사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포를 안정적으로 생성하는 것입니다. 이 방법은 내피 세포 기능 장애가 폐동맥 고혈압 또는 폰 빌레브란트 병을 포함한 심혈관 질환에 어떻게 기여하는지와 같은 혈관 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량의 성인 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포의 안정적인 집단을 일관되게 생성한다는 것입니다.시연 절차는 제 연구실의 대학원생이자 연구실인 Nicholas Morrell 교수인 Christopher Wang

이 절차를 시작합니다. 각 기증자에 대해 2개의 50ml 원추형 원심분리기 튜브 각각에 3ml의 구연산나트륨을 추가합니다. 그런 다음 수집된 혈액 30ml를 각 튜브에 추가합니다.

혼합을 위해 튜브를 두세 번 부드럽게 뒤집습니다. 다음으로, 60ml의 혈액을 DPBS로 1:1 비율로 희석하여 밀도 구배가 포함된 튜브를 기울입니다. 피펫 보조제와 25 밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 작업 표면과 20도 각도의 원심분리 매체.

배지 위에 21ml의 희석된 혈액을 천천히 겹칩니다. 그 후, 가속기를 사용하여 실온에서 35분 동안 400배 G로 샘플을 원심분리하고 원심분리 중에 스톡을 희석하여 밀리리터당 50마이크로그램의 콜라겐 용액을 분리합니다. 10 밀리리터의 1 형 콜라겐 0.02 몰 아세트산 멸균.

사용하기 전에 콜라겐 현탁액을 여과하십시오. 다음으로, 콜라겐 용액 7.5ml를 T 75 세포 배양 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 실온에서 1시간 동안 코팅합니다.

코팅 1시간 후, 콜라겐 용액을 흡인하고 플라스크에 DPBS 10ml를 피펫팅하여 잔류 아세트산을 씻어냅니다. DPBS를 흡입하고 세척을 한 번 더 반복합니다. 그런 다음 플라스크에 5ml의 BOEC 생성 배지를 추가하여 세포 현탁액이 도금할 준비가 될 때까지 콜라겐 코팅이 건조되지 않도록 합니다.

밀도 구배 원심분리 후 멸균 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 buffy coat 층을 조심스럽게 수집하고 밀도 구배 매체를 이동시키지 마십시오. 버피 코트의 수집은 각 튜브에서 약 20ml의 셀 현탁액과 플라즈마를 생성해야 합니다. 그 후, DPBS에서 단핵 셀 현탁액을 1:1의 비율로 희석하고 반전하여 혼합한 후 원심분리 후 브레이크와 가속기를 최대로 설정한 상태에서 300배 G로 실온에서 20분 동안 원심분리하고, 상등액을 흡인하고 각 펠릿에 1ml의 BOEC 생성 배지를 첨가하고 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 모든 세포 현탁액을 함께 당겨 보충하여 세포를 재현탁합니다. 나머지 매체와 함께 총 부피는 10 밀리리터입니다.

총 세포 수를 추정하려면 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 490 마이크로 리터의 Turk 용액으로 희석하여 적혈구를 추출합니다. 그런 다음 혈구 분석기를 사용하여 희석된 세포 현탁액의 10마이크로리터 샘플을 계수합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 단일 콜라겐으로 코팅된 T 75 플라스크에 플레이트

플라스크 및 배양당 최대 15ml의 중간 부피를 얹습니다. 5%CO2를 함유한 가습 대기에서 섭씨 37도의 세포. 이제 15ml의 새로운 BOEC 세대를 추가하여 2일에 한 번씩 배지를 교체하고, 주말에는 배지를 배양하고, 배지 교체는 3일마다로 지연할 수 있습니다.

7일째부터 14일째에 BOEC 배양 플라스크를 모니터링하여 외종 군체의 출현을 확인합니다. 군체를 고전적인 내피 조약돌 형태를 나타내는 세포의 원형 그룹으로 식별합니다. 플라스크에서 하나 또는 여러 개의 군체가 확인되면 중간 변화를 계속하고 군체가 군체당 약 1000-2000개의 세포로 성장할 수 있도록 합니다.

포장하기 전에 대략적인 시각적 추정치를 통해 군집별 세포 수를 결정하십시오. 그런 다음 10ml의 DPBS로 플라스크를 두 번 헹궈 세포를 계대에 계대시킵니다. 5ml의 1 x 트립 EDTA를 넣고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.

5분 후, FBS가 함유된 배지 10ml로 트립신을 중화하고 반복적인 피펫팅으로 세포를 현탁액으로 만듭니다. 다음으로 300배 G에서 5분 동안 현탁액을 원심분리합니다. 15ml의 새로운 BOEC 생성 배지에 세포를 재현탁하고 전체 세포 현탁액을 콜라겐 코팅이 되지 않은 새로운 T 75 플라스크에 플레이트링합니다. 계속하다.

세포가 합류하여 통로가 될 때까지 배지가 변합니다. 연속 포장 플레이트를 위해 앞서 설명한 바와 같은 셀. T 75 플라스크당 750, 000개 이상의 세포가 세포 밀도가 낮으면 BO eecs가 증식을 멈출 수 있습니다.

이 절차에서 트립신은 세포를 주시하고 5분 동안 300배 G로 원심분리합니다. 그 후, snat을 흡인하고 10 밀리리터의 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 세포 현탁액의 10마이크로리터 샘플을 수집하고 수동 세포 계수를 수행합니다.

다음으로, 샘플을 다시 원심분리하고 10배에서 밀리리터당 6개의 세포로 얼음처럼 차가운 극저온 보존 배지에 재현탁합니다. 각 바이알에 0.5ml의 세포 현탁액을 추가하고 바이알을 얼음처럼 차가운 이소프로판올 동결 보존 용기에 넣습니다. 그런 다음 액체 질소로 전환하기 전에 용기를 섭씨 80도의 음의 냉동고에 최소 2시간 동안 넣습니다.

세포를 해동하려면 15ml 원추형 원심분리기 튜브에 10ml의 예열 배지를 추가합니다. 액체 질소에서 세포를 제거하고 섭씨 37도의 수조에서 바이알에 작은 얼음 결정만 남을 때까지 부드럽게 저어주면서 해동합니다. 그런 다음 바이알의 내용물을 원뿔형 원심분리기 튜브에 적가하고 5분 동안 300배 G로 회전합니다.

그 후, 상등액을 흡인하고 세포 펠릿을 현탁시킵니다. T 75 플라스크에 셀 현탁액을 추가하고 중간 용량을 15ml까지 채웁니다. 이 이미지에서, 내피와 같은 세포의 집합체로 나타나는 파생 군체는 조약돌 단층으로 배열되어 방사상으로 증식하며, 성장 군체를 둘러싼 중심점에서 방사상으로 증식하는 것은 초기 배양에서 세포의 대다수를 구성하는 부착 단핵 세포입니다 포장 후, 비증식 단핵구세포가 죽거나 재부착에 실패함에 따라 고도로 증식하는 bo Oecs가 배양을 인수합니다.

다음은 내피 세포 표면 마커 CD 1 44에 대한 항체로 염색된 Bo Oecs 면역의 대표적인 면역형광 이미지입니다. 그리고 이 이미지에서 B oecs는 혈액 당단백질 폰 빌레브란트 인자에 대한 항체로 면역 염색되었습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 가능한 한 빨리, 가급적이면 채취 후 2시간 이내에 혈액 샘플을 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포는 건강 및 질병에서 내피 세포 기능을 연구하는 데 사용되거나 분화 연구, 질병 모델링 또는 개발 후 세포 치료에 사용하기 위해 유도된 강력한 줄기 세포로 재프로그래밍될 수 있습니다. 이 기술은 환자의 혈액 성장 내피 세포와 IPSC가 기분 근육 세포를 유도하는 폐동맥 고혈압의 발병기에 대한 2형 뼈 형태 유전 단백질 수용체의 돌연변이가 미치는 영향을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 소량의 말초 혈액에서 안정적인 혈액 성장 내피 세포를 생성하고 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 검사되지 않은 사람의 혈액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험실 가운을 포함한 개인 보호 장비를 항상 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.