Name: 셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 학습하세요 세포 주기 사건에서 분리된 염색질 해응축을 연구하는 세포 무리 분석법을. HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물을 사용하여 유사분열 말기 염색질 역학을 특성화합니다.

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AKS 1 &amp; 2가 발달 셀 (31) (3), Magalska에서 다시 인쇄되어 그림에이 작품은 독일 연구 재단과 ERC (WA에 AN377 / 3-2 309528이 CHROMDECON)와 베링거 인 겔 하임 퐁의 박사 원정대에 의해 지원되었다 등의 등. 유사 분열, 305-318, 2014 년 말에 염색질 decondensation에서, RuvB 같은 -ATPase를 기능, 엘스 비어의 종류 권한.

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<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
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<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
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제노 계란 추출물 충실히 시험 관내 세포 과정을 재현하는 매우 유용한 도구이다 laevis의,이 시스템은 성공적으로 세포주기 및 세포 분열 이벤트 2, 3,5,6,17의 특성화에 사용 하였다. 때문에 oogenesis 동안 계란에서 압수 핵 구성 요소의 대형 상점, 계란 추출물은 세포 성분의 훌륭한 소스입니다. 포유 동물 조직 세포주 또는 유전자 조작에 RNAi를 같은 다른 방법에 비해, 이는 여러 가지 이점을 제공한다 : 무 세포 시스템은 셀룰러 생존 달리 한정 될되는 세포 프로세스 연구를 허용한다. 또한 복잡한 프로세스의 단일 단계를 간단한 분석에서 분석 될 수있다. 여기에 제시된 decondensation 분석은 각각 다른 유사 분열 이벤트에서의 간섭없이 postmitotic decondensation의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. Xenopus의 계란 추출물은 특정 단백질의 결핍에 의해 조작하기 쉬운및 억제...

Xenopus의 laevis의 달걀 추출물은 무 세포 분석의 단순 복잡한 세포 이벤트를 연구하는 강력하고 광범위하게 적용되는 도구입니다. Lohka &amp; Masui 1에 의해 처음으로 설명하기 때문에 그들은 광범위하게 같은 염색질 응축 2, 스핀들 조립 3, 핵 봉투 고장 4뿐만 아니라 nucleocytoplasmic 전송 5 DNA 복제 (6) 등의 유사 분열 과정을 연구하는 데 사용되었다. 핵 봉투 개혁과 핵 기공 복잡한 재 조립 등의 interphasic 핵의 개혁에 필요한 유사 분열의 끝에서 발생하는 이벤트는, 초기 유사 분열 이벤트에 비해 이해 훨씬 덜하지만 유사 Xenopus의 계란 추출물 (7)를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 우리는 최근에 유사 분열 (8)의 끝에서 염색질 decondensation을 연구하기 위해 Xenopus의 계란 추출물을 기반으로 분석을 설립, 언더 조사 과정은 내가 기다리고 그자세한 특성의 TS. 후생 동물에서 염색질은 높은 유전 물질의 분리를 충실히 수행하기 위해 유사 분열 진입 집광된다. 염색질은 간기 동안 유전자 발현과 DNA 복제를 위해 액세스 할 수 있는지 확인하기 위하여, 유사 분열의 끝에서 압축 해제 될 필요가있다. 척추 동물에서, 염색질은 최대 유사 분열 다짐 보통 훨씬 ​​낮은 효모 달리, S. 예에서, 단지 두 배 계면 (9)에 비해 유사 분열 동안 더 괴성 오십 배이며 cerevisiae의 10. 척추 염색질 decondensation은 대부분 계란 수정 후 정자의 DNA 구조 조정의 맥락에서 연구되어왔다. 분자 메커니즘은 어떤 nucleoplasmin, 풍부한 난자 단백질, 계란에 저장 히스톤의 H2A와 H2B에 정자 별 프로타민을 교환한다. 이 과정은 또한 Xenopus의 계란 추출물 11, 12를 이용하여 규명 하였다. 그러나, 발현nucleoplasmin의이 정자 별 프로타민을 포함하지 않는 난 모세포 (13)과 유사 분열 염색질로 제한됩니다. 따라서 유사 분열의 끝에서 decondensation을 염색질 8 개의 독립적 인 nucleoplasmin입니다. 체외 decondensation 반응을 위해 우리는 동기화 된 HeLa 세포에서 분리 된 활성화 된 X를 laevis의 달걀과 염색질 클러스터에서 발생 추출물을 사용합니다. 칼슘 이온 운반체와 계란의 치료는 수정시 정자의 항목에 의해 생성 된 난자에 칼슘 방출을 모방. 칼슘 웨이브 제 상간 14로 이행, 감수 분열의 중기 제 체포 세포주기 재개와 달걀을 트리거한다. 따라서, 양식 활성화 계란 준비 계란 추출물은 유사 분열 출구 / 계면 상태를 나타내고 염색질 decondensation, 핵 봉투와 같은 유사 분열 종료에 대한 특정 이벤트를 유도 할 능력이 복잡한 개혁 기공. 유사 분열 채널의 분리를위한클러스터 romatin 우리는 염색체 클러스터가 헬라 세포 유사 분열에 동기화 및 그라데이션 회 원심에 의해 폴리아민 포함하는 버퍼에 격리에서 용해에 의해 방출된다 가세 &amp; 램 믈리 15 일 발표 한 프로토콜의 약간 수정 된 버전을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>스페르민 테트라하이드로클로라이드</td><td>플루카 분석</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘 트리하이드로클로라이드</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>고순도 디지토닌</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>독성</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td>독성</td></tr><tr><td>티미딘</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>노코다졸</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td></td></tr>독성 <tr><td>37% 포름알데히드 용액</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>독성</td></tr><tr><td>트리판 블루 용액(0.4% )</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>독성</td></tr><tr><td>1,4-디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF 염산염</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (콜로이드 실리카 입자 solution)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; 조직 배양 플라스크</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer (40 ml 조직 분쇄기)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>보조</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Oak Ridge 원심분리기 튜브, 폴리카보네이트(50ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &마이크로; m 세포 여과기, 나일론</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasin B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td>독성</td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td>독성</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG Ovogest</td><td>MSD</td><td>로 사용 가능 MSD 1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td>로 사용 가능</tr><tr><td>A23187 (혼합 칼슘-마그네슘-염)</td> <td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>독성</td></tr><tr><td>주사기 바늘 (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2 ")</td> <td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1 / 2 / 3 / 4</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 포스 팟 디 소듐 염</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 포스포키나제</td><td>시그마</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>시그마</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr> TLA 100용 <tr><td>PFA</td><td></td><td>Sigma P-6148</td><td>독성</td></tr><tr><td>원심분리 튜브(7 x 10mm, 5/16 x 13/16인치)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (넓은 개구부가 있는 팁, 1,000 &마이크로; l)</td> <td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50 % 글루 타르 알데히드 용액, 등급 I</td><td>시그마 알데릭</td><td>G7651-10 ml</td><td>독성</td></tr><tr><td>0.1 % (w / v) 폴리 -L- 라이신 용액</td><td>시그마</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>플랫 바닥 튜브 (6 ml, 16.0 / 55 mm)</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 장착 매체</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>TLA120용 튜브(11 x 34mm, 7/16 x 1 3/8인치)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver"(넓은 개구부가 있는 팁, 200 &마이크로; l)</td> <td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12mm 커버 슬립</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 # 1</td><td></td></tr></tbody></table>

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 decondensation을 공부하기

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

척추동물 세포주기 동안 염색질은 광범위한 구조적, 기능적 변화를 겪습니다. 유사분열 진입 시, 그것은 유사분열 방추체 장치에 의해 개별적으로 움직이는 막대 모양의 염색체로 대규모로 응축됩니다. 유사 분열 염색질 응축은 계기에서와 같이 50 배 더 밀도가 높은 밀도로 압축 된 염색체를 생성합니다. 유사분열에서 벗어나는 동안 염색체는 핵막으로 둘러싸여 있고 복제 및 전사에 적합한 기능적 간기 상태를 다시 설정해야 합니다. 응축 제거 과정은 형태학적으로는 잘 설명되어 있지만 분자 용어로는 잘 이해되지 않습니다: 우리는 근본적인 분자 사건에 대한 지식이 부족하고 관련된 요인과 그 조절에 대한 지식이 부족합니다. 여기에서는 동기화된 HeLa 세포와 X. laevis 난자 추출물에서 정제된 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 염색질 축합 제거를 충실하게 재현하는 cell-free 시스템을 설명합니다. 당사의 cell-free 시스템은 염색질 축합의 추가 분자 특성화 및 핵 외피 및 공극 복합체 재조립과 같은 유사분열 출구 중에 동시에 발생하는 프로세스와의 조정을 위한 중요한 도구를 제공합니다.

decondensation 반응의 시간 의존성 그림 1은 decondensation 분석의 전형적인 시간 과정을 보여줍니다. 반응 개시 가시 염색체 클러스터 decondenses 번의 둥글고 부드러운 핵 내로 병합. 계란 추출물 자당으로 대체 될 때 염색체 클러스터 decondensation 활동 계란 추출물에 존재 함을 시사하는 축합 남아 버퍼. 염색질 decondensation는 에너지 의존하는 과정이다 체외 decondensation 반응은 편리 억제제의 첨가에 의해, 예를 조작 할 수있다. 도 2에 도시 된 실험에서, 비 - 가수 분해성 ATP 또는 GTP 유사체, 또는 ATPγS GTPγS는, 반응에 첨가 하였다. 둘은 ATP와 GTP 의존, 활성 프로세스 (...

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

이 실험의 전반적인 목표는 세포 없는 분석법(cell-free assay)의 단순한 환경에서 유사분열 말기에 일어나는 염색질 탈응축(chromatin decondensation) 과정을 충실하게 재구성하는 것입니다. 이 방법은 염색질 탈응축의 분자적 메커니즘을 특성화하고 조절에 관여하는 인자를 식별할 수 있게 하므로, 유사분열 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생화학적 조작이 용이하며 염색질을 분석할 수 있다는 점입니다.탈응집(Decolonization)은 다른 세포 주기 사건들과 분리되어 독립적으로 연구될 수 있습니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 헬로(helo) 세포에서 유사분열 염색질 클러스터를 분리하고 IIC xenopus lavis 난 추출물 조제를 위한 버퍼를 준비하십시오. 준비가 완료되면, 27게이지 바늘이 장착된 5mL 주사기를 사용하여 배란이 유도된 개구리에 500 international units의 인간絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)을 주입하십시오.알 배출을 유도하기 위해 실험 전날 저녁에 개구리의 등쪽 림프낭 피부 아래에 주사합니다. 유도 후에는 1.2 L의 Mark's modified Ringer's buffer가 담긴 개별 수조에서 18 °C로 13~17시간 동안 유지합니다. 개구리가 알을 낳으면, 이미 활성화된 알과 상태가 좋지 않은 알을 제거합니다. 수조의 내용물을 600~1000 mL 유리 비커에 부어 알을 정확하게 수집합니다.전체적인 추출 품질이 이 단계에 달려 있으므로 알을 분류하는 것이 매우 중요합니다. 활성화되어 끈적거리거나 외관상 상태가 좋지 않은 알을 제거하십시오. 또한 이후 단계에서도 계속해서 상태가 좋지 않은 알을 제거하십시오.알이 가라앉으면 S 상층액을 따라내고, 그 후 비커에 신선한 완충액을 다시 채웁니다. 마지막 세척 단계까지 이 과정을 4회 반복하여 알을 세척합니다. 상층액을 한 번 더 제거한 다음, 알의 윤곽을 명확하게 하기 위해 비커에 2% L cysteine 용액을 채웁니다.2~4분 후, L cysteine이 포함된 신선한 완충액으로 교체합니다. 약 5~7분 후에 알의 부피가 급격히 감소하고 알들이 더 조밀하게 뭉치면 탈피(de geling)가 완료된 것으로 간주합니다. 다음으로, 완충액을 알 위에 직접 붓지 말고 비커 벽면을 따라 조심스럽게 따라내고 다시 채우는 방식으로 mark's modified ringers buffer로 알을 세척합니다.그런 다음 2 mg/mL의 칼슘 이온이 8 µL 포함된 100 mL의 Marx modified ringers buffer에서 난자를 활성화합니다. 동물극 수축이 보이면 활성화를 중단합니다.또는 활성화 후 10분이 지나면, 마크 수정 링거 완충액(mark's modified ringer's buffer)으로 알을 조심스럽게 세척하고, 마지막 세척 후에는 완충액을 따라내고 다시 채워 상청액을 제거합니다. 알을 실온의 마크 수정 링거 완충액에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 5 mL 원심분리 튜브에 50 µL의 sucrose 완충액과 100배 희석된 protease 억제제를 준비합니다.1 M DTT 5 µL, cyclo heximide 12.5 µL, 그리고 cyto. B 2.5 µL를 혼합합니다. 알을 차가운 sucrose 완충액으로 두 번 세척한 후 원심분리 튜브로 옮깁니다. 입구가 넓은 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브를 130 g에서 1분간 회전시켜 알을 팩킹합니다. 원심분리 후, 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 과잉 완충액을 제거하고 남은 빈 공간에 알을 더 채웁니다.그런 다음 난황이 채워진 튜브를 5 mL 스윙 로터 원심분리기로 4°C에서 21,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 용액이 세 개의 층으로 분리되면, 16게이지 바늘이 장착된 5 mL 주사기를 튜브 측면을 통해 찔러 넣어 상단의 노란색 난황과 하단의 어두운 색의 파손된 알 찌꺼기 사이의 중간층으로 진입시킵니다. 저속 위상 추출물을 얼음 위에 놓인 새 튜브로 옮긴 후, 100배 농축 프로테아제 억제제 10 µL를 첨가합니다.1 M DTT 1 µL, 20 mg/mL cyclo heximide 2.5 µL, 그리고 cyto B 0.5 µL를 혼합합니다. 저속 추출액 1 mL당 10 mg/mL를 각각 첨가합니다. 10 x 2 mL 로터에서 355,000 ×g로 12분 동안 저속 분획 추출액을 원심분리합니다. 그 후 상단의 지질층을 조심스럽게 제거하고 고속 추출액이 포함된 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.이 단계는 고품질의 샘플을 생성하는 데 매우 중요합니다. 제거되는 액체에 상단의 지질층이나 하단의 불순물 층이 섞이지 않도록 주의하십시오. 고속 추출액 18 µL를 1.5 mL 반응 튜브에 분주한 후, glycogen 0.5 µL와 energy mix 0.5 µL를 추가합니다.3.3 µL의 6-dimethyl purine과 0.7 µL의 mitotic clusters를 넣습니다. 크로마틴이 추가된 직후, 분해되는 크로마틴의 전단 현상을 방지하기 위해 입구가 넓은 팁을 사용하여 반응물을 혼합합니다. 혼합 후, 반응 혼합물을 20 °C에서 최대 2시간 동안 배양합니다.그 후 4% paraldehyde, 0.5% glutaraldehyde 및 0.1 mg/mL dpi가 포함된 얼음처럼 차가운 고정액 0.5 mL를 첨가하여 시료를 고정합니다. 입구가 넓은 팁을 사용하여 시료를 얼음 위에서 20~30분 동안 배양합니다. 다음으로, 0.1% (w/v) poly L lysine 용액으로 12 mm 원형 커버슬립을 코팅하고, 커버슬립의 친화력을 높이기 위해 5분 동안 배양합니다.그 후 커버슬립을 거름종이 위에서 건조시킵니다. 건조가 완료되면, 코팅된 면이 위를 향하도록 코팅된 커버슬립을 6 mL 평저 원심분리 튜브 바닥에 넣습니다. 그다음 30% sucrose 쿠션을 800 µL 추가하고, 그 위에 고정된 시료 전체를 층으로 쌓습니다.샘플을 4°C에서 2,500 ×g로 15분 동안 원심 분리합니다. 그 다음 상층액을 버리고, 16게이지 바늘로 원심 분리 튜브 바닥을 조심스럽게 찔러 튜브에서 커버 슬립을 제거합니다. 바늘에 의해 커버 슬립의 한쪽 면이 들어 올려지면, 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 꺼내어 탈이온수에 빠르게 담가 세척한 후, 필터 페이퍼에 측면을 대어 부드럽게 건조시킵니다. 다음으로, 현미경 슬라이드 위에 봉입제 한 방울을 떨어뜨리고 커버 슬립의 샘플 면이 아래로 향하게 하여 덮습니다.마운팅 용액 위에 덮어주십시오. 커버 슬립을 종이 와이프로 조심스럽게 말린 후, 커버 슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 이미징 전까지 슬라이드를 암소에 보관하십시오. 다음은 탈보상 분석의 일반적인 시간 경과 과정입니다.반응 시작 시점에 관찰되는 염색체 집단인 decon은 응축되어 하나의 둥글고 매끄러운 핵으로 융합됩니다. 난자 추출물을 sucrose 완충액으로 교체했을 때 염색체 집단이 응축된 상태를 유지하는 것은 난자 추출물 내에 decompensation 활성이 존재함을 시사합니다. 본 실험에서는 가수분해되지 않는 ATP 또는 GTP 유사체를 반응액에 첨가하였습니다.이 두 가지 첨가제 모두 응축 해제를 억제하며, 이는 이 활성 과정이 ATP 및 GTP 가수분해 모두에 의존한다는 것을 증명합니다. 숙달되면, 싱가포르 수준의 난자 추출물 준비에는 약 2시간, 프로모터 탈식민화 분석에는 3시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 성공 여부는 추출물의 품질에 결정적으로 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.특히 면역 고갈(immuno depletion)의 경우, 본 절차에 따라 갓 준비한 추출물을 사용하는 것이 권장됩니다. 어떤 인자들이 관여하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역 고갈이나 재조합 단백질 첨가와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 분열기 또는 핵의 구조 및 기능 분야의 연구자들이 동물 세포의 분열 말기에 일어나는 염색질 탈응축(chromatin dehumanization)을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 Xenopus 간 난자 추출물을 준비하는 방법과 이 방법을 사용하여 크로마틴 탈응축을 재구성하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. Paraform Hyde, Hyde 및 DARPA를 사용할 때는 위험할 수 있으므로 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

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