축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 백질 내의 작은 뇌졸중 부위를 정확하게 찾아내어, 이러한 흔한 형태의 피질하 백질 뇌졸중을 모델링하는 것입니다. 이 방법은 축삭 손상의 기전, 피질하 뇌졸중에 대한 신경세포의 반응, 그리고 뇌졸중의 급성기 및 회복기 동안 백질의 세포 요소들이 어떻게 반응하는지와 같은 뇌졸중 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뇌졸중 부위를 백질에 정밀하게 국한시킬 수 있으며, 매우 다양한 마우스 모델에 적용 가능하다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 백질의 양이 적어 뇌졸중 유도 부위가 잘못 지정될 수 있으므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 마우스의 각 계통에 따라 주입 각도나 정위 좌표, 또는 정위 고정 장치 설정을 미세하게 조정해야 할 수도 있습니다. 먼저 풀드 글라스 피펫(pulled glass pipette)을 진공 라인에 연결된 튜브에 고정하는 것부터 시작하십시오.

뽑아낸 끝부분을 L-Nio 용액 또는 형광 추적제가 포함된 L-Nio 용액에 넣습니다. 진공 장치를 작동시켜 피펫의 직경 0.5 millimeter 부분 중 최소 2 millimeter가 채워질 때까지 흡입합니다. 채워진 피펫을 한쪽에 둡니다.

그 다음, 마우스를 정위 고정 현미경이 장착된 정위 고정 장치에 배치합니다. 승인된 절차에 따라 마우스에 마취를 시행하고 수술 준비를 마친 후, 발가락 꼬집기(toe pinch)로 마취 깊이를 확인합니다. 이때 아무런 반응이 없어야 합니다.

다음으로, 주입 암(injection arm)을 36도로 조정합니다. 저용량 압력 주입 시스템의 원위단에 당긴 유리 피펫 홀더를 부착하고, 이를 주입 암에 연결합니다. 두개골을 노출시키기 위해 정중선 방향으로 1.5 cm 길이의 두피 절개를 수행한 후, 면봉으로 두개골 표면의 수분을 제거합니다.

그런 다음, 1~3배 배율의 실체 현미경으로 관찰하면서 마이크로포인트 도구를 사용하여 상단의 골막 조직을 제거합니다. 정밀 마커로 브레그마(bregma)를 표시합니다. 이어서 미세 팁 수술용 드릴 비트가 장착된 수술용 드릴을 사용하여, 브레그마의 후측에서 시작하여 정중선 왼쪽 전방으로 확장되는 2 mm 크기의 타원형 두개골 천공술을 시행합니다.

대뇌 피질을 관찰할 수 있도록 골편과 그 위의 연조직을 제거합니다. 멸균 식염수를 간헐적으로 떨어뜨려 피질 표면이 건조해지지 않게 유지합니다. 다음으로, 용액이 채워진 피펫을 주입기 암(injector arm)에 고정합니다.

피펫의 말단부를 브레그마(bregma)에 맞추고, 정위 좌표를 0으로 설정합니다. 표 1에 나열된 전후 및 내외측 좌표를 사용하여 피펫을 첫 번째 주입 지점으로 이동시킵니다. 그런 다음, 피펫을 피질 표면까지 전진시킨 후 배복측 측정값을 0으로 설정합니다.

피펫을 등-배쪽 좌표까지 천천히 내립니다. 정위 현미경의 배율이 3배로 설정되었는지, 보정된 레티클이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 공기-액체 메니스커스가 시상면으로 보일 수 있도록 각도가 조절된 피펫을 측면에서 관찰하십시오.

메니스커스가 피펫의 내벽과 외벽 모두 동일한 초점 평면에 나타나야 합니다. 이제 20 PSI로 설정된 국소 압력 주입 시스템을 사용하여 20밀리초 펄스로 L-Nio 100 nanoliters를 뇌에 주입하십시오. 전체 부피를 주입한 후, 피펫 경로를 통한 역류를 방지하기 위해 5분 동안 기다립니다.

그 후 피펫을 제거하고, 표 1에 제시된 두 번째와 세 번째 좌표 세트에서 주입 절차를 반복합니다. 마지막 주입이 끝나면 피펫을 제거하고 천공 부위를 메우기에 충분한 양의 본 왁스(bone wax)를 도포합니다. 마지막으로 두피 상처의 가장자리를 맞춘 후 피부 접착제로 고정합니다.

수술 후 진통제를 투여한 후, 동물을 깨끗한 케이지에 넣습니다. 수술 후 항생제를 음용수에 섞어 5일 동안 공급하거나, 희생 시점이 5일 미만인 경우 희생 시까지 공급합니다. 승인된 절차에 따라 마우스를 희생시키고 안락사시킨 후, 멸균 가위로 두개골 뒷부분을 열고 스파출러를 사용하여 상단의 두개골을 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 멸균된 4 mm 스패출러를 뇌 앞부분에 삽입하여 후각구와 시신경을 절단합니다. 그런 다음 뇌를 두개골에서 조심스럽게 들어 올려 차가운 해부 완충액에 넣습니다. 브레인 블록과 멸균 면도날을 사용하여 병변 부위가 포함된 2~3 mm 두께의 절편을 만들고, 이를 차가운 해부 완충액에 넣습니다.

해부 현미경 하에서, 주입된 반구의 운동 피질 아래에 위치한 백질을 확인합니다. 뇌졸중 발생 후 초기 간격에서는 fast green과 같은 일반적인 실험실 염료와 혼합된 L-Nio를 주입하여 뇌졸중 부위를 시각적으로 식별할 수 있습니다. 뇌졸중 발생 후 간격이 길어진 경우에는 국소 괴사와 수초 창백화를 통해 해당 부위를 시각적으로 식별할 수 있습니다.

뇌졸중이 발생한 부위를 확인한 후, 메스를 사용하여 백질 영역을 조심스럽게 절개합니다. 필요에 따라 상단의 피질과 하단의 선조체를 제거합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 내측 접근법을 사용하여 뇌졸중 7일 후의 축삭 손실 정도를 빨간색으로 표시된 신경 필라멘트 면역형광 표지로 나타내었습니다.

후방 각도 접근법을 사용하여, 외측 뇌실 바로 위의 백질 뇌졸중 병변을 대상으로 하며, IBA-1 면역 표지를 통해 검출된 강한 미세아교세포 반응성을 보여줍니다. 두 가지 성상교세포 중간필라멘트 마커인 빨간색의 vimentin과 초록색의 glial fibrillary acidic protein은 뇌졸중 후 백질 성상교세포의 형태학적 변화를 나타냅니다. 뇌졸중 유도 시 형광 덱스트란 아민을 함께 주입하면 뇌졸중으로 인해 축삭이 손상된 개별 뉴런을 식별할 수 있습니다.

대부분의 표지는 뇌졸중 부위에 인접한 일차 감각운동 피질의 5층 및 6층 뉴런 내 축삭에서 나타납니다. 이 이미지는 뇌졸중 발생 7일 후의 모습입니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 45분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 국소 백질 뇌졸중을 유도하는 방법과 뇌졸중 및 신경 회복에 관한 중요한 질문들에 답하는 데 유용한 다양한 후속 처리를 위해 뇌를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.