Name: 에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화 초파리 Flywalk 패러다임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster에서 냄새 유도 행동을 고해상도로 정량화하는 Flywalk 방법을. 이 기술은 곤충 후각 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 우리의 요구에 대한 추적 소프트웨어를 사용자 정의하는 Electricidade 엠 포 (electricidadeempo.net)에서 기술 지원을 다니엘 베이트와 페드로 Gouveia의 감사합니다. 우리는 또한 촬영 과정에서 지원 톰 Retzke 감사합니다. 본 연구는 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다.

Flywalk의 구성 및 기술 정보 (26)가 다른 장소 (MK로부터 획득 될 수 있으며,이 설정 정보를 설정하는 임의의 문제가있는 경우에) 기술되어있다. 여기에서 우리는 신뢰할 수있는 결과를 얻는 데 도움이 될 것입니다 패러다임의 취급에 대한 자세한 지침에 초점을 맞 춥니 다. 1. 플라이 처리 <ol><li> 12 시간 빛 : 23 ~ 25 ° C와 70 %의 상대 습도에서 어두운 정권 후면 12 시간에서 음식 매체 (27)에 중간 밀도 문화에 저에 날아간 다. 이를 위해, 20 ~ 30, 새롭게 등장 성인 후, 1 주에 대한 큰 식품 유리 병에 재생 성인 파리를 버리고 등장하는 자식을 기다리는 날아 수 있습니다. </li><li> 30-40 새롭게 등장 (나이 &lt;24 시간) 성인 파리를 수집 3-5 일 동안 음식 매체 (27)를 포함하는 새로운 유리 병에서 그들을에 나이. </li><li> 스물 네 시간 행동 실험을 시작하기 전에 : 이동 모든 30 ~ 40 이전에 수집 된 3-5 D 이전 (2.2 참조) 새 VI (으)로 운항하는 항공사Al을 촉촉한 고무 발포체 플러그 또는 흡입기를 사용하여 습윤 티슈를 포함. 참고 : CO 2를 사용하여 파리를 마취시키다하지 마십시오. </li></ol> Flywalk 설치 2. 준비 <ol><li> 가습기 250 ml의 병을 사용합니다. 100 ml의 증류수와 가습기를 입력합니다. </li><li> 냄새 유리 병을 준비합니다. <ol><li> 순수한 냄새 에틸 아세테이트, 에틸 부티레이트, 이소 펜틸 아세테이트 및 용매 광유 2,3- 부탄의 500 μL 10-3 희석액을 준비한다. </li><li> 냄새 유리 병 당 두 개의 볼 체크 밸브를 연결합니다. 밸브는 단방향 공기 흐름 만 허용하는지 확인합니다. 따라서, 공기가 한쪽 바이알을 입력하고, 다른 측에 둘 수있는 방식으로 체크 밸브를 연결한다. </li><li> 200 ㎕의 PCR 반응 튜브의 뚜껑을 제거한다. 별도의 반응 관에 모든 악취 희석 100 μl를 피펫과 별도의 냄새 튜브에 튜브를 배치합니다. 또한 단지 용매 미네랄 오이를 포함하는 하나의 냄새 유리 병을 준비엘. </li><li> 단단히 스테인리스 플러그와 고무 개스킷을 사용하여 폐쇄함으로써 악취 바이알을 밀봉. </li><li> 악취 전달 시스템 (광유를 함유하는 4 함유 냄새 1) 5 냄새 튜브를 연결한다. 오른쪽 흐름 방향을 연결해야합니다. 잘못된 연결은 계획된 실험을 손상하지 않을뿐만 아니라 전달 시스템을 오염시킬 수있다. </li></ol></li><li> 자극 장치의 혼합 챔버의 출구를 밀봉하여 누출을 점검한다. 자극 장치 전에 모든 공기 흐름이 지금 점진적으로 제로로 떨어질 것을 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 지금 시스템을 떠나 공기의 치찰음의 사운드로 식별 할 수 있습니다 누출을 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 대응하는 어댑터를 사용하여 양면에 흡입기와 가까운 유리 튜브를 사용하여 15 개별 유리 튜브에 15 개인 파리를 전송합니다. 참고 : 시스템이 밀폐 성공적인 실험을 위해 봉인해야하기 때문에, 어댑터가 단단히 유리 튜브에 맞게 보장유리 튜브는이 단계에서 중단 될 수 있습니다. 보호 장갑과 고글을 착용하여 부상을 방지하기 위해주의하십시오. </li><li> Flywalk 설정에 유리 튜브를 연결하고, 여기부터, 파리는 새로운 환경에 길들 수 있도록 실험을 시작하기 전에 적어도 15 분 동안 기다립니다. </li><li> 유리 튜브를 부착 후 : 유리 튜브 후 16 기류가 시스템에 유입되는 공기를 추가 할 경우 컴퓨터 1 하류 디지털 유량계의 판독 값을 확인. 습도가 60 %와 80 % 사이 인 경우 또한, 컴퓨터 1에 확인합니다. </li><li> 파리에 제출 냄새 자극의 순서와 타이밍을 제어 설계 자극 프로토콜. 40 회 동시에 기술 데이터, 현재 4 악취 및 단독 제어 (미네랄 오일)과 가능한 모든 원과 냄새의 4 급 혼합물 예를 들어 구하십시오. 90 초 interstimulus 간격으로 500 밀리 초에 펄스 지속 시간을 설정하고 자극 순서를 무작위로. </li><li> 리튬에 스위치GHT 소스 (LED 클러스터, λ = 630). 유리관 내부의 온도를 증가시키지 않고 효율적으로 추적을위한 충분한 빛을 제공해야합니다. </li><li> 모든 15 유리관가 포함되어있는 방법으로 모니터 할 및 튜브의 가장자리의 대략 5mm 제외 영역을 가로 질러 드래그하여 프레임 트래킹 시스템의 관심 영역을 설정한다. </li><li> 개별 유지 해당 스크립트 자신-Y 위치를 변경하여 추적 시스템에서 개별 관 (14) 사이에 병렬로 분리 라인을 설정하여 실험을하는 동안 식별 날아간다. 하나의 플라이는 두 라인 사이의 임의의 집합 추적되기 때문에, 이러한 두 분리 라인 사이 하나 유리관이 항상 존재하는 방식으로 그것들의 위치를​​ 확인. </li><li> 확실하게 유리 튜브를 통해 추적 날아 방식으로 카메라 매개 변수를 설정해야합니다. 초파리는 관심 영역의 가장자리에서 손실되는 경우, 추적 (S)의 휘도를 증가 또는 이득oftware. 추적 시스템의 기계적 진동을 피하십시오. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 소프트웨어를 사용하여 추적 할 수 있습니다. </li><li> 자극 프로토콜을 시작하여 실험을 시작합니다. 기록은 20 FPS (초당 프레임)에서 XY 좌표를 flies&#39; 및 텍스트 파일의 냄새 밸브 상태와 함께 로그인합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 참고 :이 단계는 분석이 그럼에도 불구하고 단계별 방식으로 표시됩니다 의미있는 결과를 얻을하는 것이 중요하기 때문에 데이터 분석의 다음 단계는 알에서 프로그램 사용자가 작성한 루틴을 사용하여 자동화되어 있습니다. 분석을위한 미가공 데이터는 하나의 냄새 자극주기위한 공통 시간축상의 cm에서 냄새 밸브 상태, 펄스 수 실험 15 플라이 X-위치에 동기 정보를 포함 .CSV-파일이다. 데이터 분석을위한 사용자 정의 코드는 요청에 따라 제공 할 수있다. <ol><li> 열기 .CSV 파일, 차에 의해 표시 밸브 개방 시간 점을 찾을 수밸브 상태를 나타내는 열에 NGE. </li><li> 폼의 냄새 위치의 선형 함수를 계산할 F (t)는 S의 * (T)를 = I + t는 자극 사이클 시간이고, S는 풍속 (여기서 20cm / 초) 내가 냄새가 위치 0 (밸브 개방 플러스 지연)에서 튜브 진입 시간 포인트를 사용하여 계산 될 수있는 절편이다. </li><li> 어떤 냄새 시점을 찾아 모든 비행과 0 주이 시간에 지점을 설정하기위한 X-위치가 교차 비행 : 비행 위치가 각 individual&#39;s에 정렬이 방법은 냄새 발생합니다. </li><li> 관심 영역의 맨 가장자리에 앉아 파리를 제외합니다. </li><li> 모든 자극을주기위한 시간 간격 (100 밀리 초) 반복 과정에 의해 상기 X 축 방향의 변위를 분할하여 X-위치로부터 속력을 계산한다. </li><li> 그림 2E와 같이 모든 비행과 냄새과 특정 냄새에 대한 사람들의 평균 시간 코스에서 평균 속도 시간 코스를 계산 속도 시간 과정을 구하십시오. </li><li> 그림 3C와 같이 순 변위를 얻기 위해 모든 추적 이벤트에 대한 냄새 펄스, 그 후 파리와 냄새 당 평균 순 변위 후 4 초 이내에 순 변위를 계산합니다. </li></ol> 4. 청소 절차 <ol><li> 깨끗한 유리 튜브 <ol><li> 유리 튜브에서 파리와 어댑터를 제거하고 세제를 유리 튜브를 흡수. </li><li> 실행 증류수에서 유리 튜브를 씻어 압축 공기를 사용하여 건조. </li><li> 8 시간 동안 200 ℃에서 가열 유리관. </li></ol></li><li> 청소 냄새 전달 시스템 <ol><li> 중앙 혼합 실에서 모든 냄새 튜브 및 튜브를 제거합니다. </li><li> 혼합 챔버에서 튜브 어댑터를 제거합니다. </li><li> 실험실 세정 용액과 용매 (예 : 에탄올, 아세톤)로 세정하여 클린 혼합 챔버. 실험실 후드에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 건식 혼합 챔버 8 시간 동안 200 ° C에 그것을 가압 공기를 이용하여 가열한다. </li></ol></li><li> 청소 냄새 유리 병과 체크 밸브 <ol><li> 스틸 플러그 (폐기 고무 가스켓)를 제거하고 냄새 유리 병에서 밸브를 확인하고 실험실 청소 솔루션의 모든 구성 요소를 흡수. </li><li> 초음파 목욕 초음파 처리 구성 요소와 증류수를 씻어. </li><li> 에탄올, 아세톤 체크 밸브를 제외한 모든 구성 요소를 청소합니다. 실험실 후드에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 및 압축 된 공기를 이용하여 건조 성분은 8 시간 동안 200 ℃에서 이들을 가열한다. </li><li> 에탄올과 주사기를 사용하여 아세톤으로 세척하여이를 내부 청결 체크 밸브 (흐름 방향을 고려). 실험실 고글을 착용 실험실 후드 아래 다음 단계를 수행합니다. 아세톤은 압축 공기를 세척 즉시 고무 부품, 건조 체크 밸브를 공격하기 때문에. </li><li> 며칠 동안 체크 밸브를 통해 공기를 펄스에 의해 잔여 냄새를 제거합니다. 이 세척 단계에 정권 온 / 오프 1 초 공기에 60 ° C에서 인큐베이터와 1 초 공기를 사용합니다. </li></ol&gt; </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Flywalk 시스템이 언뜻보기에 다소 복잡한 것처럼 보이지만, 한 번 설정하고 그것을 실행하는 사용하기 쉽고 매우 강력한 결과를 얻을 수 있습니다. 생물 분석으로 산출 된 결과의 일관성을 강조하는 것이 여기에 도시 된 대표적인 결과는 약 2 년 새 추적 소프트웨어와 광원을 사용하여 변형 된 설치와 이전 연구 29에 도시 된 결과의 일부 후의 있다고 말할 수있다. 그럼에도 불구하고, 유인 응답은 - 이전에 자신의 역학에 관한 출판과 매우 유사 - 약간 높은 응답 진폭에도 불구하고. Flywalk를 이용하여 높은 품질의 결과를 얻기 위해서는, 특히 고려해야 할 중요한 몇 가지 측면이있다. 중요한 것은, 습도는 실험 과정에서 60 % 이하로 떨어지면 안된다. 전형적인 실험 세션은 약 8 시간 동안 지속됩니다. 합리적인 크기의 여성 CS 야생형 파리는 전 전 24 시간 절식쉽게 실험 장치 제공 습도에서 최소 12 시간 동안 생존 periment 충분히 높다. 그...

어떤 neuroethological 연구의 목표는 하나의 지배적 인 신경 또는 신경 회로의 활동 상태 및 유기체의 거동과 인과 관계를 확립하는 것이다. 이 목표의 연결 작업을 달성하기 위해 행동 동일한 자극 조건에서 모니터링해야하고 이러한 자극 조건이 이상적으로 사람들의 이해 진화 조사에서 신경계 비슷해야합니다. 이 행동 생물 검정에 관해서 특히 때, 이러한 요구 사항이 역사적으로 초파리에 매우 까다로운 입증은 후각 neuroethology을 melanogaster의. 소스에서 해제되면, 냄새 깃털이 빠르게 공기 이동이 냄새 분배 (1)의 주요 결정 요인 인에 의한 난류 확산으로 얇은 필라멘트로 헤어. 그 결과, 악취 소스를 향해 이동 곤충은 청정 공기의 가변 간격으로 산재 냄새 패키지 간헐적 자극을 경험한다. 양자 모두산책과 곤충 비행 - 초파리를 포함하는 - 5 - 냄새 2의 부재에서 크로스 바람 이동 주로 깃털 만남에 맞바람 급증에 의해 탐색이 간헐적 인 자극 정권을 악용 입증되었다. 이러한 트랩 분석 등의 초파리 neuroethology에 사용되는 11, 많은 행동 생물 검정 - 생리 학적 실험에서 자극 절차 반면 주로 곤충 깨끗한 공기 또는 동적 자극 서열 6의 장시간 산재 냄새 중 하나를 제공하는 단일 퍼프하여 자연 환경에서 발생할 수있는 그 모방 15 - 오픈 필드 경기장 또는 T-미로는 냄새 그라데이션 (12)에 의존하고있다. 정의에 의해 악취 구배가 냄새 공급원으로부터의 거리에 따라 농도 가변되기 때문에, 특별한 문제는 이러한 패러다임을 사용하여 정확한 악취 농도에 기인 할 수 없다. 또한, 기울기냄새 그라데이션 비판적 취제의 물리 화학적 특성에 따라 달라집니다. 잘못된 해석을 초래할 수있다 (20) - 높은 휘발성 화합물의 구배는 휘발성이 낮은 화합물에 의해 생성되므로 역시 어려워 항해 (16)의 유일한 수단으로서 공간에서 농도 차이의 측정에 의존 유기체에 대해 추적하는 것보다 얕은 것 특히 선택의 분석에 후각 환경 설정. 이 공간의 모든 단계에서 서로 다른 혼합 성분의 비율에 이르게하기 때문에 다시 생리학과 행동 사이에 명확한 상관 관계를 배제하기 때문에 냄새 혼합물을 향한 행동을 조사 할 때이 효과 또한 매우 해롭다. 식초 파리는 과일을 발효에 집계하는 경향이 있지만, 그들은 음식 소스와 산란 사이트에 대한 그들의 탐색에 독방 있습니다. 그럼에도 불구하고, 각각의 동물을 테스트하는 것이 아니라 많은 행동 패러다임은 초파리 neuroetholo에 사용GY는 파리의 코호트 냄새 유도 동작을 살펴 매력 제어 위에 자극 냄새를 선택하는 파리의 분획으로서 획득된다. 이 코호트 실험 비행 neuroethology의 이해에 크게 기여하고이를 사용하여 만든 관측의 대부분은 단일 비행 실험에서 확인할 수있다. 그러나, 각 other&#39;s 결정에 영향을 미칠 수있다 (21) 및 극단적 인 경우 악취 평가 인구 밀도 22에 따라 회피하기 위하여 무관심 전환 할 수 날아 관찰되었다. 또한, 실험의 이러한 종류의 결과는 종종 연결 활동과 동작을 상관 할 때 바람직 할 것이다 오히려 그 일 동안 플라이가 무엇을하고 있는지 관찰보다 행동 결정의 시퀀스의 엔드 포인트를 제공한다. 이 다소 낮은 해상도의 코호트 실험은 같은 수 닿는 비행 경기장과 디딜 방아와 같은 고해상도 단일 플라이 방법으로 대조된다당시 행동 반응의 직접적인 관찰 자극 20,23,24를 표시됩니다. 그들은 매우 효율적이고-간 개인 간 시험 변동성이 부분적으로 오랜 기간 동안 인구의 관찰에 평균화되기 때문에 강력한 심지어 상대적으로 결과 낮은 샘플 크기를 제공하기 때문에 그럼에도 불구하고, 코호트 실험은 여전히​​ 인기 있습니다. 곁에 비행과 디딜 방아는 아마 자극 프레 젠 테이션 및 시간 해상도에 관한 황금 표준을 제공하지만, 사용되는 경기장은 하나의 동물을 위해 설계되었으며 따라서 시간이 많이 소요되는 샘플 통계 분석에 필요한 크기를 얻을 수 있도록하고 있습니다. 몇 개의 다른 접근이 최근에 잘 정의 자극 정권과 조합 고해상도 행동 데이터의 효율적인 획득을 허용 개발되었다. 이러한 냄새의 깃털 5의 정확한 3D 모델과 함께 풍동에서 여러 식초 파리의 자율 3D 추적을 포함 </SUP&gt;, 양쪽 (25)와 Flywalk 패러다임 (26)로부터 공기 류와 함께 제공되는 선택 실에서 여러 개별 파리의 추적. Flywalk에서, 15 개인 파리는 작은 유리 튜브에 위치하고 있습니다 지속적으로 붉은 빛이 상황에서 오버 헤드 카메라에 의해 감시. 냄새가 20cm / sec의 연속적인 기류에 첨가하고, 일정 속도로 유리관을 통해 이동된다. 기류는 악취 전달 시스템에 들어가기 전에 증류수 (가습기)를 함유하는 250ml의 병에 통과시켜 가습된다. flies&#39; 위치는 파리 상기 상향 이동할 수 없거나 관심 (ROI)의 사각 영역 냄새 튜브의 길이의 대부분을 감싸는 (그러나 튜브 (각면에 약 5mm의 바깥 쪽 가장자리를 제외) 내에 기록된다 바람이 불어) 냄새 프리젠 테이션 (그림 1A, B)의시기에. 플라이 아이덴티티 추적 시스템 t 의해 일정하게 유지된다그들의-Y 위치 (즉, 그들의 유리관 제한)에 기초하여 실험 hroughout. 악취 자극은 최대 8 번의 악취 및 26,29 (도 1b) 그의 모든 가능한 혼합물의 프리젠 테이션을 가능하게하는 다 성분 자극 장치를 사용하여 달성된다. 실험 과정은 컴퓨터 냄새 전달 시스템을 조절하고 온도 및 습도 정보를 수집하는 (컴퓨터 (1),도 1C)에 의해 제어된다. 이 컴퓨터는 또한 지속적으로 초당 20 프레임 (컴퓨터 2)에서 비행 위치를 추적하는 두 번째 컴퓨터에 데이터 로거를 (촬영을 시작 / 정지) 제어합니다. 냄새 자극을주기 주위에 냄새 밸브 상태 (밸브 개방의 즉, 시간 점), 악취 ID, 온도와 습도를 위치를 비행 냄새에 컴퓨터 2.이 방법으로 정보를 기록하고, 위치는 .CSV-파일로 동기화 및 수출 비행하는 추가 처리 및 사용자가 작성한 분석 루틴을 사용하여 분석 될 수있다. 때문에전체 시스템은 컴퓨터 제어, 아니 인간의 개입은 실험 세션 동안 필요하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Flywalk 설정</td> 요청 시 <td>사용자 정의</td><td></td><td>세부 정보 제공</td></tr><tr><td>자극 장치</td><td>요청 시 사용자 정의</td><td></td><td>세부 정보 사용</td></tr><tr><td>LED 클러스터</td><td>요청 시 사용자 정의</td><td></td><td></td> 세부 정보 사용</tr> HD <tr><td>Pro Webcam C920</td><td>Logitech, Lausanne, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 컴퓨터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flywalk 재장전된 v1.0 소프트웨어</td><td>Electricidade Em P&oacute; (electricidadeempo.net)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labview 11.0 소프트웨어</td><td>National Instruments, 텍사스</td><td></td><td></td>주 오스틴</tr><tr><td>표준 플라이 식품</td><td>사용자 정의</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 플라이 바이알</td><td>Greiner bio-one GmbH, 프리켄하우젠, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 플라이 바이알</td><td>Greiner bio-one GmbH, 프리켄하우젠, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡인기</td><td>사용자 정의</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>냄새</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 &micro; l PCR 반응 튜브</td><td>Biozym Scientific GmbH, 올덴도르프, 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; flywalk</em&gt; 패러다임

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

그들의 자연 환경에서, 이러한 식초와 같은 곤충은 화학적으로 서로 다른 냄새 물질의 거대한 양의 포격 초파리 melanogaster의 비행. 더욱 문제를 복잡하게하기 위해, 곤충 신경계에 의해 검출 된 냄새는 일반적 조성과 농도 비율 변화 단일 화합물 그러나 혼합물은 없습니다. 이는 신경계에 의해 평가되어야 할 다른 후각 자극의 거의 무한한 양 리드. 냄새 자극의 측면 플라이하여 평가를 결정하는 이해하기 위해서는 많은 효율적 취기 및 악취 냄새 혼합물 향해 유도 거동을 조사하는 것이 바람직하다. 직접 연결 활동에 행동의 상관 관계, 동작은 비교 기간과 신경 생리 학적 실험에서와 같이 동일한 자극 조건에서 정량화되어야​​한다. 그러나, 초파리 neuroethology 많은 현재 사용 후각 생물 검정은 특수 목적 오히려있다효율성으로 또는 해결을 향해하게 안정적. Flywalk, 자동화 냄새 전달 및 추적 시스템은, 효율 및 분해능을 절충. 이는 악취 패킷이 자유롭게 걸어 플라이를 자극하고 animal&#39;s에게 동적 행동 반응을 정확하게 결정할 때의 판정을 허용한다.

초파리는 일정 속도로 유리관을 통해 악취 펄스 및 냄새 펄스 이동간에 그들의 유리관 내에 자유롭게 분배 할 수 있기 때문에 파리 자극 시점의 x 방향의 위치에 따라 서로 다른 시간에 악취가 발생. 그 결과, 에틸 아세테이트 매력적인 10-3 희석액 500 밀리 초 펄스에 의해 유발 된 맞바람 궤적의 온셋은 가까이 앉아 파리에 비해 그들의 유리관의 풍하 끝에 파리 약 1 초 지연 20cm / sec로 20cm 유리 튜브 길이 (도 2a)의 풍속에서 등진 끝. 냄새 프리젠 테이션시의 X-위치에 따라 각 개인에 대한 악취 발생의 시간적 차이를 보정하기 에틸 아세테이트 대한 응답 지연이 개인 (그림 2B)에 걸쳐 일관성이 있음을 알 수있다. O에 대한 보정없이 대응하여, 평균 맞바람 궤도DOR 여행은 보정 평균 궤적에 비해 약 0.5 초만큼 지연된다 (도 2C, 냄새 모두의...

자동화 추적 시스템 Flywalk는 초파리에서 냄새 유도 행동 고해상도 정량화를 위해 사용된다.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

본 행동 생물 분석법의 전반적인 목표는 초파리의 후각 유도 행동을 조사하는 것입니다. Fly Walk는 여러 마리의 개별 초파리가 후각 자극에 보이는 행동 반응을 자동으로 추적하고 분석하는 고효율 시스템입니다. 이 새로운 기술은 곤충의 후각 분야에서 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.예를 들어, 어떤 냄새의 쾌락적 균형(hedonic balance)은 무엇인지, 또는 추가적인 취기 성분의 첨가가 이 균형에 어떤 의미를 갖는지와 같은 질문들입니다. 이 실험의 주요 장점은 높은 시간 분해능으로 냄새 유도 행동을 관찰할 수 있다는 점이며, 곤충이 자연에서 경험하거나 우리가 전기생리학적 기록에 사용하는 것과 유사한 냄새 자극을 사용한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 사용하려는 연구자들은 시스템의 완전한 밀폐가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 공기가 어디로 흐르는지 정확히 파악해야 하며, 공기가 시스템 밖으로 샐 수 있는 누출 부위가 전혀 없음을 확인해야 합니다. 이러한 실험을 위해, 파리를 일반 배지가 포함된 저밀도에서 중밀도 배양 상태의 12:12 명암 주기 하에서 사육하는 것이 중요합니다.준비 과정 중 실내 온도는 23~25°C 사이로 유지하고, 상대 습도는 약 70%가 되도록 합니다. 대형 배양병을 사용하여 20~30마리의 성충을 1주일 동안 사육하고, 성별이 섞인 30~40마리의 자손을 수집하여 실험 코호트를 구성합니다. 코호트가 2~4일령이 되면, 습윤 폼 플러그나 젖은 티슈 페이퍼가 들어 있는 새 배양병으로 옮깁니다.테스트 전 24시간 동안 초파리를 이 바이알에서 굶깁니다. 이때 초파리를 마취시키지 않고 옮기는 것이 매우 중요합니다. 이 설정에서 250 milliliter 병은 여러 개의 가습기 역할을 합니다.각 병에 증류수 100 milliliters를 채웁니다. 다음으로, 순수 향료와 미네랄 오일을 1000배 희석하여 각 향료의 0.5 milliliter 작업 농축액(working stocks)을 준비합니다. 마찬가지로, 음성 대조군으로 사용할 미네랄 오일만 들어 있는 PCR 튜브를 하나 준비합니다.이제 각로 향료에 대한 냄새 전달 시스템을 준비합니다. 실험에서 각 냄새 바이알에 두 개의 볼 체크 밸브를 연결하십시오.냄새 바이알을 올바른 흐름 방향으로 연결하십시오. 잘못 연결하면 계획된 실험이 제대로 이루어지지 않을 뿐만 아니라, 전달 시스템이 오염될 수 있습니다. 다음으로, 시스템에 누출이 있는지 확인하십시오.먼저 혼합 챔버의 배출구를 밀봉하십시오. 그런 다음 자극 장치 이전의 모든 공기 흐름이 0으로 떨어지는지 확인하십시오. 시스템에 누출이 있는 경우, 누출음이 들리는지 확인하십시오.이러한 문제는 보통 주요 연결 부위의 고무 가스켓을 교체하거나 테플론 튜브를 교체함으로써 해결할 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계에서는 유리가 깨질 위험이 있으므로 보호 장구를 착용하십시오. 흡입기(aspirator)를 사용하여 15마리의 개별 테스트 초파리를 개별 유리 튜브로 조심스럽게 옮긴 후, 해당 어댑터를 사용하여 유리 튜브의 양쪽을 닫아줍니다. 이때 어댑터가 매우 단단하게 밀착되어야 합니다.다음으로, 시료가 담긴 유리관을 초파리 보행 장치에 연결합니다. 모든 유리관이 연결되면, 실험을 시작하기 전 초파리가 새로운 환경에 최소 15분 동안 적응하도록 둡니다. 이제 광원을 켭니다.유리관 내부의 온도를 높이지 않으면서 효율적인 추적을 위해 충분한 빛을 제공하십시오. 폐쇄 시스템을 구축하기 위해 이 시점에서 모든 냄새 바이알이 연결되어 있어야 합니다. 순화 기간은 누출이 없는 폐쇄 시스템에 의존하므로, 튜브를 통한 공기 흐름이 테스트 기간 동안과 동일한 속도로 유지되어야 합니다.컴퓨터의 공기 흐름을 확인하고 디지털 유량계에 연결하십시오. 시스템에서 배출되는 총 공기 흐름은 시스템으로 들어오는 공기 흐름과 같아야 합니다. 그렇지 않다면 누출이 발생한 것입니다.누출은 모든 튜브의 공기 흐름에 영향을 미치지만, 보통 공기 흐름의 감소 폭이 가장 큰 튜브가 문제가 되는 튜브입니다. 새로운 누출이 확인된 경우, 이는 대개 어댑터 내부에서 유리 튜브가 파손되었거나 이전 실험에서 발생한 유리 파편이 어댑터 내에 남아 있어 발생합니다. 이 과정 동안 시스템에서 배출되는 공기의 습도가 60에서 80% 사이로 유지되는지 확인하십시오. 초파리가 튜브에 적응하고 나면 실험을 진행할 수 있습니다.원칙적으로, 지금까지 설명한 방식으로는 어떠한 냄새 시퀀스라도 제시할 수 있습니다. 자극을 무작위로 배치하고 각 자극 사이에 최소 90초의 간격을 두었을 때 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 총체적으로.각 냄새를 500밀리초 펄스로 40회씩 제시합니다. 다음으로, 모니터링할 영역에 프레임을 드래그하여 관심 영역(ROI)을 설정합니다. 15개의 유리관을 모두 프레임에 포함시키되, 유리관 끝부분의 바깥쪽 5밀리미터는 제외하십시오.다음 단계는 추적 소프트웨어를 끄고 스크립트를 수정하는 것입니다. 이를 통해 개별 튜브를 구분하는 14개 평행선의 Y축 위치를 변경할 수 있습니다. 추적 소프트웨어를 다시 켜면, 임의의 두 선 사이에 오직 한 마리의 초파리만 있어야 합니다.다음으로, 파리가 유리관 전체에서 안정적으로 추적될 수 있도록 카메라 파라미터를 설정하십시오. 관심 영역(region of interest)의 가장자리에서 파리를 놓치는 경우, 추적 소프트웨어의 밝기나 게인(gain)을 높이십시오. 시스템 준비가 모두 완료되었으므로, 자극 프로토콜을 시작하십시오.초당 20프레임의 속도로 파리의 위치를 기록하고, 이러한 좌표 위치를 냄새 밸브 상태와 결합하여 텍스트 파일에 기록하십시오. 본 실험은 냄새에 매우 민감하므로, 유리관을 세척하고 세제에 담근 후 흐르는 증류수로 헹구는 정기적인 세척 과정이 필요합니다. 헹굼 후에는 가압 공기로 튜브를 건조시킨 다음, 200 °C에서 8시간 동안 가열하십시오.냄새 전달 시스템을 세척하려면 먼저 중앙 혼합 챔버에서 모든 냄새 바이알과 튜브를 제거하십시오. 그런 다음 혼합 챔버에서 튜브 어댑터를 제거하십시오. 비워진 혼합 챔버를 튜브와 마찬가지로 후드 아래에서 용매로 헹구어 세척하십시오.가압 공기를 사용하여 혼합 챔버를 건조하고 200 °C에서 8시간 동안 가열하십시오. 냄새 바이알과 밸브를 세척하려면 스틸 플러그를 제거하고 고무 가스켓을 폐기한 후, 체크 밸브를 제거하여 에탄올과 아세톤 모두에 체크 밸브와 기타 구성 요소를 담그십시오. 다음으로, 담가둔 구성 요소들을 최대 설정에서 30분 동안 초음파 세척하고 증류수로 헹구십시오.이전과 동일하게, 건조를 위해 가압 공기를 사용하고 구성 요소를 200 °C에서 8시간 동안 가열하십시오. 에탄올로 세척하십시오. 아세톤은 고무 부품을 부식시키므로 공기 흐름 방향으로 아세톤을 사용할 경우, 세척된 각 체크 밸브를 즉시 가압 공기로 건조하여 잔류 냄새를 모두 제거하십시오. 60 °C 인큐베이터에 넣고 공기 흐름을 1초 간격으로 켰다 끄며 며칠 동안 공기를 펄스 형태로 통과시키십시오.굶주린 암컷 초파리 15마리를 ethyl butyrate에 노출시켰습니다. 노란색 막대는 냄새 펄스를 나타냅니다. 파란색 사각형은 100 millisecond 시간 범위 내의 풍상 이동을 나타냅니다.이에 대응하여 빨간색 사각형은 풍하측 이동을 나타냅니다. 동일한 파리들은 개체군 평균 기준으로 isop pentyl acetate, ethyl acetate 또는 two three butane 자극에 반응하여 풍상측 이동을 보이기도 했습니다. ethyl acetate에 대한 파리의 반응은 급격한 시작과 높은 진폭, 그리고 짧은 지속 시간을 나타냈습니다.이와 대조적으로, 2,3-부탄다이온(2,3-butanedione)에 대한 반응은 평균 시작 시간이 더 늦었고, 진폭은 더 낮았으며, 지속 시간은 더 길었습니다. 최종적으로, 각 방향제로부터 얻은 데이터는 이러한 방식으로 분석되었으며, 네 가지 향료 모두 용매보다 4초 이내에 더 높은 풍상 변위를 유도한다는 것을 보여주기 위해 추가 분석을 수행했습니다. 또한, 방향제 바이알을 열어 초파리들이 가능한 모든 혼합물에 동시에 노출되도록 하였습니다.네 가지 개별 취기로 초파리를 자극한 후, 네 가지 취기의 혼합물을 사용한 자극은 혼합물 내에서 가장 유인력이 강한 단일 화합물만큼 또는 그 이상으로 유인력이 있었습니다. 숙달되면 이 실험을 1시간 내에 수행할 수 있으며, 이후 8시간 동안 실험이 진행되고 30분만 지나면 첫 번째 결과를 시각화할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 높은 시간 분해능으로 단시간에 많은 초파리로부터 데이터를 얻는 것을 가능하게 합니다.하지만 주의하십시오. 이 실험은 실험 간에 철저한 세척이 필요합니다. 이전 실험에서 유입된 개미가 시스템에 여전히 남아 있다면, 파리 보행 실험 결과는 신뢰할 수 없게 됩니다.물론 유전자 변형 초파리를 테스트하여 개별 또는 특정 신경 회로가 냄새 유도 행동에 미치는 영향을 조사할 수도 있습니다. 이 새로운 기술의 개발은 우리가 곤충의 뇌에서 이러한 냄새의 코딩을 이해하기 위해 해당 분야의 연구를 수행할 수 있는 길을 열어주었습니다. 그리고 중요한 점은, 초파리 보행 행동 분석과 생리학적 실험에 동일한 종류의 자극을 사용함으로써 이 두 가지 서로 다른 실험 패러다임을 실제로 비교할 수 있다는 것입니다.이 영상을 시청하신 후에는 플라이 워크(fly walk)를 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 여러분의 실험실에서 이 실험 장치를 구축하여 곤충 감염에 관한 고효율 실험을 곧 시작하실 수 있을 것입니다. 하지만 유리 기구와 화학 물질을 다루는 일은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 실험복을 착용하십시오. 또한 고글과 장갑을 사용하시기 바랍니다.

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