에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화 초파리 Flywalk 패러다임

이 행동 생물학적 분석의 전반적인 목표는 식초 파리의 냄새 유도 행동을 조사하는 것입니다. Fly Walk는 후각 자극에 대한 여러 파리의 행동 반응을 자동으로 추적하고 분석하는 고처리량 시스템입니다. 이 새로운 기술은 곤충 후각 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 냄새의 쾌락적 균형은 무엇이며, 추가적인 냄새 물질의 추가는 이 균형에 어떤 의미를 갖습니까? 이 실험의 가장 큰 장점은 높은 일시적 해상도로 냄새 유도 행동을 할 수 있으며, 곤충이 자연에서 경험하는 것과 유사한 냄새 자극이나 전기 생리학적 기록에 사용하는 것과 유사한 냄새 자극을 사용한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 사용하려고 하는 개인은 실제로 기밀 시스템이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있으므로 공기가 통과하는 위치를 알아야 하고 공기가 시스템을 떠날 수 있는 곳에 누출이 전혀 없는지 확인해야 합니다 I 이러한 실험을 위해 다음을 포함하는 낮음에서 중간 배양에서 12-12개의 밝은 어두운 주기 아래에서 파리를 사육하는 것이 중요합니다. 정상적인 음식 매체.

실내 온도를 섭씨 23도에서 25도 사이로 유지하고 상대 습도는 준비 시 약 70%가 되어야 합니다. 대형 배양 바이알을 사용하여 일주일 동안 20-30명의 성체를 만들고 30-40명의 혼성 자손 그룹을 모아 실험 코호트를 만들었습니다. 코호트가 생후 2일에서 4일이 되면 촉촉한 폼 마개 또는 촉촉한 티슈 페이퍼가 들어 있는 새 바이알로 옮깁니다.

실험 전 24시간 동안 이 바이알에서 파리를 굶주리게 합니다. 이 이송 중에 파리가 마취되지 않는 것이 중요합니다. 이 설정의 경우 250ml 병이 많은 가습기를 사용할 수 있습니다.

각 병에 증류수 100ml를 채웁니다. 다음으로, 각 냄새 물질의 반 밀리리터 작업 재고를 순수한 냄새와 미네랄 오일을 1000 희석하여 준비합니다. 마찬가지로, 음성 대조군 역할을 하기 위해 미네랄 오일만 포함된 PCR 튜브 1개를 준비합니다.

이제 각 냄새 물질에 대한 냄새 전달 시스템을 준비합니다. 실험에서. 각 냄새 바이알에 두 개의 볼 체크 밸브를 연결합니다.

냄새 바이알을 올바른 흐름 방향으로 연결했는지 확인하십시오. 잘못된 연결은 계획된 실험을 손상시킬 뿐만 아니라 전달 시스템도 오염시킬 수 있습니다. 그런 다음 시스템에 누출이 있는지 확인하십시오.

먼저 혼합 챔버의 배출구를 밀봉합니다. 그런 다음 자극 장치가 0으로 떨어지기 전에 모든 공기 흐름이 있는지 확인합니다. 시스템에 누출이 있는 경우 들어보십시오.

일반적으로 중요한 연결부에서 고무 개스킷을 교환하거나 테프론 튜브를 교환하여 해결할 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계에서는 유리가 깨지는 것이 우려되므로 보호 장비를 착용하십시오. 15개의 개별 테스트 플라이를 개별 유리관으로 조심스럽게 옮깁니다.흡인기를 사용하여 해당 어댑터를 사용하여 양쪽의 유리관을 닫고 매우 단단히 맞아야 합니다.

다음으로, 적재된 유리관을 플라이 워크 설정에 연결합니다. 모든 튜브가 연결되면 실험을 시작하기 전에 파리가 최소 15분 동안 새로운 환경에 적응하도록 합니다. 이제 광원을 켭니다.

유리관 내부의 온도를 높이지 않고 효율적인 추적을 위해 충분한 빛을 제공해야 합니다. 폐쇄 시스템을 만들기 위해 이 시점에서 냄새 바이알을 모두 연결해야 합니다. 습관화 기간은 누출이 없는 폐쇄 시스템에 의존하므로 튜브를 통한 공기 흐름은 테스트 기간 동안과 동일한 속도입니다.

컴퓨터의 공기 흐름을 확인하고 디지털 유량계에 연결하십시오. 시스템에서 나가는 총 공기 흐름은 시스템으로 들어오는 공기 흐름과 같아야 합니다. 그렇지 않은 경우 누출이 있는 것입니다.

누출은 모든 튜브의 공기 흐름에 영향을 미치지만 문제가 있는 튜브는 일반적으로 공기 흐름의 가장 큰 저하를 나타내는 튜브입니다. 새로운 누출이 확인되면 일반적으로 어댑터 내부에서 파손된 유리관으로 인해 발생하거나 이전 실험에서 어댑터 내부의 유리 파편이 원인입니다. 이 과정에서 시스템에서 나오는 공기의 습도를 60%에서 80% 사이로 유지하십시오.파리가 튜브에 적응한 후 실험을 실행할 수 있습니다.

원칙적으로 지금까지 모든 순서의 냄새를 나타낼 수 있습니다. 최상의 결과는 자극을 무작위화하고 최소 90초 간격으로 분리하여 얻을 수 있습니다. 전체로.

각 냄새를 500밀리초 펄스로 40회 표시합니다. 다음으로, 모니터링할 영역을 가로질러 프레임을 드래그하여 관심 영역을 설정합니다. 프레임에 15개의 유리관을 모두 포함하되 튜브 끝의 바깥쪽 5mm는 제외합니다.

다음 단계는 추적 소프트웨어를 끄고 스크립트를 수정하는 것입니다. 그러면 개별 튜브를 분리하는 14개 평행선의 Y축 위치가 변경됩니다. 추적 소프트웨어가 다시 켜지면 두 라인 사이에 하나의 플라이만 있어야 합니다.

다음으로, 유리관 전체에서 파리를 안정적으로 추적할 수 있도록 카메라 매개변수가 설정되어 있는지 확인합니다. 관심 영역의 가장자리에서 파리를 잃은 경우 추적 소프트웨어의 밝기 또는 게인을 높이십시오. 이제 시스템이 완전히 준비되었으므로 자극 프로토콜을 시작합니다.

초당 20프레임의 속도로 파리의 위치를 기록하고 이러한 좌표 위치를 냄새 밸브 상태와 함께 텍스트 파일에 기록합니다. 이 실험은 냄새에 매우 민감하기 때문에 유리관을 청소하고 세제에 담근 다음 흐르는 증류수에 헹구려면 정기적인 청소가 필요합니다. 헹굼 후 가압 공기로 튜브를 건조시킨 다음 섭씨 200도에서 8시간 동안 가열합니다.

먼저 냄새 전달 시스템을 청소하려면 중앙 혼합 챔버에서 모든 냄새 바이알과 튜브를 제거하십시오. 그런 다음 혼합 챔버에서 튜빙 어댑터를 제거합니다. 비워진 혼합 챔버를 튜브와 같은 후드 아래에 솔벤트로 헹궈 청소합니다.

압축 공기를 사용하여 혼합 챔버를 건조시키고 섭씨 200도에서 8시간 동안 가열합니다. 냄새 바이알과 밸브를 청소하려면 강철 플러그를 제거하고 고무 개스킷을 버리고 체크 밸브, 비누 체크 밸브 및 에탄올, 에탄올과 아세톤의 기타 구성 요소를 제거하십시오. 그런 다음 최대 설정에서 30분 동안 불린 구성 요소를 초음파 처리하고 증류수로 헹굽니다.

이전과 마찬가지로 압축 공기를 사용하여 건조하고 구성 요소를 섭씨 200도까지 8시간 동안 가열합니다. 에탄올로 세척 아세톤이 공기 흐름 방향으로 아세톤이 고무 부품을 공격하기 때문에 세척된 각 체크 밸브를 즉시 압축 공기로 건조시켜 세척된 체크 밸브의 잔류 냄새를 모두 제거합니다. 며칠 동안 공기를 통해 펄스를 치고 섭씨 60도의 인큐베이터에 1초 간격으로 공기 흐름을 켜고 끄면서 설정합니다.

굶주린 암컷 파리 15마리가 에틸 부티레이트에 노출되었습니다. 노란색 막대는 냄새 펄스를 나타냅니다. 파란색 사각형은 100밀리초 내의 역풍 움직임을 나타냅니다.

이에 따라 빨간색 사각형은 바람이 부는 움직임을 나타냅니다. 같은 파리는 또한 isop pentyl acetate, ethyl acetate 또는 2 개의 3 부탄 d를 사용하여 자극에 대한 반응으로 역풍 움직임을 보였습니다. 에틸 아세테이트에 대한 파리의 반응은 날카로운 시작, 높은 진폭 및 짧은 지속 시간을 가졌습니다.

대조적으로, 2 3 부탄 디온에 대한 반응은 평균 발병이 늦고 진폭이 낮으며 지속 시간이 길었습니다. 궁극적으로 각 냄새 물질의 데이터는 이러한 방식으로 분석된 다음 추가로 분석되어 4가지 냄새 모두가 용매보다 4초 이내에 더 높은 역풍 변위를 이끌어냈다는 것을 보여주었습니다. 또한, 냄새 첨가 바이알을 개봉함으로써 파리가 가능한 모든 혼합물에 동시에 노출되었습니다.

4가지 냄새로 파리를 자극한 후, 4가지 냄새를 혼합하여 자극한 것은 모두 적어도 혼합물에서 가장 매력적인 단일 화합물만큼 매력적이었습니다. 마스터하면 1시간 이내에 이 실험을 실행할 수 있으며, 그 다음에는 8시간 동안 실행할 수 있으며, 이미 30분 후에 첫 번째 결과를 시각화할 수 있습니다. 따라서 이 방법을 사용하면 높은 임시 해상도로 짧은 시간에 많은 파리로부터 데이터를 얻을 수 있습니다.

하지만 조심하세요. 이 실험은 실험 사이에 광범위한 청소가 필요합니다. 당신의 시스템이 여전히 마지막 실험의 개미로 오염되어 있다면, 플라이 워크에서 결과를 잊어버릴 수 있습니다.

물론 유전자 변형 파리를 테스트하여 OD 유도 행동에 대한 개별 또는 공장 신경 회로의 영향을 조사할 수도 있습니다. 이 새로운 기술의 개발 이후, 그것은 우리가 곤충의 뇌에서 이러한 냄새의 코딩을 이해하기 위해 곤충 파벌에 대한 연구를 할 수 있는 길을 열었습니다. 그리고 중요한 것은, 파리 산책에서의 행동과 생리학적 실험에 대해 같은 종류의 자극을 사용한다는 것은 우리가 이 두 가지 다른 실험 패러다임을 실제로 비교할 수 있다는 것을 의미합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 플라이 워크를 설정하는 방법에 대한 좋은 아이디어를 갖게 될 것이며, 자신의 무릎에서 이 실험을 설정하고 곧 곤충 애정에 대한 높은 처리량 실험을 시작할 수 있을 것입니다. 그러나 유리 제품 및 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 실험실 가운을 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 고글과 장갑을 사용하십시오.