Name: 축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 배우세요 쥐 백질에 국소 뇌졸중을 정확히 유도하는 스테레오택틱 주입 기법을. L-Nio를 사용하여 축삭 손상과 미세아교세포 반응을 연구하고 뇌졸중 회복 메커니즘을 규명하는 데 활용할 수 있습니다.

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SN 및 MDD는 NIH K08 NS083740과 신경의 UCLA 부서의 지원을 받았다. AJG는 박사 미리 암과 셀던 아델슨 G. 의학 연구 재단과 래리 L. Hillblom 재단의 지원을 인정합니다. KLN은 기꺼이 미국 심장 협회 14BFSC17760005 ASA-Bugher 뇌졸중 센터에서 지원을 인정합니다. ILL, EGS와 STC는 NIH R01 NS071481에 의해 지원되었다. JDH는 NIH K08 NS083740의 지원을 인정합니다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 캘리포니아 로스 앤젤레스의 동물 보호 및 사용위원회의 대학 승인 절차에 따라 수행되었다. 참고 : 대상 쥐 인구를 식별하여 시작합니다. 이전 연구에서 유일한 수컷 야생형 C57 / BL6 마우스는 다양하지만 유전자 또는 녹아웃 마우스는 또한 사용될 수 있으며, 사용되어왔다. 정위 좌표가 C57 / BL6 해부학을 기반으로합니다. 각 사용자가 처음에 흰색 문제에 스트로크의 현지화를 확인하는 것이 좋습니다. 1. 흰색 물질 스트로크 유도 - 내측 각도 접근 <ol><li> 선단 직경이 15 내지 25 ㎛의 (11) 사이가되도록 0.5 mm 모세관을 이용하여 뽑아 유리 피펫을 제조함으로써 시작한다. </li><li> 멸균 0.9 % 생리 식염수에 27.4 ㎎ / ㎖ (130 μM)에서 - L-니오의 멸균 10 μL 나누어지는 ((1) -iminoethyl-L - 오르니 틴 염산 N (5))를 준비합니다. </li><li> 인출 된 유리 피펫을 사전 작성유리 피펫을 부착하여 L-니오 (2-5 μL)의 작은 부피를 진공 라인에 접속 튜빙. 벤치 위에 피펫 평면을 배치하고, L-니오 용액에 끌어 끝을 삽입합니다. <ol><li> 피펫의 0.5 mm 부의 최소 2 mm가 채워질 때까지 진공을 적용한다. 진공을 끄고 피펫을 철회. 단계 1.12까지 따로 보관 해 둡니다. </li></ol></li><li> 유도 챔버에 마우스를 위치시키고 표준 32 % 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취 유도 증발기를 통해 유동 (5 L / 분 5 L / 분으로 산소를 0.5 L / 분으로 흡입 N 2) 1 분 또는 깊이 anesthesized까지. 정위 현미경이 장착 된 정위 장치에 마우스를 전송합니다. 기화기를 통해 흘러 32 % 이소 플루 란을 사용하여 유지 보수 마취를 제공하고 코 콘 (2 L / 분 5 L / 분의 산소와 0.5 L / min의 N 2 흡입). 발가락 핀치와 마취의 깊이를 확인합니다. </li><li> 36 °에 주입 팔을 조정합니다. </li><li> AffiXA 낮은 볼륨 압력 분사 시스템의 말단에 유리 피펫 홀더를 뽑아 정위 설정의 분사 아암에 부착. </li><li> 코트 두 눈을 통해 석유 젤리와 장소 인공 눈물 연고와 마취 된 동물의 수염. 머리 위에 5~10cm 개방과 동물의 머리 위에 멸균 드레이프를 배치하여 무균 수술 부위를 준비합니다. 두개골을 덮는 털을 면도하여 aspetic 수술 표면을 준비합니다. 교대 betadine 70 % 알코올 면봉으로 두피를 청소합니다. </li><li> 두개골 표면을 노출 멸균 미세 가위로 1.5 cm 중간 선 두피 절개를합니다. 멸균 면봉으로 두개골을 건조하고 1-3X 확대에 정위 현미경을 사용하여, 멸균 마이크로 포인트 도구를 사용하여 상부 골막 조직을 제거합니다. </li><li> 미세한 포인트 마커를 이용하여 기준점으로 브레 그마 표시. </li><li> 멸균 미세 STIP 외과 드릴 비트를 사용하여 2mm ellipitical 개두술을 드릴0; 브레 그마에서 후방 시작하여 전방 단지 중간 선 왼쪽으로 연장. 뼈 조각을 제거하고 대뇌 피질을 가시화 할 수 있도록 부드러운 조직 위에 놓인. </li><li> 간헐적으로 멸균 식염수 방울을 적용하여 수술 필드와 촉촉한 대뇌 피질의 표면을 유지합니다. </li><li> 정위 장치의 인젝터 팔에 뽑아 유리 피펫을 붙입니다. 브레 그마와 피펫의 선단을 맞추고 정위 좌표를 제로. </li><li> 첫 번째 전방 / 후방 (A / P)에 피펫을 발전 / 표 1에서 제공하는 좌표 (M / L) 측면을 내측. </li><li> 대뇌 피질의 표면에 피펫을 발전 지느러미 / 복부 (D / V) 측정을 제로. </li><li> 천천히 최초의 D / V 표 1에 좌표에 도달 할 때까지 뇌에 피펫을 전달합니다. </li><li> 뇌에 L-니오 100 NL 주입 환류 방지 5 분을 기다린 20 msec의 펄스를 20 psi에서 설정된 낮은 압력 볼륨 주입 시스템을 사용하여피펫 트랙입니다. <ol><li> 정위 현미경의 접안 렌즈와 3 배의 배율에서 교정 레티클을 사용합니다. </li><li> 따라서, 좌표들의 각각의 세트에 대한 뽑아 유리 피펫으로부터 (100 NL에 대응하는 0.5 mm 직경 피펫 0.5 mm 길이) 0.100 mm (3)의 총 변위. 십자선을 사용하여 측정하고 각각의 사용 확대 및 규모에 따라 달라집니다 설정 때문에 표준화. </li><li> 공기 유체 메 니스 커스가 시상을 갖도록 각 분사시 정확한 량 측정을 위해, 측으로부터 현미경으로 각진 피펫 접근. 메 니스 커스는 피펫의 내부 및 외부 벽 모두 같은 초점면에 표시됩니다. </li></ol></li><li> 천천히 피펫을 철회하고 단계를 반복 1.13-1.16.3 표 1에서 제공하는 좌표의 두 번째와 세 번째 세트에서. </li><li> 최종 주입 후, 피펫을 제거하고 개두술 사이트를 채우기에 충분한 뼈 왁스를 배치합니다. 에이두피 상처의 가장자리 pproximate 및 피부 접착제로 결합한다. </li><li> 두피 절개와 연관된 로컬 통증을 방지하는 방지 멸균 30 G 바늘을 이용하여 상처 마진으로 0.5 %에 마르케 0.1㎖를 주입한다. </li><li> 5 일간 마시는 물에 주택 공급 수술 후 항생제 동물 (0.48 ㎎ / ㎖ 트리 메소 프림 - 설파, 0.5 ㎎ / ㎖ 레보플록사신)를 돌려줍니다. </li></ol> 2. 흰색 물질 스트로크 유도 - 후방 각도 접근 <ol><li> 전치부 배향 45 도로 설정 정위의​​ 분사 암을 조정 제외한 중간 각도 접근 프로토콜과 1.1-1.12 단계를 수행한다. </li><li> 첫 번째 A / P에 피펫을 사전 및 M / L 표 2에 제공 좌표. </li><li> 전체 나머지 단계 측면 각도 접근 프로토콜과 같은 1.14-1.20. </li></ol> 3. 역행의 연결 라벨 <ol><li> 10 멸균 준비0.9 % 생리 식염수에 54.8 ㎎ / ㎖에서 L-니오의 μL 나누어지는. </li><li> 0.9 % 생리 식염수에 20 % Fluororuby (20 % 바이오틴 덱스 트란 아민 또는 2 % Fluorogold)의 멸균 나누어지는을 준비합니다. </li><li> 27.4 ㎎ / ㎖ L-니오 10 % Fluororuby의 최종 농도 1 : 함께 1 희석. </li><li> 단계 1.3-1.23에 위와 같이 스트로크 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 이전 8 설명한대로 관류 고정, 냉동 절편 및 현미경으로 조직 섹션에서 기본적으로 형광 추적을 시각화합니다. </li></ol> 면역 형광 4. 조직 처리 <ol><li> 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용 또는 로컬 IACUC를 통해 마우스 절차를 승인 안락사. </li><li> 각도 가위를 사용하여 흉강을 열고 좌심실로 23 G 나비 바늘을 삽입합니다. </li><li> 관류 액에 대한 유출을 추적 할 수 있도록 미세 가위를 사용하여 우심방에있는 작은 상처를 놓습니다. </li><li> 로 transcardially RT에서 10 ㎖ / 분의 속도로 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 30 내지 40 ml로 이어 차가운 인산 완충 식염수 용액으로 관류 30-40. </li><li> 마우스를 목을 벨과 후방 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 두뇌를 제거하고 부드럽게 24 시간 동안 차가운 4 % PFA로 뇌를 주걱으로 위에있는 두개골을 제거 배치하고 48 시간 동안 PBS의 30 % 자당로 전송 . </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 마흔 미크론 부동 섹션을 준비하고 이전에 6-8 바와 같이 항체 처리를 수행합니다. 이 연구에서, 아래의 항체를 사용하여 토끼 항 - 신경 미세 섬유 (200) (1 : 500 희석); 토끼 항 멘틴 (1 : 500); 염소 항 GFAP (1 : 500); 토끼 항 년 Iba-1 (1 : 1000). </li></ol> 단백질이나 RNA 분석 5. 조직 처리 <ol><li> 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용을 통해 안락사 또는 로컬 IACUC는 절차를 승인했다. </li><li> 목을 베다마우스 뒤쪽 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 뇌를 제거하고 부드럽게 주걱으로 위에있는 두개골을 제거합니다. </li><li> 후각 망울과 시신경을 절단하는 뇌의 전면에 멸균 4mm 주걱을 삽입합니다. 조심스럽게 두 개관에서 뇌를 들어 올려 (1 배 행크의 균형 소금 솔루션, 25 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.4, 35 mM의 포도당, 4 mM의 중탄산 나트륨, 0.01 ㎎ / ㎖ 시클로 헥시 미드) 얼음처럼 차가운 해부 버퍼에 배치합니다. </li><li> 뇌 블록과 멸균 새 면도날을 사용하여 차가운 해부 버퍼 스트로크와 장소를 포함 2-3mm 석판을 준비합니다. </li><li> 해부 현미경에서 주입 된 반구의 백질 기본 운동 피질을 식별합니다. 이상 졸중 간격으로 상기 영역은 시각적 초점 괴사 미엘린 창백 의해 식별 될 수있다. (이전 후 뇌졸중 간격, 10 %의 1 μL와 혼합 L-니오의 주입에 빠른 그린은 뇌졸중의 시각적 식별을 허용 할 수 있습니다 참고 : <strong&gt;도 4a). </li><li> 해부 현미경의지도와 신선한 메스를 사용에서 신중하게 빠른 그린 라벨 또는 조직 손실 중 하나에 의해 식별 스트로크를 포함하는 흰색 물질의 영역을 해부하다. 원하는대로 상부 피질 및 기본 줄무늬를 제거합니다. </li></ol>

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</ol>

피질 행정 이전 모델 번호 12-14 래트 및 마우스에서 내부 -6,15- 캡슐에 엔도 텔린 -1의 국소 주입, 피질 및 선조체 백질 포함 설명되었다. 작은 초점 스트로크의 최근 모델은 콜레스테롤 microemboli의 경동맥 (16)에 주입 한 번의 침투 세동맥 (17)의 photothrombotic 폐쇄를 활용하고있다. 이러한 모델은 각각 장단점 5를 모두 갖는다. 현재 기술 모델은 축삭 이상 손실, 수초 저하, 초점 괴사 코어와 최소이며, 7 세에 따라 상당히 빠른 회복을 보여 임상 적자를 포함하여 인간의 열공 경색을 모방 특성을 가지고 있습니다 병변을 생산하고 있습니다. 쥐의 흰색 물질을 표적으로하는 것은 기계적인 연구를 지원할 수있는 유전자 조작의 다양한 있습니다. 임계프로토콜의 단계에서는 정확한 정위 좌표를 이용 포함한다. 쥐의 흰색 물질의 크기가 ...

피질하 백질에 영향을 미치는 뇌졸중은 흔한 임상 실체로, 미국에서 매년 임상 뇌졸중의 최대 25%를 차지합니다 1. 백질에 대한 허혈성 손상은 또한 상당히 높은 비율로 조용히 발생하며 혈관성 치매의 발병에 기여합니다 2,3. 현재 이러한 형태의 뇌허혈을 앓고 있는 환자들은 치료법이 거의 없습니다. 이 질병의 임상적 중요성에도 불구하고, 임상적으로 타당한 동물 모델은 거의 존재하지 않는다 4,5. 
이 프로토콜의 목표는 쥐 백질 내에서 국소 허혈성 병변을 생성하는 것입니다. 이 인간 질병의 쥐 모델을 통해 뇌졸중에 대한 축삭 손상 반응과 백질의 세포 요소, 즉 축삭돌기아교세포와 성상세포가 축삭돌기에 어떻게 반응하고 뇌졸중 후 복구되는지에 대한 구체적인 연구를 할 수 있습니다.
이전 보고서에서는 여기에 설명된 것과 유사한 엔도텔린-1(ET-1) 6을 사용하여 피질하 백질 뇌졸중 모델을 설명했습니다. 실험 프로토콜에 대한 몇 가지 주요 변경 사항이 이루어졌으므로 이 모델의 잠재적 용도가 확장되었습니다 7,8. 이 프로토콜은 마우스 뇌 백질 내에서 초점 스트로크를 생성하기 위한 신뢰할 수 있고 수정 가능한 전략을 제공합니다. 
이 모델의 주요 장점은 화학적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제 N(5)-(1)-이미노에틸-L-오르니틴 HCl(L-Nio) 9를 사용하는 것인데, 이는 엔도텔린-1을 사용하는 모델의 합병증이었던 백질의 세포 요소에 대한 알려진 파라크린 효과가 없습니다 10. 또한, 마우스에서 백질의 정위 표적화는 다양한 형질전환 또는 녹아웃 균주를 사용할 수 있게 하여 뇌 백질에 대한 뇌졸중의 영향을 결정하는 데 사용할 수 있는 도구를 크게 확장합니다. 여기에서는 이 기술에 대한 두 가지 변형을 설명하고 뇌졸중 후 축삭 및 백질 손상 및 복구에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있는 몇 가지 추가 변형을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>L-N5-(1-이미노에틸)오르니틴, 디하이드로클로라이드</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>피닉스 제약, Inc.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>모세관</td><td>세계 정밀 기기</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker 계측</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>입체 설정</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>KOPF</td><td>모델 720</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경 SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>파인 사이언티픽 툴</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>포셉스</td><td>하버드 장치</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>곡선 포위</td><td>하버드 장치</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>무딘 해부 도구</td><td>파인 사이언티픽 툴</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>드레멜</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>드릴 비트</td><td>파인 과학 도구</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim-Sulfamethaxole</td><td>STI 약국</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>Fluororuby</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica CM3050 S</td><td></td><td></td>14047033518</tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23G 나비 바늘</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>시클로 헥사 미드</td><td>시그마</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

뇌졸중 임상 스트로크 프리젠 테이션의 최대 25 %를 백질 계정에 영향을주지는 5 ~ 10 배 더 클 수있다 속도에서 자동으로 발생하고 혈관성 치매의 발전에 크게 기여하고있다. 초점 백질 행정의 몇 가지 모델이 존재하고 적절한 모델이 부족 뇌졸중 이러한 유형의 후 부상 응답 및 수리에 관련된 neurobiologic 메커니즘의 이해를 방해하고있다. 다른 피질 뇌졸중 모델의 주요 제한은 국소 적 백질에 경색을 제한하지 않거나 주로 비 뮤린 종 검증되었다는 것이다. 이것은 백질 행정 신경 생물학을 연구 쥐 연구 도구의 다양한 적용 할 수있는 능력을 제한한다. 여기에서 우리는 돌이킬 수없는 eNOS의 억제제의 지방 주입을 사용하여 쥐의 흰색 문제에 초점 뇌졸중의 안정적인 생산을위한 방법론을 제시한다. 우리는 또한이 독특한 정위를 포함하는 일반적인 프로토콜에 몇 가지 변화를 제시변화, 크게이 기술의 응용 가능성을 확장 역행의 연결을 추적뿐만 아니라 신선한 조직 라벨 및 해부. 여러 방법이 뇌졸중이 일반적이고 파악 하였다 형태의 neurobiologic 효과를 분석하는 이러한 변화 할 수 있습니다.

제시된 모델을 사용하여, 백질 기본 앞다리 감각 피질 확실 타겟팅 될 수있다. 일반적으로 인간의 열공 경색에서 알 수 있듯이이 화학적으로 유도 된 뇌졸중 모델은 초점 축삭과 수초 손실, astrocytosis 및 microgliosis (그림 1)을 생성한다. 세 주사를 이용하여 임상 적으로 유용한 모델 앞다리 모터 태스크 7에 이른 장애 및 뇌 조직 경험 작지만 상당한 부분 확립 면역 조직 화학, 면역 형광 및 생화학 기술이 양적 레벨에서 가능하고 신뢰할 수 있다는 허혈. 뇌졸중 유도 후 이른 시점 (HR)에서 축삭 분자 조직 변경 (도 2)을 검출 할 수있다. 칠일에서, 스트로크는 축삭 손실 (그림 1a)의 외접 영역의 성숙을 완료합니다. 우리의 손,이 방법은 초점 백질 병변 approxima을 생산tely 800 μm의 수평 직경과 뇌량의 전후방 축 방향...

여기에서는 비가역적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제(L-Nio)의 국소 주입에 의해 쥐 백질에서 초점 스트로크를 생성하는 방법론을 제시합니다. 제시된 것은 두 가지 정위 변형, 역행 신경 세포 추적, 그리고 이 기술의 잠재적 응용을 확장하는 새로운 조직 라벨링 및 해부입니다.

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 백질 내의 작은 뇌졸중 부위를 정확하게 찾아내어, 이러한 흔한 형태의 피질하 백질 뇌졸중을 모델링하는 것입니다. 이 방법은 축삭 손상의 기전, 피질하 뇌졸중에 대한 신경세포의 반응, 그리고 뇌졸중의 급성기 및 회복기 동안 백질의 세포 요소들이 어떻게 반응하는지와 같은 뇌졸중 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뇌졸중 부위를 백질에 정밀하게 국한시킬 수 있으며, 매우 다양한 마우스 모델에 적용 가능하다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 백질의 양이 적어 뇌졸중 유도 부위가 잘못 지정될 수 있으므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 마우스의 각 계통에 따라 주입 각도나 정위 좌표, 또는 정위 고정 장치 설정을 미세하게 조정해야 할 수도 있습니다. 먼저 풀드 글라스 피펫(pulled glass pipette)을 진공 라인에 연결된 튜브에 고정하는 것부터 시작하십시오.뽑아낸 끝부분을 L-Nio 용액 또는 형광 추적제가 포함된 L-Nio 용액에 넣습니다. 진공 장치를 작동시켜 피펫의 직경 0.5 millimeter 부분 중 최소 2 millimeter가 채워질 때까지 흡입합니다. 채워진 피펫을 한쪽에 둡니다.그 다음, 마우스를 정위 고정 현미경이 장착된 정위 고정 장치에 배치합니다. 승인된 절차에 따라 마우스에 마취를 시행하고 수술 준비를 마친 후, 발가락 꼬집기(toe pinch)로 마취 깊이를 확인합니다. 이때 아무런 반응이 없어야 합니다.다음으로, 주입 암(injection arm)을 36도로 조정합니다. 저용량 압력 주입 시스템의 원위단에 당긴 유리 피펫 홀더를 부착하고, 이를 주입 암에 연결합니다. 두개골을 노출시키기 위해 정중선 방향으로 1.5 cm 길이의 두피 절개를 수행한 후, 면봉으로 두개골 표면의 수분을 제거합니다.그런 다음, 1~3배 배율의 실체 현미경으로 관찰하면서 마이크로포인트 도구를 사용하여 상단의 골막 조직을 제거합니다. 정밀 마커로 브레그마(bregma)를 표시합니다. 이어서 미세 팁 수술용 드릴 비트가 장착된 수술용 드릴을 사용하여, 브레그마의 후측에서 시작하여 정중선 왼쪽 전방으로 확장되는 2 mm 크기의 타원형 두개골 천공술을 시행합니다.대뇌 피질을 관찰할 수 있도록 골편과 그 위의 연조직을 제거합니다. 멸균 식염수를 간헐적으로 떨어뜨려 피질 표면이 건조해지지 않게 유지합니다. 다음으로, 용액이 채워진 피펫을 주입기 암(injector arm)에 고정합니다.피펫의 말단부를 브레그마(bregma)에 맞추고, 정위 좌표를 0으로 설정합니다. 표 1에 나열된 전후 및 내외측 좌표를 사용하여 피펫을 첫 번째 주입 지점으로 이동시킵니다. 그런 다음, 피펫을 피질 표면까지 전진시킨 후 배복측 측정값을 0으로 설정합니다.피펫을 등-배쪽 좌표까지 천천히 내립니다. 정위 현미경의 배율이 3배로 설정되었는지, 보정된 레티클이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 공기-액체 메니스커스가 시상면으로 보일 수 있도록 각도가 조절된 피펫을 측면에서 관찰하십시오.메니스커스가 피펫의 내벽과 외벽 모두 동일한 초점 평면에 나타나야 합니다. 이제 20 PSI로 설정된 국소 압력 주입 시스템을 사용하여 20밀리초 펄스로 L-Nio 100 nanoliters를 뇌에 주입하십시오. 전체 부피를 주입한 후, 피펫 경로를 통한 역류를 방지하기 위해 5분 동안 기다립니다.그 후 피펫을 제거하고, 표 1에 제시된 두 번째와 세 번째 좌표 세트에서 주입 절차를 반복합니다. 마지막 주입이 끝나면 피펫을 제거하고 천공 부위를 메우기에 충분한 양의 본 왁스(bone wax)를 도포합니다. 마지막으로 두피 상처의 가장자리를 맞춘 후 피부 접착제로 고정합니다.수술 후 진통제를 투여한 후, 동물을 깨끗한 케이지에 넣습니다. 수술 후 항생제를 음용수에 섞어 5일 동안 공급하거나, 희생 시점이 5일 미만인 경우 희생 시까지 공급합니다. 승인된 절차에 따라 마우스를 희생시키고 안락사시킨 후, 멸균 가위로 두개골 뒷부분을 열고 스파출러를 사용하여 상단의 두개골을 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 멸균된 4 mm 스패출러를 뇌 앞부분에 삽입하여 후각구와 시신경을 절단합니다. 그런 다음 뇌를 두개골에서 조심스럽게 들어 올려 차가운 해부 완충액에 넣습니다. 브레인 블록과 멸균 면도날을 사용하여 병변 부위가 포함된 2~3 mm 두께의 절편을 만들고, 이를 차가운 해부 완충액에 넣습니다.해부 현미경 하에서, 주입된 반구의 운동 피질 아래에 위치한 백질을 확인합니다. 뇌졸중 발생 후 초기 간격에서는 fast green과 같은 일반적인 실험실 염료와 혼합된 L-Nio를 주입하여 뇌졸중 부위를 시각적으로 식별할 수 있습니다. 뇌졸중 발생 후 간격이 길어진 경우에는 국소 괴사와 수초 창백화를 통해 해당 부위를 시각적으로 식별할 수 있습니다.뇌졸중이 발생한 부위를 확인한 후, 메스를 사용하여 백질 영역을 조심스럽게 절개합니다. 필요에 따라 상단의 피질과 하단의 선조체를 제거합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 내측 접근법을 사용하여 뇌졸중 7일 후의 축삭 손실 정도를 빨간색으로 표시된 신경 필라멘트 면역형광 표지로 나타내었습니다.후방 각도 접근법을 사용하여, 외측 뇌실 바로 위의 백질 뇌졸중 병변을 대상으로 하며, IBA-1 면역 표지를 통해 검출된 강한 미세아교세포 반응성을 보여줍니다. 두 가지 성상교세포 중간필라멘트 마커인 빨간색의 vimentin과 초록색의 glial fibrillary acidic protein은 뇌졸중 후 백질 성상교세포의 형태학적 변화를 나타냅니다. 뇌졸중 유도 시 형광 덱스트란 아민을 함께 주입하면 뇌졸중으로 인해 축삭이 손상된 개별 뉴런을 식별할 수 있습니다.대부분의 표지는 뇌졸중 부위에 인접한 일차 감각운동 피질의 5층 및 6층 뉴런 내 축삭에서 나타납니다. 이 이미지는 뇌졸중 발생 7일 후의 모습입니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 45분 이내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 국소 백질 뇌졸중을 유도하는 방법과 뇌졸중 및 신경 회복에 관한 중요한 질문들에 답하는 데 유용한 다양한 후속 처리를 위해 뇌를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 백질 내의 표적 뇌 좌표에 산화질소 억제제를 주입하여 마취된 마우스에서 백질 뇌졸중을 유도하는 정확한 기술을 보여줍니다. 이는 혈관 수축과 혈액 공급 억제로 이어져 신경 손상과 뇌졸중을 유발합니다.

Inducing White Matter stroke in a Murine Model Using a Nitric Oxide Inhibitor(산화질소 억제제를 사용한 쥐 모델에서 백질 뇌졸중 유도)

중대 뇌동맥 폐색 (MCAO)의 다양한 쥐 모델은 널리 실험 뇌 연구에 사용됩니다. 여기서 우리는 인간의 허혈성 뇌졸중의 대다수에 의해 부과 된 손상에 해당하는 크기의 일관성있는 대뇌 피질의 경색을 생산 두개 영구 원심 MCAO의 모델을 보여줍니다.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑​​ 후 빛의 낮은 강도와​​ 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다.

Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

말단 중간 대뇌 동맥 분기 (MCAO)의 수술 폐색 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용하는 모델입니다. 이 논문은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하는 측의 두개 창에 삽입, 결합 영구 MCAO의 기본적인 기술을 설명한다.

측면 만성 두개골 창 준비 활성화 생체 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

여기에 설명된 광혈증 뇌졸중 모델은 감광성 염료투여 후 레이저 조명을 이용하여 영구 미생물 폐색을 유도하여 손상되지 않은 두개골을 통해 뇌졸중이 생성된다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

이 프로토콜은 중간 크기의 경색과 우수한 생존율을 가진 독특한 마우스 스트로크 모델을 보여줍니다. 이 모델을 통해 전임상 뇌졸중 연구자는 허혈 기간을 연장하고, 노령 마우스를 사용하고, 장기적인 기능적 결과를 평가할 수 있습니다.

늙은 쥐의 뇌졸중 결과를 연구하기 위해 수정된 경두개 중뇌동맥 폐색 모델

이 프로토콜은 피질 허혈성 뇌졸중 후 Neurod1의 바이러스 매개 이소성 발현을 설명합니다. Neurod1은 (1) 뇌졸중 후 아급성기(7일) 동안 야생형 마우스에서 Cre-Flex AAV 시스템을 사용하여 전달되고 (2) 뇌졸중 후 만성기(21일) 동안 조건부 리포터 마우스에서 단일 AAV 벡터를 사용하여 전달됩니다.

허혈성 뇌졸중 후 아급성 및 만성 시기에 형질도입된 세포에서 Neurod1의 이소성 발현을 조사하기 위한 AAV 시스템 및 마우스 모델

혈관 인지 장애 및 치매에 대한 마우스 모델을 만들기 위해 비대칭 양측 총경동맥 협착증의 바늘 방법이 제안됩니다. 이는 이전에 확립된 모델에 비해 장기적인 결과를 가져오며 실시간 MRI와 호환됩니다. 절차를 보여주는 시각적 표현은 수술을 마스터하기 위한 지침을 제공합니다.

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis(바늘 유도 비대칭 양측 공통 경동맥 협착증에 기반한 혈관 인지 장애 및 치매에 대한 마우스 모델)

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

배우세요 쥐 백질에 국소 뇌졸중을 정확히 유도하는 스테레오택틱 주입 기법을. L-Nio를 사용하여 축삭 손상과 미세아교세포 반응을 연구하고 뇌졸중 회복 메커니즘을 규명하는 데 활용할 수 있습니다.

축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

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