셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

이 실험의 전반적인 목표는 무세포 분석의 단순성으로 유사분열 종료 시 발생하는 염색질 축합을 충실하게 재구성하는 것입니다. 이 방법은 염색질의 분자 메커니즘의 특성화, 탈식민지화 및 조절에 관련된 요인의 식별을 가능하게 하므로 유사분열 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 쉽게 생화학적으로 조작되고 염색질이 가능하다는 것입니다.

탈집락화는 다른 세포주기 이벤트와 분리되어 단독으로 연구할 수 있습니다. 시작하려면 helo 세포에서 유사분열 염색질 클러스터를 분리하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 IIC xenopus lavis 난자 추출물 준비를 위한 완충액을 준비합니다. 준비가 완료되면 27 게이지 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 배란 유도 개구리에 500 국제 단위의 인간 융모성 성선 자극 호르몬을 주입합니다.

실험 전날 저녁에 개구리를 등쪽 림프낭 피부 아래에 주입하여 난자의 방출을 유도합니다.일단 유도되면 1.2리터의 Mark's modified ringers buffer가 들어 있는 개별 탱크에서 개구리를 섭씨 18도에서 13-17시간 동안 유지합니다. 개구리가 알을 낳은 후 보기 흉한 알과 함께 이미 활성화된 알을 제거하십시오. 탱크를 600-1000밀리리터 유리 비커에 올바르게 부어 수집하십시오.

달걀을 분류하는 것은 전반적인 추가 품질이 단계에 따라 달라지므로 매우 중요합니다. 활성화된 끈적끈적하거나 그렇지 않으면 보기 좋지 않은 계란을 제거하십시오. 또한 이후 단계에서 나쁜 계란을 계속 제거하십시오.

계란이 가라앉으면 S 상층액을 디캔팅하고 나중에 비커에 새 완충액을 다시 채웁니다. 이 과정을 네 번 반복하여 마지막 세척 후 계란을 씻습니다. supinate를 한 번 더 제거한 다음 비커에 2%L 시스테인 용액을 채워 난자를 설명합니다.

2-4분 후 L 시스테인이 함유된 새 완충액으로 변경합니다. 고려 de geling 약 5-7분 후에 난자의 부피가 급격히 감소하고 난자가 더 조밀하게 채워질 때 완료됩니다. 다음으로, 계란에 직접 바르는 대신 비커 벽에 완충액을 디캔팅하고 다시 채워 Mark의 수정된 링거 버퍼에서 계란을 조심스럽게 씻습니다.

그런 다음 100ml의 Marx 변형 링거 완충액에서 8마이크로리터를 포함하는 2밀리리터당 2밀리그램의 난자를 활성화합니다. 칼슘 이온. 넷째, 동물 뚜껑 수축이 보일 때 활성화를 중지하십시오.

또는 활성화 후 10분 후 Mark의 변형된 링거로 계란을 조심스럽게 씻고 마지막 세척 후 완충액을 디캔팅하고 다시 채워 완충액을 세척합니다. Mark's modified ringer's buffer에서 20분 동안 실온에서 난자를 부화시킵니다. 다음으로, 50 마이크로 리터의 자당 완충액, 50 마이크로 리터의 100 배 프로테아제 억제제가 포함 된 5 밀리리터 원심 분리 튜브를 준비합니다.

1 몰 DTT 12.5 마이크로 리터의 cyclo heide와 2.5 마이크로 리터의 cyto를 혼합합니다. B. 차가운 자당 완충액으로 계란을 두 번 씻은 다음 원심분리 튜브로 옮깁니다. 넓은 개구부가 있는 플라스틱 방촉 피펫을 사용하여 130G에서 1분 동안 튜브를 회전시켜 계란을 포장하고 플라스틱 방촉 피펫을 사용하여 초과 버퍼를 제거하고 여분의 공간을 더 많은 계란으로 채웁니다.

그런 다음 4 섭씨 온도와 21, 000 번 g에서 20 분 동안 6 x 5 밀리리터 스윙 로터에서 계란으로 채워진 튜브를 원심 분리하십시오. 용액이 이제 세 개의 층으로 분리된 상태에서 16게이지 바늘이 있는 5ml 주사기를 튜브 측면을 통해 상단의 노란색 노른자와 하단의 어둡고 깨진 계란 파편 바로 위 사이의 중간 층으로 밀어 넣습니다. 저속 위상 추출물을 얼음 위의 새 튜브로 옮긴 다음 100 배 단백질 분해 효소 억제제 10 마이크로 리터를 첨가하십시오.

1 몰 DTT 2.5 마이크로 리터의 cyclo heide의 1 마이크로 리터를 밀리리터 당 20 밀리그램으로 혼합하고, 0.5 마이크로 리터의 사이토 B.저속 추출물의 각 밀리리터에 밀리리터 당 10 밀리그램을 첨가합니다. 저속 위상 추출물을 355, 000 x 2 밀리리터 로터에서 12 분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 상단의 지질층을 부드럽게 제거하고 고속 추출물이 함유된 supinate를 새 튜브로 옮깁니다.

이 단계는 고품질 샘플을 생산하는 데 매우 중요합니다. 제거된 액체에 상단의 지질층이나 성가신 하단층의 오염 물질이 포함되어 있지 않은지 주의하십시오. 1.5 밀리리터 반응 튜브에 고속 추출물 18 마이크로 리터를 피펫 한 다음 0.5 마이크로 리터의 글리코겐 0.5 마이크로 리터의 에너지 믹스를 첨가하십시오.

세 번째 포인트, 6 디메틸 퓨린의 마이크로 리터 및 0.7 마이크로 리터의 유사 분열 클러스터. decompensating chromatin의 전단을 방지하기 위해 염색질이 추가되자마자 반응을 혼합하기 위해 넓은 구멍이 있는 팁을 사용하십시오. 혼합이 완료되면 섭씨 20도에서 최대 2시간 동안 반응 혼합물을 배양합니다.

그런 다음 0.5%파라알데히드, 4%글루타르알데히드 및 0.5밀리리터 dpi를 포함하는 0.1밀리리터의 얼음 냉기 고정제를 추가하여 샘플을 고정합니다. 입구가 넓은 팁을 사용하여 얼음 위에서 샘플을 20-30분 동안 배양합니다. 다음으로, 코드 12mm 원형 커버는 0.1% 중량 대 부피 폴리 L 라이신 용액으로 미끄러지고 커버 슬립을 5분 동안 배양하여 커버 슬립의 친화력을 높입니다.

염색질을 건조시키려면 나중에 덮개가 여과지에서 미끄러집니다. 건조되면 코팅된 면이 위로 향하도록 6밀리리터 평평한 바닥 원심분리 튜브의 바닥에 코팅된 커버 슬립을 추가합니다. 그런 다음 800 마이크로 리터의 30 % 자당 쿠션을 추가하고 전체 고정 샘플을 맨 위에 겹쳐 놓습니다.

4 섭씨 온도와 2, 500 시간 G.Then에 15 분 동안 표본을 회전시키십시오 S 상농액을 decamp 16의 계기 바늘을 가진 원심 분리 관의 바닥에 주의깊게 찌르기에 의하여 관에서 덮개 미끄러짐을 제거하십시오. 커버 슬립이 한쪽의 바늘로 들어 올려지면 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거하고 커버 슬립을 탈이온수에 담가 빠르게 세척한 다음 옆면을 터치하여 용지를 여과하여 부드럽게 건조시킵니다. 다음으로, 장착 매체 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓고 덮개의 샘플 면을 내립니다.

장착 매체에 밀어 넣습니다. 덮개를 부드럽게 말리고, 종이로 미끄러지고, 덮개 가장자리를 닦아내고, 매니큐어로 미끄러지고, 이미지가 나올 때까지 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오. 다음은 보상 제거 분석의 일반적인 시간 경과입니다.

반응이 시작될 때 볼 수 있는 염색체 클러스터는 응축되어 하나의 둥글고 부드러운 핵으로 합쳐집니다. 난자 추출물이 자당 완충액으로 대체될 때 염색체 클러스터는 응축된 상태로 유지되며, 이는 난자 추출물에 보상 부탈 활성이 존재함을 시사합니다. 여기에 표시된 실험에서 가수분해되지 않은 A TP 또는 GTP 유사체를 반응에 첨가했습니다.

이 두 첨가제는 모두 응축을 억제하여 이 활성 공정이 A TP 및 GTP 가수분해에 의존한다는 것을 증명합니다. 이 기술을 숙달하면 싱가포르 수준의 난자 추출물 준비의 경우 약 2시간, 촉진 탈식민화 분석의 경우 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 성공 여부는 추출 품질에 따라 크게 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

특히 면역 고갈의 경우 이 절차에 따라 갓 준비한 추출물을 사용하는 것이 좋습니다. 면역 고갈 및 재조합 단백질 추가와 같은 다른 방법을 수행하여 어떤 요인이 관련되어 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 유사분열 또는 핵 구조 및 기능 분야의 연구자들이 동물 세포에서 유사분열이 끝날 때 발생하는 염색질 비인간화를 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 exenopus 간 난자 추출물을 준비하는 방법과 염색질 탈집락화를 재구성하기 위해 방법을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. Paraform Hyde, Hyde 및 DARPA로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.