 생성합니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> 도 단백질 함량 분석을위한 농축 부르크 막의 용해 화 3.이. (A) 단백질은 PBS에 대해 투석 전에, 실온에서 6 시간 동안 8 M 우레아 잠복기 충실 부르크 막으로부터 추출 될 수있다. 웨스턴 분석을 위하여, 전체 부르크 막 투석액에서 단백질은 단백질 분리 비드를 이용하여 분리 및 용출 램 믈리 시료 로딩 버퍼 환원성 끓여. (B) 대표 쿠마시 블루 둘 다 단정 보여주는 SDS-PAGE 겔을 염색 부르크 막 가용화 희석 될 수있다 (BM)에있어서, D를 사용하여. (A)에 escribed (C) 3 개인 기부자로부터 가용화 부르크 막의 대표적인 웨스턴 블롯 (레인 1-3). 인수 H-같은 단백질 1 (FHL-1)에 대한 프로브 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> 황반에서 농축 부르크 막 그림 4. 격리. 망막 황반 영역 5mm의 용이 상부 중심와의 황색 착색에 의해 식별 될 수있는 영역과, 인접하는 광 디스크의 근접성이다. 가이드로 중심와를 사용하여, 6mm 황반 조직 블록을 절제하는 평면 장착 인간의 눈에 6mm 생검 펀치를 배치합니다. 상부의 NSR를 제거하고 절제 황반에서 망막 색소 상피 세포를 긁어. 나머지 부르크 막 / 맥락막의 복잡한 수N 멀리 공막에서 박리하고 철저를 Lyse 초순수의 침수에 의한 세포 물질을 나머지, 맥락막을 제거하기 위해 긁어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

인간의 눈에서 브루흐 막과 특이적으로 관련된 단백질을 식별하는 것은 노화 관련 황반 변성과 같은 안과 질환 뒤에 있는 생화학적 메커니즘을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 다운스트림 생화학 분석을 위해 이 세포외 기질 시트를 농축하는 방법을 설명합니다.

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

이 조직 박리 기술의 전반적인 목표는 사후 인간 안구에서 브룩스 막(Brooks membrane)을 농축하여, 단백질 및 탄수화물 함량 분석에 필요한 특정 재료를 과학자들에게 제공하는 것입니다. 이 방법은 서구 사회에서 가장 흔한 실명 원인인 연령 관련 황반변성을 포함하여, 다양한 안과 질환의 기저가 되는 브룩스 막의 면역 조절과 같은 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈액 성분이나 망막 색소 상피 세포의 오염 없이 무세포성 브룩스 막만을 분석할 수 있게 하여, 결과의 왜곡을 방지한다는 점입니다.인체 조직의 취급이 까다롭고, 풍부한 브룩스 막(brooks membrane)의 분리 과정을 서술된 방법론만으로는 시각화하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Selena Mcca 박사가 진행하겠습니다. 먼저 소독제로 현미경 주변과 하단의 작업 공간을 세척한 후, 70% ethanol로 해당 구역을 닦아냅니다. 다음으로 절차에 필요한 도구들을 준비하고, 준비가 되면 안구를 일회용 Petri dish에 넣고 뚜껑은 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다.새 일회용 메스를 사용하여 조직의 평평한 마운트를 만드는 데 방해가 될 수 있는 잔여 시신경을 제거합니다. 다음으로, 동일한 간격으로 네 번 절개하여 네 개의 사분면을 만듭니다. 안구의 전체 깊이까지 관통하되, 황반 브룩 막(macular brooks membrane)을 농축하는 경우에만 황반 부위를 절단하지 않도록 주의하십시오.안구 컵의 가장자리부터 시신경까지 주변을 따라 절개를 계속합니다. 이렇게 하면 안구 컵을 평평하게 펼 수 있습니다. 다음으로, 한 개의 핀셋으로 평평하게 펼쳐진 안구 컵의 한 사분면을 잡고, 더 큰 핀셋 세트를 사용하여 유리체와 그 아래 조직을 잡습니다.주변부에서 시작하여 중심을 거쳐 반대편으로 이동하며 이 조직을 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)로부터 떼어냅니다. 유리체와 신경감각망막이 하나로 분리되지 않는 경우, 조직의 한 구역을 고정한 상태에서 메스를 사용하여 시신경 유두에 고정된 잔여 조직을 절제합니다. 멸균된 셀 스크래퍼를 사용하여 안구 컵의 내부 표면 전체에서 RPE 단층을 부드럽게 제거합니다.이 세포들은 쉽게 떨어져 나가며 진갈색의 색소성 덩어리로 관찰됩니다. PBS로 헹구어 떨어져 나온 RPE 세포들을 부드럽게 씻어냅니다. 다음으로, 안구의 네 분면 모두에서 상층의 진빨간색 조직을 조심스럽게 벗겨냅니다.절제된 조직을 깨끗한 디시에 넣습니다. PBS를 몇 방울 추가하고, 필요한 경우 세포 스크레이퍼와 핀셋을 사용하여 조직을 편평하게 폅니다. 하나의 세포 스크레이퍼의 평평한 가장자리로 절제된 조직을 고정시킨 상태에서, 두 번째 스크레이퍼를 사용하여 조직을 부드럽게 긁어냅니다. 조직을 뒤집어 이 과정을 반복하며 불필요한 물질을 최대한 제거합니다.조직을 깨끗한 페트리 접시에 넣습니다. 물질이 제거되면 남아 있는 반투명한 막이 거칠게 농축된 Brooks 막입니다. 해부 현미경 하에서 맥락막을 제거하여 막을 더욱 농축합니다.마이크로 원심분리 튜브에 넣기 전, 잔류 맥락막과 혈액을 제거하기 위해 brooks membrane을 초순수로 짧게 헹굽니다. membrane을 약 1 mL의 초순수에 현탁시킨 후, 오염된 세포 물질을 용해시키기 위해 짧게 vortexing합니다. 샘플을 원심분리하여 펠렛을 형성시킨 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.남아있는 농축된 brooks 막은 이제 가용화할 준비가 되었으며, 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 추후 농축된 brooks 막에서 단백질을 추출하기 위해, 조직을 8 M urea 500 µL에 6시간 동안 담급니다.실온에서 가용화된 샘플을 원심분리하여 남아 있는 세포 외 물질을 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 이를 투석 막으로 옮깁니다. 샘플을 1 L의 PBS에 넣고 4 °C에서 16시간 동안 투석합니다.각 샘플에 protein isolation beads 40 µL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 혼합물을 회전시킨다. 원심분리를 통해 비드를 펠릿화하고 상층액을 제거한다. 비드에 결합된 단백질을 2x sample loading buffer 30 µL에 용해시킨다.10분 동안 배양한 후, 비드를 원심 분리하여 펠렛으로 만들고 상층액을 수집합니다. 방출된 단백질을 단백질 분리를 위한 프리캐스트 SDS page 그라디언트 젤에 로딩합니다.원하는 경우, 표준 절차에 따라 분리된 단백질 밴드를 시각화하십시오. 표준 실험실 절차에 따라 western blot을 수행하십시오. 황반 브룩스 막(Brooks membrane)을 농축하려면, 신경감각 망막이 아직 제자리에 있을 때 중심 황반 영역을 나타내는 노란색 중심와 색조를 찾는 것을 제외하고는 앞서 시연한 것과 동일한 절차를 따르십시오.멸균된 6mm 생검 펀치를 중심와 영역 위에 놓고 황반을 단단하게 절개하며, 생검 펀치를 그 자리에 유지합니다. 메스를 사용하여 안구 컵의 가장자리부터 생검 펀치 날의 가장자리까지 별도로 절개합니다. 주변 안구 조직을 벗겨내어 깨끗한 생검 시료를 얻습니다.펀치에서 6 mm 조직 디스크를 제거하여 앞서 준비해 둔 깨끗한 페트리 접시 뚜껑 위에 놓습니다. 페트리 접시 뚜껑과 황반 펀치를 실체 현미경 아래에 배치합니다. 노란색 중심와 염색 여부를 확인하여 생검의 정확성을 추론합니다.다음으로, 멸균된 세포 스크레이퍼를 사용하여 RPE 세포를 부드럽게 제거합니다. 핀셋 끝으로 공막을 통해 황반 원반을 고정한 후, 맥락막과 브룩스 막(brooks membrane) 복합체를 천천히 벗겨냅니다. 필요한 경우, 메스 날을 사용하여 브룩스 막을 공막으로부터 분리합니다.다시 한번 셀 스크레이퍼를 사용하여 Brooks membrane에서 불필요한 맥락막과 혈액 물질을 제거합니다. 황반 Brooks membrane을 튜브에 넣고 1 mL의 초순수에 현탁합니다. 짧게 볼텍싱하여 오염된 세포 물질을 용해시킵니다. 샘플을 원심분리하여 membrane을 펠릿화하고 상층액을 흡입하여 제거합니다.황반에서 분리된 농축 브룩스 막(brooks membrane)은 이제 원하는 소화 프로토콜을 사용하여 단백질 분석에 사용할 수 있습니다. 외측 맥락막 구조를 긁어내기 전과 후의 인간 황반 조직의 h 및 d 염색 조직 절편은 맥락막 기질로부터 브룩스 막과 무세포 맥락막 모세혈관(acellular chorio capis)이 농축되었음을 보여줍니다. 이 SDS page 겔은 원액 및 희석된 브룩스 막 샘플 모두에서 혈액으로 인한 알부민 오염이 없음을 보여줍니다.이 대표 웨스턴 블롯은 3명의 개별 기증자 중 한 명의 면역 조절 인자인 factor H-like protein을 검출하기 위해 프로빙한 결과입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이 독특한 무세포 구조의 후속 생화학 및 생물물리학적 분석을 위한 가치 있는 자원을 제공할 수 있도록 인간의 눈에서 브룩스 막(Brooks membrane)을 농축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인체 조직 및 날카로운 도구를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 전체 개인 보호 장구 착용 및 B형 간염 예방 접종과 같은 예방 조치가 필요함을 잊지 마십시오.인체 조직을 다루기 전에는 항상 적절한 조치를 취해야 합니다.

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Neuroscience

신경과학

분해 기술은 높은 처리량 화면에서 phenotyping을 수행 할 조직 고정에 대한 마우스 눈의 핵의 제거를 보여줍니다.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

이 비디오는 안구 미세혈관 신생을 연구하기 위한 맥락막 발아의 생체 외 모델 개발을 보여줍니다. 이 분석은 맥락막 미세혈관 발아를 촉진하는 특정 조건에서 공막과 망막 색소 상피에 부착된 맥락막 조직을 포함하는 쥐 눈 외식물을 배양하는 것을 포함합니다.

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잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

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인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

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