땅콩에서 아플라톡신의 RNAi를 매개 제어 : 방법은 땅콩에 곰팡이 독소 생산 및 형질 전환 유전자 발현을 분석 / 아스 페르 길 루스 Pathosystem

이 작업의 전반적인 목표는 씨앗의 최소 수를 사용하여 유전자 변형 땅콩에서 아스페르길루스의 아플라톡신 합성 유전자의 RNAi 매개 침묵의 효능을 테스트하기 위한 신뢰할 수 있고 정확하며 저렴하고 빠른 방법을 제공하는 것입니다. 일반적으로 수백 그램의 씨앗은 샘플의 아플라톡신을 효과적으로 정량화하는 데 필요합니다. 이 기술의 주요 장점은 ZAP Pex 오거 매체에서 아플라톡신 양성 aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7의 배양을 설정하는 씨앗을 준비하기 10 일 전에 특정 치료를 테스트하기 위해 5 개 미만의 씨앗을 사용한다는 것입니다. 이 문화를 섭씨 25도에서 성장시킵니다.

종자 접종에 사용됩니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 RNAI를 발현하는 형질전환 식물을 준비한 후 종자 수확을 진행합니다. 먼저 낮게 설정된 고압 세척기에서 마모를 사용하여 궉잉어를 제거하거나 손으로 궉잉어를 긁어냅니다.

peri carp가 제거되면 성숙 보드의 꼬투리를 적절한 그룹에 배치하여 meso carp의 색상을 식별합니다. 이제 구멍을 제거하고 노란색과 갈색 씨앗을 별도로 가공하십시오. 실험에 필요한 씨앗의 수를 계산하십시오 최소 3 개의 씨앗 조각, 즉 샘플링되는 땅콩 라인당 3 개의 공동 납 반쪽이 필요합니다.

멸균 비커의 바닥을 씨앗 층으로 덮은 다음 측정된 양의 75% 에탄올로 씨앗을 덮으십시오. 그런 다음 그 볼륨을 두 배로 늘리십시오. 씨앗을 용액에서 30초 동안 배양한 다음 멸균된 증류수로 헹굽니다.

다음으로, F 에탄올과 마찬가지로 2% 차아염소산염의 부피로 씨앗을 처리합니다. 이 배양을 5분 동안 진행하십시오. 그런 다음 5배 용량의 멸균된 증류수에 3번 헹굽니다.

차아염소산염을 제거하려면 이 단계에서 모든 차아염소산염 용액을 씻어내는 것이 중요합니다. 씨앗은 이제 표면 살균 처리되었습니다. 다음으로, 살균된 증류수에 씨앗을 2시간 동안 담가 수분을 공급하고 이에 수분을 공급하여 수분을 공급하고 이에 수분을 공급

이 시점에서 모든 재료는 멸균되어야 합니다. 집게를 사용하여 종자 코트를 제거한 다음 코하인을 분리합니다. 마지막으로 메스로 배아를 제거한다.

배아는 폐기하거나 새로운 식물을 재생하는 데 사용할 수 있습니다. 다음으로 메스로 올레인을 반으로 자르고 접종 준비가 될 때까지 반쪽과 살균된 증류수를 담급니다. 다음으로, 멸균 종이 타월에 반 co leadin의 여분의 물을 닦아내고 씨앗 크기의 디봇이있는 별도의 1.5 % 오거 플레이트에 씨앗 조각을 놓고 자른 면이 위로 향하게 씨앗을 밀어 넣어 co leadin 반쪽을 접종합니다.

10, 마이크로리터 현탁액 당 000 aspergillus 포자의 2개의 마이크로리터를 절단면에 추가하십시오. 서스펜션이 씨앗 반쪽의 측면을 따라 흘러내리지 않도록 하십시오. 마지막으로, 접시를 테스트할 때까지 섭씨 30도의 어두운 인큐베이터에 1-4일 동안 놓습니다.

1일 후, 2일 후, 3-4일 후 시료 채취를 통해 필요에 따라 무작위로 선별된 접종된 반쪽을 부드럽게 제거합니다. 티슈를 사용하여 여분의 포자와 오거를 닦아내고 샘플을 유리 스크류 캡 바이알에 넣습니다. R-T-P-C-R 분석을 위해 접종되지 않은 샘플을 2mL 튜브로 옮깁니다.

액체 질소에 무료 샘플을 넣고 냉동 샘플을 처리할 때까지 냉동실에 보관하십시오. 아플라톡신 분석을 위해 필요한 경우 접종된 하프 코트 리드인을 4밀리리터 유리 나사 캡 바이알에 넣습니다. 샘플은 섭씨 영하 80도에서 수개월 동안 안정적입니다.

씨앗이 실온에 있을 때 4가지 부피의 메탄올을 첨가하고 튜브를 교반 없이 실온의 어둠 속에서 밤새 배양하여 샘플을 추출합니다. 다음날, UPLC를 먼저 수행하고 일치하는 프릿으로 1.5 밀리리터 프로필렌 미니 컬럼을 준비합니다. 그런 다음 산화알루미늄 200mg을 넣으십시오.

그런 다음 다른 프릿을 삽입하십시오. 다음 위치, A-U-P-L-C는 증발을 최소화하기 위해 미니 컬럼 아래 및 접촉하는 샘플러 바이알을 자동으로 생성합니다. 이제 샘플에서 추출한 0.5ml의 메탄올 추출물을 플라스틱이 아닌 일회용 유리 2개에 추가합니다.

그런 다음 0.5ml의 아세토 니트릴을 튜브에 넣고 용액을 피펫과 혼합합니다. 이제 혼합물 0.5ml를 준비된 미니 컬럼에 적용하고 중력만을 사용하여 EIT를 수집합니다. EIT가 신속하게 수집되면 UPLC에서 사용할 수 있도록 수집 바이알에 정화조 캡을 부착합니다.

물, 메탄올 및 아세도나이트 시험의 이동상으로 이미 준비된 A-U-P-L-C에 바이알을 놓습니다. 그런 다음 EIT의 아플라톡신 함량을 정량화합니다. UPLC 분석에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

추출에 사용되는 종자 조각을 개별 유리 바이알에 설정합니다. 그런 다음 밤새 바이알을 동결 건조하고 아침에 조직 샘플의 건조 중량을 측정하여 아플라톡신 농도를 샘플 그램당 나노그램으로 표현할 수 있습니다. 다음 냉장고에서 표본을 제거하고 트리올을 추가하고 3, 40 초 동안 100 분당 회전수에 구슬 선반 균질화기로 언 조직을 갈고 flavis에서 5개의 아플라톡신 종합 유전자의 작은 파편을 나르는 RNAI 벡터를 RNA 적출에 진행하기 위하여 땅콩 식물을 변형시키기 위하여 이용되었습니다.

식별 번호는 99개의 재생된 형질전환체로부터 광범위한 연구소의 게놈 주석 번호에 해당하며, 7개의 PCR 양성 라인을 복제하고 설명된 대로 시험하였다. 7 개 모두 대조 라인에 비해 60-100 % 적은 아플라톡신 축적을 보였습니다. 7개 라인 중 2개의 결과가 표시됩니다.

이 두 개의 RN AI 라인은 NPT 두 개의 선택 가능한 마커의 존재를 보여주었습니다. S-T-N-P-C-R 결과에 따르면, 사용 된 음성 대조군은 아플라톡신 양성의 아플라톡신 갓 수확 된 케디아에 저항하는 능력에 대한 RNAi 라인을 테스트하기 위해 변환 과정을 거친 PCR 음성 라인이었다. 플라비스 라인 NRRL 3 3 5 7 을 최대 96시간 동안 배양 후 배아 및 고환이 없는 반요람 리드인에 적용했습니다.

접종된 조직은 설명된 바와 같이 이들의 아플라톡신 수치를 측정하기 위해 UPLC를 사용하여 처리하였다. 이러한 결과는 액체 크로마토그래피 질량 분석법으로 더욱 확인되었습니다. 전반적으로, RNAi 2 88 72는 대조군에 비해 아플라톡신 B 2 및 아플라톡신 B 1에서 90 내지 100 % 감소를 보였다.

RNAi 2 : 88 : 74는 두 아플라톡신 모두에서 60-100 % 감소를 보여주었습니다. 이 절차에 따라 곰팡이 침입에 대한 종자 반응을 더 잘 이해하기 위해 동일한 종자 추출물을 사용하여 phyto Xin을 분석할 수 있습니다. 이 방법은 또한 mycotoxins.Oxon 제어를 위한 RNAI 기술을 개발하는 데 도움이 되는 고유한 도구를 제공할 것입니다.