축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크
2016년 3월 17일
여기에서는 비가역적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제(L-Nio)의 국소 주입에 의해 쥐 백질에서 초점 스트로크를 생성하는 방법론을 제시합니다. 제시된 것은 두 가지 정위 변형, 역행 신경 세포 추적, 그리고 이 기술의 잠재적 응용을 확장하는 새로운 조직 라벨링 및 해부입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 쥐 백질 내에서 작은 뇌졸중을 정확하게 찾아 이 일반적인 형태의 피질하 백질 뇌졸중을 모델링하는 것입니다. 이 방법은 축삭 손상의 메커니즘, 피질하 뇌졸중에 대한 신경 반응, 뇌졸중의 급성 및 복구 단계 모두에서 백질의 세포 요소가 어떻게 반응하는지와 같은 뇌졸중 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뇌졸중을 백질에 정확하게 국한하는 데 사용할 수 있으며 다양한 쥐 마우스 모델과 함께 사용할 수 있다는 것입니다.
일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 소량의 백질로 인해 뇌졸중의 국소화가 잘못되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 마우스의 각 변형에 대한 주입 각도 또는 정위 좌표에 대한 약간의 조정 또는 정위 설정이 필요할 수 있습니다. 먼저 진공 라인에 부착된 튜브에 당겨진 유리 피펫을 부착하는 것으로 시작합니다.
당겨진 끝을 L-Nio 용액 또는 L-Nio plus 형광 추적기에 삽입합니다. 진공 청소를 시작하고 피펫의 0.5mm 직경 부분이 최소 2mm 채워질 때까지 흡입을 적용합니다. 채워진 피펫을 한쪽에 놓습니다.
그런 다음 마우스를 정위 현미경이 장착된 정위 장치에 넣습니다. 승인된 절차에 따라 마우스를 마취하고 수술을 준비한 후 발가락 꼬집기로 마취 깊이를 확인합니다. 응답이 없어야 합니다.
그런 다음 주입 암을 36도로 조정합니다. 당겨진 유리 피펫 홀더를 저용량 압력 주입 시스템의 말단부에 부착하고 주입 암에 부착합니다. 두피 정중선을 1.5cm 절개하여 두개골을 노출시킨 후 면봉으로 두개골 표면을 건조시킵니다.
그런 다음 정위 현미경을 통해 1-3X 배율로 보면서 마이크로포인트 도구를 사용하여 위에 있는 골막 조직을 제거합니다. 세밀한 포인트 마커로 브레그마를 표시합니다. 그런 다음 끝이 가는 수술용 드릴 비트가 장착된 수술용 드릴을 사용하여 브레그마에서 후방으로 시작하여 정중선 바로 왼쪽 전방으로 확장되는 2mm 타원형 개두술을 드릴로 뚫습니다.
대뇌 피질을 시각화할 수 있도록 뼈 조각과 그 위에 있는 연조직을 제거합니다. 멸균 식염수를 간헐적으로 한 방울 떨어뜨려 피질 표면을 촉촉하게 유지하십시오. 다음으로, 주입된 피펫을 주입 암에 부착합니다.
피펫의 말단부를 브레그마에 정렬하고 정위 좌표를 0으로 만듭니다. 표 1에 나열된 전방, 후방 및 내측 좌표를 사용하여 피펫을 첫 번째 주입 지점으로 전진시킵니다. 그런 다음 피펫을 피질 표면으로 전진시키고 등-복부 측정을 영점으로 만듭니다.
피펫을 등쪽-복부 좌표까지 천천히 내립니다. 정위 현미경 배율이 3X로 설정되어 있고 보정된 레티클을 명확하게 볼 수 있는지 확인합니다. 공기 유체 반월판이 시상면을 볼 수 있도록 측면에서 각진 피펫을 봅니다.
메니스커스는 피펫의 내벽과 외벽 모두의 동일한 초점면에 나타나야 합니다. 이제 20밀리초 펄스에 대해 20PSI로 설정된 로컬 압력 주입 시스템을 사용하여 100나노리터의 L-Nio를 뇌에 주입합니다. 총 부피를 주입한 후 파이펫 트랙으로 역류하는 것을 방지하기 위해 5분 정도 기다립니다.
그런 다음 피펫을 빼내고 표 1에 제공된 두 번째 및 세 번째 좌표 세트에서 주입 절차를 반복합니다. 최종 주입 후 피펫을 제거하고 개두술 부위를 채울 만큼 충분한 뼈 왁스를 놓습니다. 마지막으로 두피 상처의 가장자리를 대략적으로 만들고 피부 접착제로 묶습니다.
수술 후 진통제를 투여한 후 동물을 깨끗한 우리에 넣으십시오. 수술 후 항생제를 식수에 5일 동안 공급하거나 5일 미만인 경우 희생할 때까지 공급합니다. 승인된 절차에 따라 마우스를 희생하고 목을 베인 후 멸균 가위를 사용하여 두개골을 뒤쪽으로 연 다음 주걱을 사용하여 위에 놓인 두개골을 부드럽게 제거합니다.
다음으로, 뇌 앞쪽에 멸균된 4mm 주걱을 삽입하여 후각구와 시신경을 절단합니다. 그런 다음 칼바륨에서 뇌를 부드럽게 들어 올려 얼음처럼 차가운 해부 완충액에 넣습니다. 뇌 블록과 멸균 면도날을 사용하여 해당 부위가 포함된 2-3mm 조각을 자르고 냉간 해부 완충액에 넣습니다.
해부 현미경으로 주입된 반구의 운동 피질 아래에 있는 백질을 확인합니다. 뇌졸중 후 초기 간격에서 패스트 그린(fast green)과 같은 일반적인 실험실 염료와 혼합된 L-Nio를 주입하면 뇌졸중을 육안으로 식별할 수 있습니다. 뇌졸중 후 간격이 더 길어지면 이 부위는 국소 괴사와 수초 창백함에 의해 시각적으로 식별될 수 있습니다.
확인이 완료되면 메스를 사용하여 뇌졸중이 포함된 백질 영역을 조심스럽게 절개합니다. 원하는 대로 위에 있는 피질과 밑에 있는 선조체를 제거합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 빨간색으로 표시된 신경 필라멘트에 대한 면역형광 표지는 내측 접근법을 사용하여 뇌졸중 후 7일 후 축삭 손실의 정도를 보여줍니다.
후방 각도 접근법을 사용하면 백질 뇌졸중 병변이 외측 심실 바로 위를 표적으로 하며 IBA-1에 대한 면역 표지에 의해 감지된 바와 같이 강력한 미세아교세포 반응을 보입니다. 빨간색으로 표시된 두 개의 성상세포 중간 필라멘트 마커인 비멘틴(vimentin)과 녹색으로 표시된 신경교섬유산성 단백질(glial fibrillary acidic protein)은 뇌졸중 후 백질 성상세포의 형태 변화를 보여줍니다. 뇌졸중 유도 시 형광 덱스트란 아민을 동시 주입하면 뇌졸중으로 손상된 축삭돌기가 있는 개별 뉴런을 식별할 수 있습니다.
대부분의 표지는 뇌졸중 위에 있는 1차 감각 운동 피질의 5층 및 6층 뉴런 내의 축삭에서 발생합니다. 이 이미지는 뇌졸중 후 7일을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 45분 안에 완료할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 국소 백질 뇌졸중을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 뇌졸중 및 신경 복구에 대한 중요한 질문에 답하는 데 유용한 다양한 다운스트림 처리를 위해 뇌를 준비해야 합니다.
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개요
본 논문에서는 L-Nio라는 돌이킬 수 없는 eNOS 억제제를 국소 주입하여 murine 백질에 focal stroke를 유도하는 방법론을 제시합니다. 이 기술은 stereotactic 변형 및 fresh tissue labeling을 포함하여 stroke 연구에서의 응용을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- Stroke 연구
- Murine 모델
배경
- Subcortical stroke 모델에서 백질의 focal stroke는 흔합니다.
- Axonal 손상 및 neuronal 반응을 이해하는 것은 stroke 연구에 매우 중요합니다.
- Stroke의 정확한 국소화는 실험 결과를 개선할 수 있습니다.
- Mouse strain의 변형은 기술 조정이 필요할 수 있습니다.
연구 목적
- Mice에서 subcortical 백질 stroke를 정확하게 모델링합니다.
- Axonal 손상 및 neuronal 반응의 메커니즘을 조사합니다.
- Stroke의 급성 및 repair 단계 동안의 세포 반응을 탐구합니다.
사용된 방법
- Stereotactic apparatus를 사용하여 L-Nio를 주입합니다.
- Stroke 유도를 위한 mouse 준비 및 surgical procedures.
- 분석을 위한 뇌 조직 절단 및 labeling.
- Axonal 손실 및 microglial reactivity를 평가하기 위한 Immunofluorescent labeling.
주요 결과
- Murine 백질에서 stroke lesion의 성공적인 국소화.
- Stroke 후 axonal 손상 및 microglial 활성화 확인.
- 형광 tracer를 사용한 stroke의 시각적 확인.
- Stroke에 대한 반응으로 인한 astrocytic 변화의 시연.
결론
- 이 기술은 백질 stroke의 정확한 모델링을 가능하게 합니다.
- Stroke 손상의 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 향후 응용은 Stroke 회복 과정에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Modeling focal white matter stroke in mice addresses a critical gap in preclinical stroke research, enabling mechanistic de-risking of axonal degeneration pathways. This model supports target validation by providing a disease-relevant system to study neuroinflammatory and repair responses relevant to vascular dementia and silent infarct burden. Precise lesion localization enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability in downstream assay readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axonal injury mechanisms in white matter pathology.
- Operational Value: Provides a murine-compatible platform for functional target validation using established neurobiological tools.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by modeling silent infarct contributions to vascular dementia progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histological endpoints such as axonal loss and microglial reactivity for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated tissue sections for reproducible immunofluorescence and tracer-based analyses.
- Scientific Value: Enables screening readiness through focal lesion induction compatible with retrograde neuronal tracing and fresh tissue labeling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling subcortical white matter stroke contributing to vascular dementia.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via standardized stereotactic delivery and tissue processing.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking lesion location to cellular response profiles in acute and repair phases.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of white matter-specific stroke mechanisms prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification through targeted lesion induction in murine white matter tracts.
- Screening: Delivers assay-ready tissue with quantifiable outputs such as IBA-1+ microglial activation and axonal filament loss.
- Analytics: Provides measurable dependent variables including fluorescence intensity of neural filament and astrocytic markers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through modeling of stroke phases relevant to vascular cognitive impairment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable stereotactic framework adaptable across mouse strains and tracer combinations for longitudinal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in white matter injury models.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinates, injection parameters, and tissue dissection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in axonal degeneration pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by modeling a highly prevalent yet understudied stroke subtype linked to dementia risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and murine neuroanatomy for accurate white matter targeting.
- Dependent on calibrated pressure injection systems and sterile microsurgical tools for consistent lesion induction.
- Necessitates cross-team standardization of histological staining and imaging protocols for multi-site reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the model across different murine genetic backgrounds or comorbid conditions.
- Practical limitations include small target size requiring strain-specific coordinate adjustments and meticulous postoperative care to ensure survival.
