2015년 11월 26일
이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.
이 레이저 캡처 미세 박리 프로토콜의 전반적인 목표는 다운스트림 유전자 발현 분석을 위해 이질적인 동결 전립선 조직에서 전립선 상피 세포 유형의 순수 집단에서 전체 RNA를 분리하는 것입니다. 이 방법은 환자 표본을 분석하고 양성 및 질병 상피 보철 조직 샘플 또는 임상 시험 샘플에서 RNA 발현이 어떻게 다른지와 같은 전립선암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 레이저 캡처 미세 해부를 통해 얼어붙은 전립선 조직에서 상피 또는 str 세포의 동질적인 집단을 RNA로 분리할 수 있다는 것입니다.
일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 RNA를 유지하는 데 어떤 단계가 중요한지 모르기 때문에 고품질 RNA를 획득하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 자유로운 조건: 절차에 필요한 모든 시약과 도구를 수집하는 것으로 시작합니다. 얼어붙은 전립선 조직이 30분 동안 저온 유지 장치 내에서 평형을 이루도록 한 후, 카세트 바닥에 장착 매체를 분출하고 식힌 집게를 사용하여 조직을 빠르게 장착합니다.
카세트를 저온 유지 장치의 냉각기에 5분 동안 넣어 장착 매체를 설정합니다. 설정이 완료되면 얼어붙은 매체를 척에 장착하고 장착된 조직을 조심스럽게 누릅니다. 아래쪽이 위로 향하게 합니다.
준비물을 5분 동안 굳힙니다. 척을 홀더에 넣기 전에 핸들을 제자리에 잠그고 저온 유지 장치에 새 블레이드를 삽입하십시오. 손잡이의 잠금을 해제한 후 원하는 조직 노출에 도달할 때까지 샘플을 조심스럽게 전진시킵니다.
준비가 되면 저온 유지 장치를 5미크론으로 조정하고 하나 또는 두 개의 섹션을 자릅니다. 이 단면을 적혈구 및 어인 염색을 위해 충전된 유리 슬라이드에 놓습니다. 즉시 슬라이드를 차가운 100% 에탄올에 2분 동안 놓습니다.
이 시간이 지나면 슬라이드를 제거하고 실온에서 건조시킵니다. h 및 d 염색 슬라이드는 핵 질감을 더 잘 시각화할 수 있으며 병리학자가 관심 영역을 표시하는 데 사용해야 합니다. 다음으로 실온 펜 프레임을 놓습니다.
프레임 지지대에 밀어 넣고 저온 유지 장치를 10미크론으로 조정하고 단면을 만듭니다. 티슈 크기에 따라 각 슬라이드에 1개에서 4개의 섹션을 배치할 수 있습니다. 즉시 슬라이드를 차가운 100% 에탄올에 담그십시오.
2분 후에 슬라이드를 제거하고 나중에 분석할 수 있도록 냉동실에 보관하십시오. 레이저 캡처 현미해부 당일, RNA가 없는 영역에서 작동하는 냉동고에서 펜 프레임 슬라이드를 회수합니다. 슬라이드를 90% 에탄올에 2분 동안 부드럽게 담근 다음 75% 에탄올에 2분 동안 담가 수분을 공급합니다.
수분이 공급되면 5초에서 30초 동안 슬라이드를 0.5%toine blue에 부드럽게 담궈 전립선 조직을 염색합니다. 슬라이드를 15초 동안 깊은 물에서 두 번 세척한 다음 30초에서 3분 동안 75% 에탄올을 세척하여 조직을 고정합니다. 마지막으로, 펜 프레임 슬라이드를 얼음 위의 RNA 자유 건조 용기로 옮깁니다.
절차를 시작하기 전에 슬라이드를 슬라이드 워머에 올려 15분 동안 말리십시오. 처리할 슬라이드만 건조시키고 나머지는 필요할 때까지 얼음에 보관하십시오. 다음 순서로 LCM 구성 요소를 켭니다.
현미경 출력, 레이저 키, 레이저 스위치, 그리고 컴퓨터. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 레이저 현미해부 소프트웨어를 실행합니다. 현미경이 슬라이드와 수집 튜브를 로드하도록 합니다.
unload sample holder를 클릭하고 티슈가 아래를 향하도록 하여 슬라이드를 슬라이드 홀더에 로드합니다. 슬라이드 홀더를 현미경의 해당 슬롯에 삽입하고 계속을 클릭합니다. 그런 다음 unload collection tubes를 클릭합니다.
튜브에 라벨을 붙이고 튜브를 튜브 홀더에 로드하고 적절한 슬롯에 삽입합니다. 캡을 고정하고 35마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요.
컬렉션 캡이 로드되면 확인을 클릭합니다. 소프트웨어를 사용하여 홀더에서 슬라이드의 위치를 선택한 다음 수집 캡을 선택하여 표본을 수집합니다. 컴퓨터를 통해 슬라이드를 10배 배율로 시각화하고 초점을 맞춥니다.
소프트웨어를 사용하여 레이저를 선택하여 레이저를 보정합니다. 그런 다음 레이저를 선택하여 레이저의 출력 조리개와 속도를 보정하고 조정한 다음 제어합니다. 레이저가 조직을 완전히 절단할 때까지 계속 조정하십시오.
LCM을 받은 조직의 원하는 영역을 정확하게 해부하기 위해 8 x 11 h 및 e 병리학자 마크업을 시각적 가이드로 사용하여 보드 인증 병리학자가 일반적으로 수행하는 관심 영역을 간략하게 설명하는 것이 중요합니다. 소프트웨어의 형상 그리기 도구를 사용하여 보기에서 원하는 상피 영역을 경계하고 기질이 수집되지 않도록 합니다. 절단을 클릭하여 레이저를 시작합니다.
영역이 완전히 절단되지 않은 경우 이동 및 잘라내기 도구를 사용하여 수동으로 검토하십시오. 대물렌즈를 새로운 것으로 계속 이동 view슬라이드가 완전히 해부되거나 원하는 양의 조직이 수집될 때까지 레이저 절단을 반복합니다. 완료되면 수집 홀더에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 캡의 용해, 완충액 및 조직을 염두에 두고 캡을 닫습니다.
간단히 30초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 있는 액체와 조직을 수집합니다. 섭씨 42도에서 30분 동안 샘플을 배양하고 RNA 분리가 준비될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 이 예는 양성 상피 세포 유형별 대조군을 레이저로 캡처하기 전과 후의 펜 프레임 슬라이드에서 대표적인 톨루이딘 블루 염색 전립선 단면을 보여줍니다.
조직의 레이저 캡처 영역의 특이성을 확인합니다. 양성 상피와 기질. 전립선암 특이적 유전자인 A-M-A-C-R을 발현하지 않습니다.
기질은 이 절차를 시도하는 동안 상피 특이적 유전자와 KX 3.1을 발현하지 않았습니다. RNA 분해를 방지하기 위해 RNA가 없는 환경에서 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수많은 다운스트림 분석 기술을 위해 동질적인 상피 또는 폭풍 세포 집단에서 RNA를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
저온 유지 장치로 작업하는 것은 예방 조치에서 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오., 예를 들어 이 절차를 수행하는 동안 항상 블레이드에 대한 매우 세심한 주의를 기울여야 합니다.
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이 프로토콜은 불균일한 냉동 전립선 조직에서 전립선 상피 세포 유형의 순수한 집단을 분리하기 위한 레이저 캡처 마이크로 해부술의 사용을 설명합니다. 이 방법은 하위 스트림 RNA 분석을 용이하게 하여 전립선 암 연구를 돕습니다.
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of pure prostatic epithelial cell populations from heterogeneous tissue, directly addressing stromal bias in gene expression studies. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery for prostate cancer research. Integrating LCM-derived RNA analysis at early discovery and translational stages improves portfolio decision-making by reducing biological ambiguity.
LCM-based RNA isolation fits at the interface of early discovery, target validation, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical evaluation.