Name: 비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 배우세요 비례 형광 현미경을 활용한 살아있는 식세포에서 파고솜 산도 측정 방법입니다. 이 기술은 실시간 pH 변화 모니터링과 개별 파고솜 이질성 분석을 통해 병원체 회피 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation)의 운영 보조금 N° 31003A-149566(N.D.)과 젊은 연구자 보조금(Young Investigator Subsidy)을 통해 쥘 쏜 경(Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust)의 재정 지원을 받고 있다.

윤리 선언문 : 모든 동물의 조작이 제네바 대학의 동물 연구위원회의 지침을 엄격히 준수 하였다. 식세포 대상 1. 준비 <ol><li> 10 ml의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 건조 모산 20 mg을 추가합니다. 10 분간 끓는 수욕에서 와류 및 열. 5 분 2,000 XG에 시원하고 원심 분리기. </li><li> 물 목욕 초음파기에서 10 분 동안 상층 액 1 ml의 PBS에 재현 탁하고 초음파 처리를 제거합니다. 두 개의 1.5 ml의 튜브에 500 μl를 전송합니다. 5 분 동안 11,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 500 μL PBS로 세척을 반복합니다. 자이 모산 비등 냉동 -20 ℃에서 보관, 분주 될 수있다. </li><li> 갓 CO 3 0.1 M 나 2를 준비 500 μL, pH가 9.3로 위 (단계 1.2)에 두 번 모산을 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 후 490 μL에 재현 탁. 10 mg을 10 μl를 추가 / FITC 디메틸 sulfoxid에 용해 ㎖로E (DMSO), 소용돌이, 호일로 커버하고, 실온에서 4 시간 동안 교반 품어. </li><li> 처음으로 0.5 ml의 DMSO + 300 μL PBS, 0.5 ml의 DMSO + 450 μL PBS, 다음 PBS 혼자 다음 + 150 μL PBS 0.5 ml의 DMSO와, 상기와 같이 (단계 1.2) 세척, 언 바운드 염료를 제거하십시오. </li><li> 혈구를 사용하여 모산를 계산합니다. 500 μL PBS, 소용돌이에 모산의 1 μl를 추가, 다음은 중앙 그리드 위에 배치 커버 슬립을 충족 혈구 챔버의 가장자리에 10 μl를 추가합니다. 20X 목표를 장착 밝은 필드 현미경의 혈구를 탑재합니다. </li><li> 16 사각형을 포함하는 왼쪽 상단에 초점 손 집계 카운터를 사용하여이 지역의 모든 모산 입자를 계산합니다. 오른쪽 하단에 반복합니다. = 모산 농도 / 2 × 500 × 104 모산 / ㎖ 카운트 : 다음의 방정식을 사용하여 농도를 산출 모산. 표지 모산 냉동 -20 ℃에서 보관, 분주 될 수있다. </li><li> 레이블 모산 위스콘신 Opsonize(100) 희석 : 1 토끼 항 모산 항체 토륨. 소용돌이와는 37 ° C의 물을 욕조에서 1 시간 동안 배양한다. (단계 1.2) 위와 같이 500 μL PBS로 세척 할 것. 참고 : 모산 나중에 분석을 더 어렵게 만들 수 있습니다 덩어리를 형성하는 경향이 초음파 처리는 매우, 특히 옵 소닌 후, 권장합니다. 65 % V / V 쥐 또는 인간 혈청과 옵 소닌은 대안으로 사용될 수있다. </li><li> 단계 1.7에서 1.8 사이에서 설명한대로 혈구 계를 사용 모산을 계산하고, 100 × 106 입자 / ㎖로 희석한다. 이러한 보완 또는 전혀 옵 소닌과 같은 다른 식세포 자극과 옵 소닌은 선택적으로 수행 될 수있다. </li></ol> 2. 라이브 비디오 현미경 <ol><li> 다른 곳에서 38 세부 사항에 설명 된대로 기본 마우스 호중구를 분리합니다. <ol><li> 또한, 모든 탐식 세포 유형을 사용합니다. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 5 % 소 태아 혈청 (V / V), 200 U 페니실린 / streptomyci 보충 1640 배지에서 얼음에 호중구 유지N, 10 × 106 세포 / ml의 농도로 사용 전까지. 다른 세포 유형 1-4 일전 접종 할 수있다. </li></ol></li><li> , 35mm 유리 - 바닥 접시의 중앙에 호중구의 2 × 105 (20 μL)를 첨가 배지의 50 μl를 첨가하여 강하를 확산 및 세포가 부착 할 수 있도록 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 1 ㎖가 특정 MPO 억제제 4- 아미노 히드라 지드 (4- ABH, 10 μM)을 함유하는 37 ℃로 가온 추가. 나트륨 아 지드 (5 mM)을 불특정 MPO 억제제도 이용 될 수 있지만, 최근의 pH 39에서 추가 비특이적 효과를 발휘하기 위해 제안되어왔다. </li><li> 37 ° C 난방 시스템과 40X 오일 목적으로 장착 된 위드 형광 현미경에 접시를 탑재합니다. 세포 및 장비 평형화 있도록 10 분 동안 촬상 않고 세포를 배양한다. </li><li> 명 시야 투과 이미지를 획득 현미경 설정 조정 [PHA자체 또는 440 nm의 또는 490 nm의 여기 및 535 nm의 방출 매 30 초와 가능한 경우 미분 간섭 대비 (DIC)]. </li><li> 너무 광표백 및 광독성 및 실험 질문에 따라 요구되는 것은 피하기 위해 현미경 시스템에있어서의 노출 시간 및 주파수 획득을 조정한다. 이미지 수집을 시작합니다. </li><li> 2 분 후, 10 × 106 (50 μL)를 FITC-모산 접시의 중앙에 추가 옵 소닌. 사용 식세포와 대상의 종류에 따라 세포의 비율 : 대상을 조정합니다. </li><li> 30 분 동안 이미지를 계속합니다. 30 분 후 시간 경과 수집을 중지하고 타이머를 시작합니다. 무대를 이동하고 모든 5 분 이내에, 이미지 다른 phagosomes에보기의 다른 분야에서 10 개 이상의 스냅 샷을 캡처합니다. </li></ol> 3. 교정 및 제어 실험 <ol><li> 실험 일에 (레시피는 표 1에 기재되어있다) 이전에 pH 보정 용액을 제조하고 10 ㎖ 분취 량으로 동결.수조에서 37 ℃로 교정 솔루션과 따뜻하게 녹여. pH 미터와 pH를 확인하고 솔루션의 실제 산도를 기록합니다. </li><li> 이전 이미지 수집에 유리 바닥 접시에 연동 펌프를 장착하고 (제 2) 상기와 같이 라이브 비디오 현미경을 수행합니다. </li><li> 30 분 획득주기의 끝에서, 접시 내의 용액을 제거에 펌프를 켜고 제 교정 액 1ml를 추가 펌프를 멈춘다. </li><li> 신호가 보통 5 분 안정 될 때까지 기다립니다. 각각의 보정 용액으로 반복합니다. <ol><li> 실험 하루에 적어도 하나의 보정을 수행하고, 높은 pH를 시작하여 순차적으로 낮은 작동뿐만 아니라 낮은 산도에서 시작하여 가장 높은쪽으로 순차적으로 보정 작업. </li></ol></li><li> 대조군으로서, 유리 접시 바닥에 900 ㎕의 세포 HBSS HBSS로 희석 된 100 μM NADPH 산화 효소 억제제, 디 페닐 요오드 propionium 100 ㎕ (DPI)를 추가하고,10 분 동안 품어. </li><li> 인수를 시작하고 (단계 2.7) 위와 같이 모산를 추가합니다. 식세포의 15 분 후, HBSS로 희석 (콘카) concanamycin 10 μM V-ATPase의 억제제의 10 μL를 추가하고 추가로 15 분 동안 영상을 계속한다. </li></ol> 4. 분석 <ol><li> 시간 경과 영화와 phagosome 스냅 샷의 분석. 참고 : 다음 지침은 ImageJ에 대한 특정이다. 단계별 설명은 사용되는 소프트웨어 따라 광범위하게 변할 수 있지만,이 섹션에 설명 된 기능은 가장 전문 이미지 분석 소프트웨어로 제공된다. <ol><li> 전문 이미지 분석 소프트웨어 이미지를 연다. 어떤 세포가없는 지역에 사각형 다각형 선택 도구를 사용하여 작은 사각형 투자 수익 (ROI)을 그리기 및 투자 수익 (ROI)에서 플러그인&gt; BG의 뺄셈을 클릭하여 490 채널의 배경을 뺍니다. 그런 다음&gt;을 클릭 편집&gt; 선택하여 440 채널에서 동일한 투자 수익 (ROI)을 업로드 선택과 반복을 복원합니다. </li><li>다음 작업 드롭 다운 메뉴에서 &#39;분할&#39;을 선택, ... 프로세스&gt; 이미지 계산기를 클릭 image1에와 이미지 2 드롭 다운 메뉴에서 해당 이미지를 선택하여 440 채널로 나눈 490 채널의 32 비트 비율의 이미지를 만들 및 32 비트 (플로트) 결과의 체크 박스를 체크. </li><li> &gt; 레인보우 RGB를 이미지&gt; 조회 테이블을 클릭하여 비 호환 색상 코딩 색상 코딩 룩업 테이블을 변경합니다. 임계 값 비율 이미지&gt; 임계 값&gt; 이미지를 클릭하여 0과 무한대 픽셀을 제거 조정하는 .... NaN의 확인란 설정 배경 픽셀이 선택되어 있는지 확인하고, 그 모산은 빨간색으로 표시되도록 스크롤 막대를 조정하고 적용을 클릭합니다. </li><li> 이미지를 클릭하여 멀티 채널 합성으로 시야의 채널이 비 스택 수확기&gt; 컬러&gt; 채널 병합하고 회색 채널 드롭 다운 메뉴의 명 시야 화상과 녹색 채널 드롭 다운 메뉴의 비 화상을 선택하고, 선택체크 상자를 원본 이미지를 유지합니다. 시간 경과 영화 또는 phagosomes 분석 할 수있는 결정하기 위해 스냅 샷을 검색합니다. 밝은 필드 채널이 유용합니다. </li><li> 추가&gt; phagosomes 주위에 타원형 다각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역 (ROI)을 그리기 및 분석&gt; 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 클릭하여 투자 수익 (ROI) 관리자에 추가합니다. 더&gt; 다중 측정 및 슬라이스 체크 상자 당 하나의 행을 선택 해제를 클릭하여 자신의 모산 강도 비를 측정한다. </li><li> 저속 영화, 트랙은 각 시점을 측정하는 M + Ctrl 키를 입력 ROI 드로잉하고 시간의 강도 값을 추적 할 때 필요한 ROI를 이동하여 한 번에 하나씩 phagosomes. 스프레드 시트 소프트웨어에 결과 창에서 측정 값을 복사합니다. 참고 : 독립적 인 실험 15 (실험 × 3 당 5 시간 코스)의 분석은 이상하지만, 더 많거나 적게 관찰 된 변화에 따라 요구 될 수있다. ROI를 저장하는 것은 항상 좋습니다. 일부 소프트웨어 패키지는 허용 영상 정합stration와 로아의 동적 업데이트, 분석의이 부분을 촉진. </li></ol></li><li> 형광의 pH 값으로 변환 <ol><li> 4.1 절에 설명 된대로 교정 시간 경과 영화 phagosomes에 대한 440분의 490의 비율을 측정합니다. </li><li> 스프레드 시트에서, 시간의 경과 비율 값을 플롯하고, 각 pH 보정에 대응하는 시간 기간의 중간에서 5 시간 지점에서 (5-20 사이, 보통) 시야 내의 모든 phagosomes에서 평균 비율 값을 계산 해결책. (또한 그림 5A에서 빨간색 상자를 참조하십시오.) </li><li> 실제 측정의 pH에​​ 대한 이들의 평균 440분의 490 비율의 값을 플롯. 하나의 그래프에 적어도 3 개의 독립적 인 교정을 결합합니다. 일반적으로 S 자형 방정식, 비선형 회귀 (최적 곡선)을 할 수있는 통계 나 수치 소프트웨어 패키지를 사용합니다. 참고 : 예를 들어,도 5b에 사용되는 방정식은 볼츠만 S 자형이었다 [Y = 아래 + ((상위 - 하위)/ (1 + EXP ((V50-X) / 기울기)) Y 값 440분의 490 비율이다], X는 pH 값과 상단, 하단은, V50 및 경사 매개 변수가 소프트웨어에 의해 계산되는가이다. </li><li> pH로 비율 값을 변환 얻어진 방정식을 사용합니다. 참고 : 예를 들어,도 5b에 아 지드 화 나트륨의 존재하에 검량선 얻은 식이다 440분의 490 비 = 1.103 + [(2.89에서 1.103 사이) / (1 ​​+ EXP ((6.993-산도) /0.9291)] . 산도에 대한 해결하면 다음과 같은 식을 제공합니다 : 산도 = 6.993-0.9291 * [LN ((1.178 / (비 - 1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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더 많은 시간이 목표물에 커플 링하여 pH 민감성 염료의 사용과 유사한 방법을 적용하지만 phagosomes의 모집단의 평균 pH는 예컨대 분광 측정과 같은 다른 방법 FACS,보다 많이 소요되었지만, 현미경은 몇 가지 장점을 제공한다. 우선 내부와 외부가 내면화 구속,하지만 것입니다, 입자는 쉽게 각각 소멸 또는 외부 입자에 라벨을, 같은 트리 판 블루 또는 항체와 같은 다른 화학 물질을 추가 할 필요없이 구별 할 수 있습니다. 둘째 실시간으로 세포를 수행하면 연구자가 동시가 인구 기반 방법으로 간과 될 수있는 반면 너무 마이그레이션, 감지 및 결합 입자에 미치는 영향은 쉽게, 여기에 식별 할 수있는 식세포 과정의 여러 측면을 관찰 할 수 있다는 것입니다. 또한, 식균 작용의 개시의 동기화, 자주, 더 인해 차가운 충격 40, 41로 다른 인신 매매 이벤트를 교란 할 수 4 ° C에서 배치 세포에 의해 수행되지시간 제로 필요한 t을 직접 식별 할 수 있습니다. 라이브 현미경을 수행 할 때 실제로,이 4 °...

선천성 면역 세포가 큰 입자를 집어삼키는 과정인 Phagocytosis는 단세포 유기체의 섭식 메커니즘에서 진화했으며, 표적에 결합하고, 막으로 감싸고, 막을 꼬집어 잡아 세포질 내에 식체(phagosome)라고 하는 액포를 형성하는 과정을 포함합니다. 식체막은 원형질막에서 파생되지만, 활성 단백질 및 지질 분류는 물론 식체체 형성 중 내막과의 융합을 통해 식체를 세포 내에서 섭취된 물질의 사멸, 중화 및 분해를 허용하는 분해 특성을 가진 뚜렷한 세포소기관으로 변환합니다1-3. phagosomal maturation이라고 하는 이 과정은 전자를 강력한 산화제 O2 및 그 유도체 반응성 산소 종 (ROS) 2,4를 생성하는 phagosome으로 전자를 전달하는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 (NADPH) 산화효소를 포함한 단백질 분해 및 살균 효소의 호스트에 의존합니다. 
식체의 내강 pH는 식솜 기능에 필요한 여러 이벤트에 지대한 영향을 미칩니다. 첫째, pH는 일반적으로 내막의 이동에 영향을 미치는데, 막관통 조절인자의 pH 의존적 구조적 변화는 Arfs, Rabs 및 소포 외피 단백질과 같은 이동 결정 요인의 모집을 변화시키며, 이는 다시 어떤 소포가 식체와 융합할 수 있는지 정의하기 때문입니다 5-8. 둘째, 식체 내강의 이온 조성은 식체가 성숙함에 따라 변형되며, 식세포 기능을 촉진하는 Na+/H+ 교환기 또는 ClC 계열 Cl-/H+ 반운반체와 같은 일부 이온 수송체는 H+ 전좌에 의존합니다 9,10. 마찬가지로, ROS 생산은 식체 pH와 밀접한 관련이 있습니다. ROS와 그 독성 산화제 부산물은 오랫동안 호중구의 식체 사멸에 중요한 것으로 인식되어 왔으며 4,11,12 대식세포, 수지상 세포(DC) 및 아메바 13-16을 포함한 다른 식세포에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. NADPH 산화효소는 NADPH가 소비될 때 세포질에서 H+를 방출하는 전기발생 효소이며, 그렇지 않으면 효소 17-21의 자기 억제로 이어질 수 있는 대규모 탈분극을 완화하기 위해 수송된 전자와 함께 동반 HVCN1 채널을 통해 H+를 동시에 전달해야 합니다. 마지막으로, 여러 단백질 분해 효소는 서로 다른 pH에서 최적의 활성을 가지므로 시간에 따른 식체 pH 변화는 어떤 효소가 언제 활성화되는지에 영향을 미칠 수 있습니다. 식체 pH의 중요성은 Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis 및 Salmonella typherium과 같은 유기체에 의해 강조되며, 이들은 식체 pH 22-24를 변화시킴으로써 적어도 부분적으로나마 식세포 사멸을 파괴합니다.
포유류의 주요 식세포는 호중구, 대식세포, 수지상 세포이며, 세포 유형에 따라 시간에 따른 식체 pH 변화는 크게 다를 수 있으며 다른 역할을 하는 것으로 보입니다. 대식세포에서는 ATP 의존성 양성자 펌프인 액포 ATPase(V-ATPase)에 의해 매개되는 강력하고 빠른 산성화가 사멸을 매개하는 핵심 인자 중 하나인데, 이는 식세포작용을 섭식 기전으로 사용하는 아메바에 존재하는 기전과 유사하다 28. 이 세포에서는 산성 프로테아제의 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 대조적으로, 호중구 사멸은 골수과산화효소(MPO)11에 의해 생성된 HOCl뿐만 아니라 ROS에 더 많이 의존하며, pH는 처음 30분 동안만 중성 또는 알칼리성을 유지하다가 나중에만 산성화됩니다 29,30. 중성 pH는 특정 카텝신(cathepsin)과 같은 산화성 프로테아제(oxidative protease)의 활성을 촉진하는 것으로 제안되었습니다. DC에서 식체 pH는 일부는 산성화를보고하고 다른 일부는 중성 또는 알칼리성 pH 31,32를보고하지만 ROS와 pH는 주요 기능 중 하나 인 T 세포에 항원을 제시하는 이러한 세포의 능력에 깊은 영향을 미칠 수 있습니다 33. 
중요한 것은 호르몬, 케모카인 및 사이토카인이 성숙과 식세포 행동의 변화를 유도하는 신호 이벤트를 생성할 수 있으며, 이는 차례로 식체 pH 34,35에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 마찬가지로, 항암 요법으로도 고려되는 항말라리아 클로로퀸(antimalarial chloroquine)과 같은 약물은 식체 pH에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 면역 결과에 영향을 미칠 수 있다 36. 따라서 다양한 세포 생물학자, 면역학자, 미생물학자 및 약물 개발자는 특정 유전적 파괴, 생체 활성 화합물 또는 미생물이 선천성 및 적응 면역 반응에 미치는 영향을 이해하는 메커니즘을 이해하려고 할 때 식염색체 pH를 측정하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 
여기에서는 호중구 식체 pH 19를 조절하는 데 HVCN1 채널의 중요성을 보여줄 수 있는 호중구의 식체 pH를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 535nm에서 형광 방출이 490nm에서 여기될 때 pH에 민감하지만 440nm에서는 민감하지 않은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)의 비율계량 특성을 기반으로 합니다 37. 이 염료가 표적(이 경우 zymosan)에 화학적으로 결합되면 광시야 형광 현미경을 사용하여 세포를 식세포작용으로 이미지화하고 식체가 성숙함에 따라 식체 pH 변화를 실시간으로 측정할 수 있습니다. 그런 다음 식세포가 이온단인 니제리신(nigericin)과 모넨신(monensin)을 포함하는 다른 pH의 용액에 노출되는 보정 실험을 수행하여 실제 pH를 수집하며, 이를 통해 식체(phagosome) 내 pH가 외부 용액과 빠르게 평형을 이룰 수 있습니다. 그런 다음 비율 값을 용액의 알려진 pH와 비교하고, 비선형 회귀 및 비율 값에서 pH를 계산하는 데 사용되는 결과 방정식에 의해 보정 곡선이 구성됩니다.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>다양한 공급 업체가 존재합니다</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>다양한 공급 업체가 존재합니다</td></tr><tr><td>Anti-zymosan 항체 (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)Life</td> <td>Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637은 동등한 제품입니다. 또는 25% 혈청을 옵소니징 시약으로 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>Diphenyleneiodonium chloride (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>Concanamycin A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>Hank's balance salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Ringer's balanced salt solution 또는 기타 명확한 생리학적 완충액 대체됩니다.</td></tr><tr><td>탄산나트륨 (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>다양한 공급자가 존재합니다</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>다양한 공급자가 존재합니다</td></tr>.<tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>다양한 공급업체가 존재합니다</td></tr><tr><td>. N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>다양한 공급자가 존재합니다</td></tr>.<tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N&프라임 , N 프라임 - 테트라 아세트산 (EGTA)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>3777</td><td>다양한 공급 업체 존재</td></tr><tr><td>트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>T1503&nbsp;</td><td>다양한 공급자가 존재합니다</td></tr>.<tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>절대 에탄올 (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>다양한 공급자 존재</td></tr><tr><td>유리 바닥 35mm 페트리 접시 (불소)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &micro; - 적절한 이미징 챔버가있는 투명 접시 또는 커버 슬립을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>초음파 처리 수조</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>초음파 처리기를 대신 사용할 수 있으며 다양한 기기 제공 업체가 존재합니다</td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>다양한 기기 제공 업체가 있습니다</td></tr><tr><td>.광시야 실시간 이미징 현미경</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>다양한 기기 공급업체가 존재하지만 현미경은 440/535 및 490/535 여기/방출을 기준으로 이미징할 수 있어야 합니다. 명시야 기능이 있는 스피닝 디스크 컨포칼 셋업이 대체될 수 있지만 자이모산은 더 자주 초점에서 벗어나는 경향이 있습니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>연동 펌프 (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>다양한 기기 제공업체 존재</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>다양한 기기 공급업체 존재</td></tr><tr><td>Manual Counter</td><td>Milian SA</td><td></td><td>다양한 기기 공급업체 존재</td></tr></tbody></table>

비례 형광 현미경으로 phagosome 산도 측정

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

식균 작용은 선천성 면역 세포를 죽이거나 무력화 섭취 자료를, 또는 항원으로 제시하고 적응 면역 반응을 시작하기 위해 박테리아, 세포 사멸 세포 또는 다른 이물질을 삼켜 통해 기본적인 과정이다. phagosomes의 pH는 endomembranes 및 단백질 분해 효소, 식세포 공포가 degradative 세포 기관으로 성숙 할 수 있도록 이벤트의 활성화와 분열 또는 융합을 조절하는 중요한 매개 변수입니다. 또한, H +의 전위의 다른 숙주 조직으로 효율적으로 사멸에 필수적인 시그널링되어 반응성 산소 종 (ROS), 높은 수준의 생산을 위해 필요하다. 많은 세포 내 병원균, phagosomal 산성화를 제한 phagosome 생물학에서의 pH의 중요성을 강조 식세포 살해를 파괴. 여기에 우리가 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)를 사용하여 호중구에 phagosomal의 산도를 측정하는 비율 계량 방법을 설명은 식세포의 TARG으로 모산를 - 표지ETS, 라이브 셀 이미징. 분석은 490 nm에서 여기 때 단일 염료, 오히려 절대 형광보다, pH에 의존하는 비율의 정량화를 허용, 440 nm에서 흥분하지 않을 경우 산성 pH에 의해 급냉 FITC의 형광 특성을 기반으로합니다. 현장 염료 교정 및 실제 pH 값에 대한 비율의 변환에 수행하기위한 세부적인 프로토콜도 제공됩니다. 그들은 같은 표백 등의 교란에 덜 민감로 단일 염료 비율 계량 방법은 일반적으로 단일 파장 또는 이중 염료 의사 비율 계량 프로토콜 우수 고려, 측정 된 신호를 왜곡 변화, 레이저 변화, 고르지 라벨, 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 용이하게 다른 포식 세포 유형에서의 pH를 측정하기 위해 수정 될 수 있으며, 자이 모산 불활성 비드에서 살아있는 미생물, 기타 아민 - 함유 입자에 의해 대체 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 다양한 범위의 pH 또는 다른 phagosom 민감한 다른 형광 물질을 사용하도록 구성 될 수있다알 활동, 그것은 phagosomes의 기능 이미징을위한 일반화 된 프로토콜 만들기.

다음 실험에 대한 대표적인 결과 어디에 야생형 또는 골수에서 분리 한 기본 마우스 호중구의 phagosomal 산도 Hvcn1 - / - 마우스를 비교 하​​였다. 성공적인 실험을 위해, 그것은 나중에 이미지 분석 동안 세그먼트에 더 어려울 것이다 너무 많은 phagosomes을 회피하면서, 저속 동영상의 전체 지속 기간 동안 시야 내에 충분히 phagosomes를 획득하는 것이 중요하다. 1은 도표 좋고 나쁜 confluencies의 예. 시간에 따른 스냅 샷 분석을 위해, 외부 모산 입자는 phagosomes 구별 및 분석에서 제외해야합니다. 2 명 시야 이미지 phagosomes에서 외부 모산 입자를 구별 할 수 있도록하는 것이 유용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그림 3은 전형적인 phagosome의 예를 보여줍니다 Hvcn1에 비해 야생형에서 산도 시간 코스...

Phagosomal pH는 식좀 성숙, 산화제 생성, 식체 사멸 및 항원 제시에 영향을 미칩니다. 여기에서는 형광 현미경을 사용하여 살아있는 식세포에서 개별 식체의 시간 경과 및 종말점 pH 변화를 측정하기 위한 비율계량 방법을 설명합니다.

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

이 실험 세트의 전반적인 목표는 비율 측정 형광 현미경(ratiometric fluorescence microscopy)을 사용하여 살아있는 세포 내의 파고솜(phagosome) pH를 측정하는 것입니다. 이 방법은 병원체 상호작용의 핵심 분자를 식별하거나, 유전적 결손 또는 약물이 식세포 작용에 미치는 영향과 같이 식세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석( FACS)이나 분광법과 같은 집단 기반 방법과 달리, 입자 결합 이동의 변화나 개별 파고솜의 이질성과 같은 효과를 검출할 수 있다는 점입니다.많은 병원성 화학 유기체들이 파고솜 내에서의 분해를 피하기 위해 파고솜의 pH를 변화시킬 수 있으므로, 이 기술의 함의는 이러한 유기체들에 대한 치료법으로 확장됩니다. 이 절차를 시작하려면, 건조된 Xan 20 mg을 멸균 PBS 10 mL에 넣고 볼텍싱한 후 끓는 물 중탕에서 10분 동안 가열하십시오. 그 다음 냉각하고 2000 Gs에서 5분 동안 원심 분리하십시오.그 후, 상층액을 제거하고 Xan을 1 mL의 PBS에 재현탁합니다. 수조(water bath)에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 재현탁된 Xan 500 µL를 두 개의 1.5 mL 튜브에 옮기고 11,000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.500 µL의 PBS로 세척을 반복합니다. 그 다음, pH 9.3에서 새로 조제한 0.1 M 탄산나트륨 용액 500 µL로 Xan을 두 번 세척하고, 마지막 세척 후 탄산나트륨 용액 490 µL에 재현탁합니다. 이어서, DMSO에 10 mg/mL 농도로 녹인 FZ 10 µL를 Xan에 첨가하고 볼텍싱합니다.호일로 덮고 실온에서 4시간 동안 교반하며 배양합니다. 결합되지 않은 눈을 제거하기 위해 먼저 0.5 mL의 DMSO와 150 µL의 PBS 혼합액으로 세척하며, 세척 단계 사이에 초음파 처리를 포함합니다. 다음으로 0.5 mL의 DMSO와 300 µL의 PBS 혼합액으로 세척한 후, 0.5 mL의 DMSO와 450 µL의 PBS 혼합액으로 세척하고 이어서 PBS만으로 세척합니다. 그 후, 500 µL의 PBS에 1 µL의 Xan을 첨가하고 볼텍싱합니다.그 다음, 커버슬립과 맞닿는 혈구계(hemocytometer) 챔버 가장자리에 희석된 xma sand 10 µL를 추가합니다. 20배 대물렌즈가 장착된 명시야 현미경에 혈구계를 설치합니다. 16개의 정사각형이 있는 왼쪽 상단 구석에 초점을 맞추고, 이 영역 내의 모든 xmas sand 입자 수를 셉니다. 수동 계수기를 사용하여 오른쪽 하단 구석에서도 동일한 절차를 반복합니다.그 후 이 공식을 사용하여 Xan 농도를 계산합니다. 다음으로, 1:100로 희석한 rabid anti Xan 항체로 표지된 Xan을 옵소닌화(opsonize)한 후 볼텍싱하고, 37 °C 항온수조에서 1시간 동안 시료를 배양합니다. 이어서 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 xmas sand 수를 세고, 이를 100 × 10⁶ particles/mL로 희석합니다.일차 마우스 호중구를 분리한 후, 35 mm 유리 바닥 디쉬 중앙에 2 × 10⁵개의 호중구를 첨가합니다. 그런 다음 50 µL의 배지를 추가하여 방울을 넓게 펴주고, 세포가 부착될 수 있도록 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 이후, myeloperoxidase 억제제가 포함된 37 °C로 가온된 HBSS 1 mL를 첨가합니다.37 °C 가열 시스템과 40x 오일 렌즈가 장착된 광시야 형광 현미경에 디쉬를 장착합니다. 세포와 장비가 평형 상태에 도달할 수 있도록 10분 동안 이미징 없이 세포를 배양합니다. 그다음, 440 nm 또는 490 nm의 여기 파장과 535 nm의 방출 파장을 사용하여 30초마다 명시야 투과 영상을 획득하도록 현미경 설정을 조정합니다.2분 후, 10배의 10을 6 ized fitzy zy sand에 추가하여 디시 중앙에 넣고 30분 동안 계속해서 이미징합니다. 30분 후, 타임랩스 획득을 중단하고 타이머를 시작합니다. 스테이지를 이동하여 5분 이내에 다른 vaga 구역을 이미징하기 위해 서로 다른 시야에서 10장 이상의 스냅샷을 캡처합니다.본 절차에서는 보정 용액을 해동하고 워터배스(water bath)에서 37 °C로 가온합니다. pH 미터를 사용하여 pH를 확인하고 기록하십시오. 다음으로, 이미지 획득 전에 연동 펌프를 글래스 바텀 디쉬(glass bottom dish)에 장착합니다.그 다음, 30분간의 획득 기간이 끝난 시점에 라이브 비디오 현미경 관찰을 수행합니다. 펌프를 켜서 디쉬 내의 용액을 제거하십시오. 이어서, 첫 번째 교정 용액 1 mL를 첨가하고 펌프를 정지시킵니다.신호가 안정될 때까지 5분 동안 기다립니다. 각 보정 용액으로 동일한 절차를 반복합니다. 타임랩스 동영상과 파고좀 스냅샷을 분석하려면 ImageJ로 이미지를 엽니다. 세포가 없는 영역에 작은 정사각형 ROI를 그려 490 채널의 배경을 제거합니다.사각형 다각형 선택 도구를 사용하고 플러그인을 클릭합니다. 그 다음 배경 감산(BG subtraction)을 수행합니다. 편집을 클릭하여 440 채널에 동일한 ROI를 업로드하십시오.그런 다음 선택 영역을 지정하고, 선택 영역 복원 후 배경 제거 절차를 반복합니다. Process를 클릭한 후 Image Calculator를 선택하여 490 채널을 440 채널로 나눈 32비트 비율 이미지를 생성합니다.그 후, 이미지 1 및 이미지 2 드롭다운 메뉴에서 적절한 이미지를 선택하십시오. 연산 드롭다운 메뉴에서 divide를 선택하고 32 bit result 체크박스를 선택하십시오. 그런 다음, image를 클릭하고 up tables를 선택하여 컬러 코딩 룩업 테이블을 ratio compatible 컬러 코딩으로 변경하십시오.그런 다음 rainbow RGB를 선택합니다. 이미지(image)를 클릭한 후, 비율 이미지의 임계값(threshold)을 설정하여 0 및 무한대 픽셀을 제거하십시오. 그 후 조정(adjust) 및 임계값(threshold) 설정을 수행합니다.Xan이 빨간색으로 나타나도록 스크롤 바를 조절한 뒤 apply를 클릭하고, set background pixels to nan 체크박스가 선택되어 있는지 확인하십시오. 배경 값과 Xan 신호 값의 비율이 매우 비슷하여 결과 이미지에 노이즈가 심한 경우, process를 클릭하여 440 채널에 소량의 배경 값을 다시 추가하십시오. 그 다음 math를 수행하십시오.그 다음, 더 깨끗한 결과물을 얻기 위해 비율 이미지를 다시 생성합니다. 또는 440 채널 배경 제거 과정을 생략할 수도 있습니다. 이어서, 이미지 색상(image color)을 클릭하여 이 비율 스택과 명시야 채널을 다채널 합성 이미지로 결합합니다.그 다음 채널을 병합합니다. 회색 채널 드롭다운 메뉴에서 명시야 이미지를 선택하고, 녹색 채널 드롭다운 메뉴에서 비율 이미지를 선택하십시오. 그런 다음 소스 이미지 유지 확인란을 선택하십시오.그 후, 명시야(brightfield) 채널과 비율(ratio) 채널을 비교하여 타임랩스 동영상 또는 스냅샷을 스캔하여 분석할 파고솜(phagosome)을 결정합니다. 타원형 다각형 선택 도구를 사용하여 파고솜 주변에 ROI를 그리고, 분석 도구(analyze tools)를 클릭한 뒤 ROI 관리자(ROI manager)에서 추가(add)를 클릭하여 ROI 관리자에 추가합니다. 이어서 'more multi measure'를 클릭하고 'one row per slice' 체크박스를 해제하여 Xan 강도 비율을 측정합니다. 이는 타임랩스 동영상의 경우에 해당합니다.ROI 유형의 제어 M을 그려 각 시점을 측정함으로써 FGA 구역을 하나씩 추적하고, 시간에 따른 강도 값을 추적하기 위해 필요한 경우 ROI를 이동시키십시오. 그런 다음 결과 창의 측정값을 스프레드시트로 복사하여 형광 값을 pH 값으로 변환하십시오. 보정 타임랩스 동영상 내 phagosome의 490 대 440 비율을 스프레드시트에서 측정한 후, 시간에 따른 비율 값을 그래프로 그리십시오.그런 다음, 각 pH 보정 용액에 해당하는 시간대의 중간 지점에서 5개 시점에 대해 시야 내의 모든 파고솜의 평균 비율 값을 계산합니다. 최소 3회 이상의 독립적인 보정 결과를 하나의 그래프로 결합하여, 평균 490 대 440 비율 값을 실제 측정된 pH에 대해 플롯합니다. 이후 비선형 회귀 분석을 수행하여 비율 값을 pH로 변환하기 위한 방정식을 도출합니다.이 그림은 파고솜(phagosomes)과 섭취된 Xan이 어떻게 구별되는지 보여줍니다. 왼쪽 패널은 병합된 명시야 이미지와 490에서 440 Fitz zy 및 비율을 보여줍니다. 반면 오른쪽 패널은 명시야 이미지만을 보여줍니다.식포(Phagosome)는 세포와 공국소화되지 않거나, 보여지는 명시야 이미지에서 식포의 특징인 밝은 링으로 둘러싸인 어두운 중심부와 일치하지 않는 형광을 띠는 외부 입자들과 구분될 수 있습니다. 여기 야생형(wild type) 및 HV CN one 녹아웃 호중구의 전형적인 시간 경과가 나와 있습니다. 야생형 호중구의 경우, pH는 초기 시점에서 중성이거나 약간 알칼리성입니다. 섭식 후, HV CN one 녹아웃 호중구의 식포는 알칼리성 또는 산성일 수 있습니다. 표적 추가 30~35분 후에 촬영한 스냅샷을 통해, 여기에 제시된 Fitz Xan 비율의 히스토그램에서 다수의 식포로부터 평균 집단의 pH를 계산할 수 있습니다.야생형과 HVCN1 결핍 호중구 사이의 소포 pH 차이를 확인할 수 있었습니다. 이 기술을 숙달하면 6시간 만에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 최적화 단계부터 이미지 촬영 조건을 최적화하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한, 최적화 단계에서 항체 농도를 최적화하면 이후 절차에서 견고한 식세포 작용을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다.phagosome의 발달 후 pH와 함께 소량의 ROS 생성이나 박테리아 사멸 능력이 변화하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 ROS 생성 측정 또는 박테리아 사멸 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 식세포 생물학 분야의 연구자들이 식세포가 섭취한 물질을 사멸시키거나 처리하여 추가적인 면역 반응을 유도하는 능력에 영향을 주는 요인이 무엇인지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 살아있는 세포 내 phagosome의 생리학적 파라미터를 실시간으로 측정하기 위한 기하학적 형광 현미경법 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.UNIFOR 억제제와 살아있는 세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 유리 바닥 접시 표면에 부착된 IgG-opsonized 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식세포작용 중 식체(phagosome) 형성 및 폐쇄를 실시간으로 시각화하기 위한 고해상도 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 기술을 보여줍니다. 대식세포는 적혈구 주위로 가성족(pseudopodia)을 확장하고 식체(phagosome) 내부를 삼켜 유리 표면에서 분리합니다.

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

세포 내 pH를 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만 이 중 세포질 및 소기관 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 비율계량 이미징을 통해 세포질과 소포 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

이 논문은 phagosomal의 pH 및 영역뿐만 아니라 비율 적 지표 seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, 또는 S-1을 사용하여 인간 및 마우스 호중구의 세포 내 pH를 측정하는 간단한 방법을 설명한다. 이 라이브 셀 공 초점 형광 현미경 및 이미지 분석을 사용하여 얻을 수있다.

호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.

대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

우리는 살아있는 세포에 있는 개별 적인 macropinosomes에 있는 pH, 산화 사건 및 단백질 소화를 측정하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이중 불소 경 미세 검사법과 인구 기반 기술에 비해 제공하는 이점에 중점을 둡니까.

이중 불소공포증 비율 현미경 검사를 사용하여 매크로피노좀의 pH, 레독스 화학 및 분해 능력 측정

배우세요 비례 형광 현미경을 활용한 살아있는 식세포에서 파고솜 산도 측정 방법입니다. 이 기술은 실시간 pH 변화 모니터링과 개별 파고솜 이질성 분석을 통해 병원체 회피 메커니즘 연구에 활용됩니다.

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

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