Name: 의 생리적 반응을 측정 초파리 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 학습하세요 Drosophila 미각 감각 뉴런의 생리적 반응을 지질 페로몬에 대해 라이브 칼슘 이미징 기법으로 측정하는 방법을. 이 기술은 미각 수용체-리간드 상호작용을 연구하는 감각 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 싱가포르 국립 연구 재단(Singapore National Research Foundation)의 지원을 받았습니다(J.Y.Y.에 NRF-RF2010-06 보조금).

1. 샘플 준비 <ol><li> (; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1,118w) UAS-GCaMP5G (19) 파리에 GAL4 3,22 드라이버 라인을 교차. 십자가가 25 ° C에서 성장 할 수 있습니다. 참고 : 생성은 형광 신호 강도를 향상하는 데 도움이 할 수있는 GAL4 또는 UAS-GCaMP 유전자의 여러 복사본으로 날아갑니다. Gr68a-GAL4 드라이버의 제어하에 발현 될 때 UAS-GCaMP 트랜스 (UAS-GCaMP3)의 이전 버전들은 매우 약한 형광 강도를 나타내었다. <ol><li> 수집 섹스 새로 eclosed 성인 파리로 구분하고 25 ° C에서 올립니다. 참고 : GCaMP5G의 개화의 기준 레벨이 14~28일 세 사이 파리에 최적입니다. 섹스에 의해 파리를 분리하면 신경 반응에 영향을 미칠 수있는 사회적 상호 작용의 가능성을 배제. </li></ol></li><li> CO 2의 온화한 기류 하에서 비행을 마취. </li><li> f를를 부착LY 먼저 0.17 mm의 커버 슬립의 중심 매니큐어의 작은 방울을 배치하여 유리 커버 슬립에 관한 것이다. 부드럽게 명확한 매니큐어의 드롭 옆에 비행을 배치하고 전체 드롭이 즉시 적용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 8 배의 배율로 사용되는 해부 실체 현미경 아래 단계 1.5 및 1.6를 수행합니다. </li><li> 파리의 앞다리를 확장 젖은 붓을 사용합니다. 첫 번째와 다섯 번째 눈꺼풀 세그먼트 (그림 2A)를 통해 테이프의 두 개의 얇은 스트립을 배치하여 위치에 앞다리를 고정합니다. 이 영상 (그림 2B)에 대한 눈꺼풀 부분을 T2-T4를 노출합니다. </li><li> 프로보 시스에 이미지 뉴런 위해, labellum (그림 2C, D)를 노출하는 코의 연단을 통해 테이프의 얇은 스트립을 배치합니다. </li><li> 커버 슬립 표면 위로 흐르는에서 솔루션을 방지하기 위해 PAP 펜으로 비행 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 설치 후 30 분 이내에 측정을합니다. </li></ol> 자극 2. 준비해결책 <ol><li> 친 유성 리간드를 희석 PBST 용액 (예 : 본 연구에서 사용 CH503 등) : 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 0.1 % 트리톤 X-100 (V / V ); pH가 7.4. <ol><li> PBST를 사용하여 리간드를 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 만든다. PBST를 사용하여 모액의 모든 연속 희석액을 준비한다. 주 : 관심있는 리간드의 용해도에 따라 다양한 용매는 리간드를 용해 필요할 수있다. 다양한 용매 CH503의 용해도는하기 표 1에 기재되어있다. 다른 용매는 달리 PBST 형광의 증가를 생성하지 않았다. </li></ol></li></ol> 미각 신경 및 이미지 획득 3. 자극 <ol><li> 10 μL의 피펫을 사용하여 눈꺼풀 세그먼트에 PBST 10 μl를 배치합니다. 참고 :이 단계는 다리를 습하게하고 표류에서 눈꺼풀 세그먼트를 방지 할 수 있습니다. </li><li> SU의 카메라를 지닌 광학 시스템을 사용fficient 속도와 감도가 높은 시간 해상도에서 좋은 형광 신호를 달성했다. 참고 :이 연구에서 우리는 회전 디스크 공 초점 현미경과 sCMOS 카메라 (자료 목록 참조)를 사용했다. </li><li> 특정 눈꺼풀 세그먼트와 신경 세포를 선택하는 이미징합니다. 세 가지 사전 자극 공 촛점 Z - 스택을 획득. <ol><li> 이상적으로, 사용 취득 설정이 여전히 셀 전체 볼륨을 캡처하는 동안 최대 시간 해상도를 허용하기에 충분히 빠르다. 예를 획득 설정은 다음과 같습니다 매 2 초를 캡처 × 2 2, 6 × 0.5 μm의 2 광학 부분을, 비닝 200 밀리 초 노출. 주 : 고정화 다리는 GCaMP 신호를 식별 할 수있는 표백으로 30 초 간격으로 최대 10 분 동안 성공적으로 묘화하고있다. 긴 녹화 시간의 경우, 다리가 커버 슬립의 위치에 아주 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 높은 신호대 전체 IMA 동안 최소 광표백로 달성을위한 레이저 출력을 최적화정권 카. 여기에 설명 된 실험을 위해, 영상 30 %의 전송에 다리와 코에 Gr68a 및 ppk23의 미각 신경 세포를 모두 491 nm의 다이오드 레이저 (100 mW의)를 사용합니다. 여전히 충분한 공간 해상도를 달성하면서 짧은 노출 시간을 허용하는 2 × 2 비닝 (binning)을 사용합니다. 주 : 레이저 출력 설정은 1.2 내지 4.5 배 증가의 범위에서 형광 변화의 검출을 허용하도록 최적화되었다. </li></ol></li><li> 피펫 눈꺼풀 세그먼트 상에 자극 용액 10 μL. 제어 실험을 위해, PBST의 또 다른 10 μl를 추가합니다. 즉시 117 이후 자극 이미지를 수집. 참고 취득한 후 자극 매수의 형광의 최대 변화에 도달 한 시간의 양 (약 2 분)에 기초한다. <ol><li> 중요한 단계 :이 앞다리 위치에서 이동하게하기 때문에 준비에 솔루션을 피펫 팅하는 동안, 피펫 팁으로 비행을 터치하지 않습니다. 참고 : 또는 사용정확하게 눈꺼풀 부분에 자극 가까이를 포함하는 유리 모세관을 배치하는 미세 조작기는 이미지화된다. 제조자의 지시에 따라 세포 마이크로 인젝션 디스펜서를 이용하여 자극의 볼륨 조절을 제공한다. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 처리 및 분석 : 응답의 정량화 <ol><li> 피지 (사용 공 촛점 Z - 스택의 일련의 열기 <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 또는 ImageJ에 ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) (24) 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를. </li><li> 120의 시점마다 여섯 Z 슬라이스의 합계 강도 투영을 만든다. <ol><li> &quot;이미지&quot;에서 &quot;스택&quot;옵션을 선택합니다. 또한, &quot;Z 투사&quot;옵션을 선택하고 정지 슬라이스로 시작 슬라이스 및 &quot;4&quot;로 &quot;1&quot;을 입력합니다. 프로젝션 타입의 경우, R을 선택20; 합 조각 모든 시간 프레임을 &quot;풀다운 메뉴에서, 그리고 선택&quot; &quot;. </li></ol></li><li> 셀 몸이나 신경 돌기 주위에 경계를 그립니다 자유 선택 도구를 사용하여 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 은 &quot;분석&quot;레이블을 클릭하고 &quot;도구&quot;에서 &quot;투자 수익 (ROI) 관리자&quot;옵션을 선택합니다. </li><li> 은 &quot;분석&quot;메뉴 아래의 &quot;설정 측정&quot;옵션을 선택하고 통합 밀도, 지역의 상자를 선택하여 투자 수익 (ROI)의 형광을 정량화 평균과 최대 회색 값과 레이블입니다. 그 후, 투자 수익 (ROI) 관리자 메뉴에서 &quot;추가&quot;옵션을 선택하고, 또한 &quot;멀티 측정&quot;옵션을 선택합니다. 참고 :이 선택한 각 매개 변수에 대한 값을 팝업 상자를 생성합니다. </li><li> 화소의 중에 포화 도달 했으므로되도록하여 최대 계조 값을 확인 (예를 들어, 16 비트의 카메라 65535). 참고 : 실험을 위해 t에 표시그의 종이, 응답은 ΔF / F의 최대 증가가 관찰되었다 위치에 따라 세포 기관 또는 신경 돌기에서 어느 측정 하였다. </li><li> 다음과 같은 시점 t에서 형광 (ΔF / F)의 최대 상대적인 변화를 계산이다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> 각 F (셀) 값에서 빼기 배경 형광. 배경 형광을 정량화하기 위해, 감지 뉴런없는 앞다리 (또는 코)의 영역에서 동등한 크기와 모양의 ROI의 통합 밀도를 측정한다. </li><li> 포스트 자극 형광 F (셀) t 정량화 자극 후의 시각 &quot;t&quot;에서 전지 본체 또는 프로세스의 ROI의 집적 밀도를 측정한다. </li><li> 예비 자극 형광을 정량하기 위해, F (셀) t = 0, 동일한 방법으로 상기 전지 본체 또는 프로세스의 사전 자극 이미지를 분석포스트 자극 신호. F (셀) t = 0을 결정하기 위해 3 이미지의 평균 집적 밀도를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리는 여기에 2 개의 다른 감각 기관에 초파리 주변 신경 세포의 라이브 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 칼슘 2 +는 CH503은 용량 의존적 양적했다 페로몬 리간드에 의해 유도 Gr68a - 뉴런에서 GCaMP 형광 반응을 -evoked. 이 같은 phasic와 토닉 응답 등의 다른 신경 응답 패턴을 식별하는 것이 가능했다. phasic 반응을 나타내는 신경 연속 자극에 빠른 적응을 할 수 있도록 믿어진다. 이러한 형태의 응답이 냄새 검출 (25) 및 리듬 운동 활동 패턴 (26)의 생성과 관련되어있다. 대조적으로, 다양한 감각 기관에 기술 된 신경 진동은 단일 시냅스 사이트에 다수의 입력을 동기화하고, 자극 (27)에 대해 고유의 기능을 전달하는 것으로 생각된다. ppk23 뉴런과 관련된 진동의 분자 적 기초는 아직 우리 KN에보고되지 않은owledge. 진동 응답을...

동물들은 생존과 재생에 필수적인 의사 결정을 중재하는 후각과 미각 정보에 의존합니다. 감지 신경계에 의해 처리하는 방법을 화학 감각 단서 이해하는 감각 수용체 (들) 및 해당 화학 리간드의 확인이 필요합니다. 초파리는 휘발성 및 비 휘발성 화합물의 엄청난 다양성을 감지하고 생리를 연구하기에 좋은 모델입니다 메커니즘은 chemosensation을 기본. 후각 기관은 휘발성 분자를 감​​지하는 동안, 미각 기관은 낮은 휘발성 화합물을 검출하는 전문으로하고 있습니다. 여기서는 직접 저 휘발성 친 리간드 초파리 melanogaster의 맛 기관에서 신경 반응을 측정하는 방법을 제시한다. 파리의 미각 기관은 앞다리, 코, 날개 등이 있습니다. S 응답 sensilla 알려진 모발 형 구조는 미각 기관의 표면에 분포ugars, 쓴 맛, 소금, 물, 페로몬 8. sensilla 맛 강모으로 형태 학적으로 분류 된 맛은 9 쐐기. 긴 (L 형)으로 분류 된 labellum에 약 31 맛 강모, 짧은 (S 형) 및 중간 (i 형) 모폴로지가 있습니다. 설탕에 생리 학적 반응하는 &#39;L&#39;과 &#39;의&#39;sensilla 집 4 감각 뉴런 (S 셀), 저염합니다 (L1 세포), 높은 소금과 쓴맛 화합물 (2 계층 셀) 및 물 (승 전지) (10) 11. 다른 응답 동안 높은 소금 (12)에 낮은 소금과 설탕에 모두 응답 하나의 &#39;난&#39;sensilla 집이 감각 뉴런,. 남성의 약 41 맛 sensilla와 앞다리에 각각 분산 여성 26 sensilla이 있습니다. 둘 다 남성과 여성의 경우, midleg 21 sensilla 및 뒷다리 (13)에 대해 22 sensilla있다. 다리에 맛 sensilla로 둘러싸인 미각 신경 세포도 다 있습니다L1, L2, W 및 S 타입으로 lassified. 단일 뉴런에서 전기적 활성도를 측정하기위한 하나의 표준 방법은 이온 흐름을 기록하는 세포 또는 세포의 전극을 사용한다. 전극 측정은 신경 기능은 초파리 종, 나방, 신경 라벨링에 대한 광범위한 유전 적 도구가 부족 꿀벌로 비 모델 생물에서 공부 할 수 있습니다. 전기 생리 학적 방법을 일상적으로이 방법을 적용 4,13,14 sensilla 초파리 맛의 활동을 측정하는 데 사용되었지만 그러나, 여러 기술적 과제를 제시한다. 먼저, 칫솔모가 형태학 및 공간적 위치에 기초하여 식별되어야 맛. 식별되면, 전기 생리 학적 측정은 sensilla의 작은 크기에 의해 방해 될 수 의한 위치로 액세스 가능성을 제한 및 맛 화학적 자극 제어 된 양을 적용하는데 어려움이 모. 또한 sensilla의 자극은 하나 이상의 신호를 생성 할 수있다신경 세포 유형 15. 둘째, 전기 신호의 검출은 전자 기기로부터의 기계적인 진동과 노이즈로 인한 배경 잡음에 의해 혼동 될 수있다. 잘못 사용되는 경우 14 번째, 날카롭게 전극의 사용은 플라이 제조를 손상 할 수있다. 마지막으로, 전기 생리학 장비를 조립하는 자극 전달, 신호 기록 및 데이터 분석을위한 특수한 전자 부품을 필요로하고 비용이 많이들 수있다. D.에서 melanogaster의 유전자 인코딩 툴의 가용성은 뉴런의 작은 집단의 반응을 조사 할 수 있도록 영상 기술의 발달을 촉진 하였다. 하나의 이러한 접근은 CaLexA 기자 (16)의 사용이다. 이 방법에서는 LEXA-VP16 전사 인자 및 칼슘 민감성 NFAT 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 융합된다. 단백질 포스파타제 칼시 뉴린의 칼슘 활성화 차례, facilita에서 NFAT의 탈 인산화를 촉진하고핵으로의 수입을 TES. 핵 내부에서 LEXA 도메인 따라서 기능적으로 활성화 된 뉴런의 지속적인 식별을 허용, 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자의 발현을 지시하는 LexAop-DNA 결합 모티프에 결합한다. 이 접근법은 취기 (16)에 라이브 파리 노광 다음 더듬이 로브 특정 후각 사구체의 응답을 측정하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 최근 IR52c 미각 수용체 신경의 생리적 반응은 CaLexA 7을 사용하여 실시간 파리에서 측정 하였다. 최대 6 주 GFP의 전사를 향상시키기위한 그러나,이 연구를 위해,이 나이에 파리에 필요했다. 항 GFP 항체로 면역 염색하면 CaLexA 신호를 강화하는데 사용될 수 있지만,이 방법에 따라서, 라이브 세포 이미징을위한 가능성을 배제 조직의 고정을 필요로한다. 유 전적으로 인코딩 된 칼슘 표시기 단백질 GCaMP는 광범위의 숫자에 신경 반응을 연구하는 데 사용되었습니다종 17. 단백질 GCaMP은 신경 자극하기 전에 낮은 강도와​​ 형광. 자극의 적용은 칼슘의 유입의 결과로 신경 세포의 활동 전위를 트리거합니다. 칼슘 결합 GCaMP, 그것은 밝게 강도 (그림 1)과 형광 원인, 구조적 변화를 겪는다. 최근에 개발 된 단일 뉴런 칼슘 촬상 방법은 앞다리 특정 Gr61a의 미각 신경 (18)에 대한 리간드로서 포도당을 식별하는 데 사용 하였다. 본 연구에서는 Gr61a의 미각 뉴런 GCaMP 발현 형질 전환 초파리 해부 앞다리는 촬상 전에 아가의 층으로 덮었다. 그러나, 해부 조직의 사용에 따라서 측정 시간 및 검출 감도를 제한 GCaMP 발현의 최종 런을 일으킬 수있다. 또한, 아가로 인해 높은 형광 배경 레벨 및 광 산란 특성에 감도를 제한 할 수 있습니다. 티ㅇ 이러한 단점들을 해결, 우리는 앞다리와 코 그대로​​ 동​​물의 미각 신경 세포의 생리적 반응을 기록하는 GCaMP 매개 칼슘 이미징의 사용을 설명합니다. 우리는 초파리 지질 페로몬 유 전적으로 인코딩 GCaMP5G 19 발현 생리 Gr68a의 반응과 ppk23 뉴런 (3 R, (11) Z 19 Z) -3- 아세 톡시 11,19-octacosadien -1- 올 (CH503) 20 표시 21. 신경 반응은 페로몬 자극 동안 GCaMP5G 형광 신호의 증가를 정량함으로써 측정된다. 이 프로토콜에서, 신경 세포에서 신경 개별 활성화 패턴을 구별하기에 충분한 120 초 총 지속 기간 동안 영상화된다.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-gal4</td><td></td><td></td><td>H. Amrein(텍사스 A&)의 선물 M Health Science Center, TX, USA)와 J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)의 선물</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>블루밍턴 초파리&nbsp; 주식 센터</td></tr><tr><td>0.17 mm 커버슬립 (Gold-Seal 커버슬립)</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>네일 폴리시, "Hard as Nails Clear"&nbsp;</td><td>샐리 한센</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>Z377821</tr><tr><td>페인트 브러시</td><td></td><td></td> 세<td>밀한 브러시</td></tr><tr><td>테이프&nbsp;</td><td>스카치 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 실험실 등급</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC 등급</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>472301</tr> 프로토콜 섹션 <tr><td>CH503</td><td></td><td></td><td>Synthesis에 설명된 PBST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>레시피</td></tr> Mori et al., 2010 <tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>현미경 (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 스캔 헤드&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

포유 동물과는 달리, 이러한 초파리와 같은 곤충은 여러 맛 기관이있다. 다리, 코, 날개 초파리의 산란관의 화학 감각 뉴런 미각 수용체 1,2, 이온 채널 3-6, 휘발성 및 비 휘발성 감각 큐의 검출에 참여하는 이온 성 수용체 (7)를 표현한다. 이 신경 세포는 직접 식품, 유해 물질 및 페로몬 등 tastants 문의 따라서 이러한 공급, 달걀 누워와 결합 많은 복잡한 행동에 영향을 미친다. 전극 기록 칼슘 촬상 널리 이러한 tastants 의해 유발 된 신경 세포 반응을 정량화하는 곤충에 사용되어왔다. 그러나, 전기 생리학은 세포 유형, 크기 및 위치에 따라 기술적으로 어려울 수있는 하나의 맛 sensillum 특화된 장비 및 구하는 측정을 필요로한다. 또한, 초파리에서 단일 신경 세포 해상도는 맛 sensilla 허우 때문에 달성하기가 어려울 수 있습니다화학 감각 신경 세포의 자체 이상의 유형입니다. 여기에 설명 된 실시간 칼슘 이미징 법 라이브 파리 단일 미각 뉴런의 반응을 측정 할 수있다. 이 방법은 수성 용매에 대한 낮은 용해도를 지질 페로몬 및 기타 리간드 유형의 연결 반응을 영상화에 특히 적합하다.

GCaMP 칼슘 표시기는 유 전적으로 Gr68a-GAL4 또는 ppk23-GAL4 드라이버를 사용하여 표현 하였다. 앞다리 신경 세포와 비 신경 지원 세포의 고유 한 인구는 각 드라이버 (그림 3A-C)에 의해 표시된다. 친 유성 페로몬 CH503 리간드에 특이 적 반응 Gr68a-GAL4 관찰하고 ppk23-GAL4 세포 GCaMP (도 3D)을 표현. 상대적인 GCaMP5G 신호 (ΔF / F)의 형광 강도의 변화는 CH503 (그림 3E)의 높은 농도로 증가했다. 흥미롭게 CH503의 5 NG 도즈는 신경 반응을 억제 할 수있다. Gr68a 및 ppk23 뉴런 다른 응답 패턴을 나타냈다. ppk23 신경 세포는 phasic, 진동 응답 (그림 3G)를 보여 반면 Gr68a...

초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 지질 페로몬에 대한 초파리(Drosophila) 미각 뉴런의 생리학적 반응을 측정하는 것입니다. 이 기술은 고아 미각 수용체(orphan gustatory receptors)의 리간드를 식별하는 것과 같은 감각 신경생물학의 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 손상되지 않은 살아있는 동물 상태에서 개별 미각 뉴런의 반응을 연구할 수 있다는 점입니다.초파리를 마취시킨 후, 아주 적은 양의 투명 매니큐어를 사용하여 0.17 millimeter 커버 슬립에 고정합니다. 매니큐어 방울 전체를 사용하여 초파리의 옆면을 슬라이드에 부착하십시오. 다음으로, 해부 현미경 하에서 젖은 붓을 사용하여 초파리의 앞다리를 폅니다.그런 다음 매우 얇은 테이프 두 조각을 사용하여 첫 번째와 다섯 번째 타르수스(tarsal) 마디를 커버슬립에 고정합니다. 구강의 뉴런을 이미징하려는 경우, 라벨룸(labellum)이 노출되도록 구강의 로스트럼(rostrum) 위에 얇은 테이프 한 조각을 더 붙입니다. 이제 PAP 펜을 사용하여 파리 주변에 짧은 벽을 만듭니다.측정을 시작하기 전, 마취 기운이 사라지도록 30분 동안 기다립니다. 본 프로토콜을 위해 PBST를 사용하여 1 mg/mL 농도의 리간드 스톡 용액을 필요한 농도로 희석하여 준비합니다. 절차를 시작하려면, 고정되어 노출된 족근골 마디 위에 PBST 10 µL를 도포합니다.이렇게 하면 다리가 촉촉하게 유지되어 초점에서 벗어나는 것을 방지할 수 있습니다. 다음으로, sCMOS 카메라가 장착된 spinning disk confocal microscope와 같이 빠른 시간 분해능으로 우수한 형광 신호를 얻을 수 있는 광학 시스템을 사용하여 마디에 초점을 맞춥니다. tarsal segment에 있는 대상 뉴런의 자극 전 Z-stack 영상을 3회 수집합니다.본 예시에서는 2초마다 6 $\mu\text{m}$ $\times$ 0.5 $\mu\text{m}$ 영역에 대해 200 밀리초의 노출 시간과 2$\times$2 비닝을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 높은 신호 대 잡음비를 유지하면서 광퇴색을 최소화할 수 있도록 레이저 출력을 최적화하십시오. 여기서는 491 $\text{nm}$, 100 $\text{mW}$ 레이저를 30% 투과율로 작동시킵니다.신호는 자극 전에도 검출 가능해야 하지만, 포화 상태에 도달해서는 안 됩니다. 이제 관심 있는 부절(tarsal segment) 부위에 자극 용액 10 µL를 피펫으로 분주합니다. 분주할 때 다리나 파리의 신체 부위에 닿지 않도록 매우 주의하십시오. 그렇지 않으면 부절의 위치가 벗어날 수 있습니다.그다음, 즉시 자극 후 첫 번째 이미지를 획득하고 형광의 최대 변화를 기록할 수 있을 만큼 충분한 이미지를 계속 수집하십시오. 분석을 위해 Fiji 또는 ImageJ 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를 사용하여 일련의 공초점 Z-스택(Z-stacks)을 엽니다. 각 시점별로 모든 Z-슬라이스에 대해 합계 강도 투영(sum intensity projection)을 수행하십시오.여기에는 6개의 슬라이스와 120개의 타임 포인트가 있습니다. 먼저, image 항목에서 stack 옵션을 선택한 다음 Z-projection 옵션을 선택하십시오. 시작 슬라이스(start slice)에는 1을, 종료 슬라이스(stop slice)에는 4를 입력하십시오.투영 유형(projection type)의 경우, sum slices를 입력하고 모든 시간 프레임을 선택하십시오. 이제 세포체나 신경 돌출부와 같은 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 자유형 선택 도구를 사용하여 구조물의 경계를 따라 그리십시오.그런 다음, analyze 레이블을 클릭하고 tools 항목에서 ROI manager 옵션을 선택하십시오. 먼저 analyze 메뉴에서 set measurements 옵션을 선택하여 ROI의 형광을 정량화하십시오. integrated density, area, mean, maximum grey value 및 label 확인란을 선택하십시오.다음으로, ROI manager 메뉴에서 more 옵션을 선택하고 multi-measure 옵션을 선택하십시오. 이제 시점 t에서의 최대 형광 변화량을 계산합니다. 자극 후 형광을 정량화하기 위해 ROI의 integrated density를 측정하십시오.t = 0일 때, 동일한 방식으로 ROI의 자극 전 이미지에서 자극 전 형광을 측정합니다. 3개 이미지의 값을 평균하여 t = 0 값을 산출합니다. 배경 형광을 정량화하려면, ROI와 크기 및 모양이 동일하면서 검출 가능한 뉴런이 없는 조직 영역에서 통합 밀도를 측정합니다.각 시간대별로 고유한 배경값을 수집하십시오. GCamP 칼슘 지표는 두 가지 서로 다른 Gal4 발현 패턴을 사용하여 발현되었습니다. 각 패턴은 앞다리 뉴런과 비뉴런성 지지 세포의 서로 다른 집단을 표지합니다.두 발현 패턴 모두에서 친유성 페로몬인 CH503에 대한 리간드 특이적 반응이 관찰되었습니다. GCamP 신호의 형광 강도 상대 변화는 CH503의 농도가 높아질수록 증가했습니다. 흥미롭게도, 5 ng 용량의 CH503은 신경세포 반응을 억제할 수 있습니다.Gr68a와 ppk23 뉴런의 측정된 반응은 서로 달랐습니다. Gr68a Gal4 드라이버로 표지된 뉴런의 반응은 토닉(tonic) 패턴을 보인 반면, ppk23 뉴런은 다리에서 페이직(phasic) 및 진동성 반응을 보였습니다. 구강수염(proboscis)에서 ppk23 뉴런은 세포체로부터 지연 발생 토닉 반응을 보였으며, 축삭 돌기에서는 진동성 반응을 보였습니다.이 영상을 시청하고 나면, 지질 페로몬 및 기타 소수성 리간드에 대한 개별 미각 뉴런의 생리학적 반응을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 화학감각 생물학 분야의 연구자들이 Drosophila melanogaster의 개별 미각 뉴런 반응을 측정할 수 있는 길을 열어줍니다. 또한, 스피닝 디스크 현미경을 온도 조절식 온스테이지 인큐베이터와 결합함으로써, 온도 조절형 shibire 또는 TRiP a-one 트랜스진을 사용하여 뉴런 활동을 억제하거나 활성화할 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 초파리가 마취에서 회복되는 시간을 제외하고 5분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법을 수행할 때는 초파리의 앞다리가 손상되지 않도록 커버 슬립 위에 단단히 고정하는 것이 중요합니다. 이미징 시에는 페로몬 용액으로 앞다리를 자극하는 즉시 이미지를 획득하는 것이 중요합니다.

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 비디오는 리간드 결합 및 형광 이미징을 사용하여 초파리에서 감각 뉴런 반응을 감지하는 방법을 보여줍니다. 리간드는 뉴런 수용체에 결합하여 칼슘 유입을 일으킵니다. 칼슘은 지표 복합체에 결합하여 형광 방출을 유발하여 리간드에 대한 신경 반응을 확인합니다.

Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

칼슘 이미징 접근법은 용액이 라벨에 적용되는 동안 깨어 있는 파리의 뇌에서 미각 유도 반응을 기록할 수 있습니다. Drosophila melanogaster 의 1차 미각 반응이 예로 사용되지만 이 프로토콜은 다운스트림 뉴런 또는 다른 종을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

학습하세요 Drosophila 미각 감각 뉴런의 생리적 반응을 지질 페로몬에 대해 라이브 칼슘 이미징 기법으로 측정하는 방법을. 이 기술은 미각 수용체-리간드 상호작용을 연구하는 감각 신경생물학 연구에 활용됩니다.

의 생리적 반응을 측정

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