오일 유제에서 물 : 소수성 안료와 수용성 엽록소 결합 단백질을 조립하기위한 새로운 시스템

이 기술의 전반적인 목표는 수용성 단백질의 결합 부위에 수불용성 엽록소를 통합할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 엽록소와 재조합 단백질을 결합할 수 있으며, 이를 통해 엽록소-단백질 상호 작용에 대한 엄격한 연구를 수행할 수 있고 새로운 엽록소-단백질 복합체를 구성할 수 있는 새로운 가능성을 열 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질에 태그를 붙이거나 고정시킬 필요가 없다는 것입니다.

따라서 스크리닝 분석에 매우 적합합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구 그룹의 박사후 연구원인 Dominica Bednarczyk입니다. 다음 원액을 준비하는 동안 모든 엽록소 준비 단계를 화학 후드 아래, 녹색 조명 아래 또는 어두운 곳에서 수행하여 광 손상을 최소화합니다.

보관을 위해 안료를 동결하기 전에 항상 질소 또는 아르곤을 첨가하고 모든 용매가 분석 등급인지 확인하십시오. 먼저 틸라코이드 막에 엽록소 a 또는 엽록소-a만 포함된 동결건조된 스피룰리나 플라텐시스 세포 또는 기타 시아노박테리아 세포의 무게를 약 5g의 무게를 측정하고 절구와 절굿공이를 사용하여 분쇄합니다. 엽록소 추출 중 중요한 단계는 시아노박테리아 세포가 완전히 동결건조되었는지 확인하고 아세톤으로 여러 번 세척하여 DEAE-Sepharose에서 수분을 완전히 제거하는 것입니다.

분쇄된 세포를 유리 기둥에 넣고 약 50-100밀리리터의 100% 아세톤으로 조직을 세척하여 카로티노이드를 제거합니다. 세척 후에는 용출된 주황색-녹색 조각을 버리십시오. 실제 색상은 시아노박테리아 배양 및 성장 조건에 따라 주황색-녹색에서 녹색으로 다양할 수 있습니다.

아세톤을 100% 메탄올로 교환하고 엽록소 a를 포함하는 녹색 분획을 수집합니다. 용출된 분획의 색이 짙은 녹색에서 옅은 녹색으로 바뀌면 용리를 중지합니다. 다음으로, 섭씨 30도를 초과하지 않는 수조가 있는 회전 증발기를 사용하여 추출물이 완전히 건조될 때까지 메탄올을 증발시킨 다음 소량의 디에틸 에테르를 사용하여 건조된 추출물의 안료를 완전히 용해하고 면봉을 통해 용액을 여과하고 소량의 에테르를 추가로 사용하여 면모에서 안료를 씻어냅니다.

안료가 완전히 건조될 때까지 디에틸 에테르를 증발시킵니다. 이 시점에서 멈추는 경우 추가 처리가 될 때까지 건조 안료를 질소 또는 아르곤 아래에서 섭씨 20도의 어두운 곳에 보관하십시오. 엽록소를 진행하려면 가능한 한 가장 작은 부피의 100% 아세톤으로 건조 안료를 부분적으로 용해시킨 다음 현탁액에 4ml의 아세톤을 첨가하고 플라스크를 소용돌이쳐 안료를 완전히 용해시킵니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 100% 아세톤으로 평형을 이룬 DEAE-Sepharose 컬럼에 샘플을 부드럽게 로드하고 100% 아세톤으로 카로티노이드를 용리합니다. 그런 다음 3:1 부피 대 부피 아세톤-메탄올 혼합물을 사용하여 엽록소 a를 용리합니다. 실제 안료 색상을 관찰하기 위해 손전등을 사용하여 용리 중에 컬럼을 잠시 비출 수 있습니다.

박층 크로마토그래피를 사용하여 디클로로메탄과 헥산, 이소프로판올 및 메탄올의 68:25:5:2 부피 대 부피 비율을 사용하여 엽록소의 순도를 확인하여 시료를 용리시킵니다. 그런 다음 회전 증발기를 사용하여 엽록소 a가 완전히 건조될 때까지 용매를 증발시킵니다. 엽록소를 준비하려면 원액을 건조 엽록소 a를 100% 메탄올 2-4밀리리터에 다시 용해시킵니다.

에멀젼의 유기상을 준비하려면 50 밀리리터 튜브에 Tween 80 0.2g, Span 80 1.8g 및 미네랄 오일 38g의 무게를 싣습니다. 구성 요소를 잘 섞고 용액을 얼음 위에 올려 식힙니다. 정제된 수용성 엽록소 결합 단백질(WSCP를 포함하는 수성상)을 준비하기 위해 WSCP 유전자를 포함하는 E.coli BL21 박테리아를 섭씨 37도의 LB 배지 1리터에서 0.3 - 0.6의 OD600으로 성장시킵니다.

단백질 발현을 유도하기 위해 1밀리몰 IPTG를 첨가하고 섭씨 30도에서 12-16시간 동안 박테리아를 성장시킨 다음 5000G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 수확합니다. 친화성 크로마토그래피에 적합한 완충액으로 펠릿을 용해시키고 박테리아 현탁액을 더 작은 튜브로 옮기고 얼음에서 초음파 처리합니다. 용해물을 방사시킨 후, 제조업체의 지침에 따라 단백질 정제를 위해 적절한 상용 친화성 크로마토그래피 시스템을 사용하여 재조합 태그가 지정된 WSCP 단백질을 정제합니다.

완충액을 50 밀리몰 인산염 완충액 pH 7.8로 교환하고 정제 된 WSCP 농도를 0.5 내지 1 밀리리터로 조정하여 에멀젼의 수성상을 준비한다. WSCP로 미처리 박테리아 용해물을 함유하는 수성상을 준비하기 위해 섭씨 37도에서 250ml의 LB에서 WSCP를 발현하는 플라스미드를 포함하는 E.coli BL21 세포를 로그 상으로 성장시킵니다. 단백질 발현을 유도하기 위해 1밀리몰 IPTG를 첨가하고 박테리아를 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 성장시킵니다.

다음 날, 수확 후 박테리아 세포는 1-2 밀리리터의 50 밀리몰 인산나트륨 완충액 pH 7.8을 사용하여 펠릿을 용해시킵니다. 다음, sonicating 후에, 30 분 동안 12, 000 G 및 4 섭씨 온도에 용해물을 원심 분리하십시오. 0.125 밀리리터의 상층액과 0.875 밀리리터의 50 밀리몰 인산나트륨 완충액 pH 7.8을 혼합하여 에멀젼의 수성상을 준비합니다.

에멀젼에 엽록소 a와 WSCP를 조립하려면 완전히 혼합된 오일-계면활성제 혼합물 5ml를 유리 바이알에 옮기고 얼음에서 식힙니다. 방금 준비한 얼음-차가운 수성상 1ml를 넣고 얼음 위에서 9, 500RPM으로 조직 균질화기를 2분 동안 사용하여 두 상을 혼합합니다. 이 시점부터 광손상을 최소화하기 위해 녹색 조명 아래에서 모든 단계를 수행하고 20마이크로리터의 25밀리몰 엽록소 용액을 에멀젼에 추가합니다.

유리 바이알을 튕기고 뒤집어서 엽록소 a가 에멀젼에 고르게 분포되도록 한 다음 어둠 속에서 얼음 위에서 1-2시간 동안 배양합니다. 에멀젼 준비 중 중요한 단계는 혼합하기 전에 물 단계와 유기 단계를 모두 냉각시키는 것입니다. 다음으로, 유화액을 분해하고 유기상에서 물방울을 분리하기 위해 유제를 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮기고 실온에서 5 분 동안 14, 000 G에서 원심 분리하십시오.

상부 오일상을 버리고 하부상에 미네랄 오일 1ml를 첨가한 다음 볼텍싱이나 튜브를 뒤집어 잘 섞습니다. 샘플을 회전시킨 후 상부 오일 상을 제거하고 중간 에멀젼 없이 수성 오일 상과 광유 상을 분리하는 투명한 메니스커스가 나올 때까지 미네랄 오일과 원심분리를 반복합니다. 이제 수성상에 1 밀리리터의 물 포화 디 에틸 에테르를 첨가하십시오.

그런 다음 샘플을 와류로 만든 후 실온에서 14, 000G에서 5분 동안 회전시킵니다. 세 번째 원심 분리 후 후드에서 디 에틸 에테르를 제거하고 튜브를 5-20 분 동안 열어 둡니다. 마지막으로, WSCP-엽록소 복합체를 포함하는 수성상을 탈염 컬럼에 로드하고 향후 실험에 적합한 완충액으로 용리합니다.

샘플을 섭씨 4도의 빛에서 멀리 떨어진 곳에서 최대 한 달 동안 보관하십시오. 이 비디오에 설명된 프로토콜을 사용하여 재조합 WSCP 아포단백질을 물과 오일 에멀젼에서 엽록소 a와 함께 조립했습니다. 여기에 표시된 것은 4개의 재조합 WSCP 변이체를 가진 엽록소 A 복합체의 흡광도와 CD 스펙트럼입니다.

결과는 이전에 보고된 각 네이티브 복합체의 스펙트럼과 띠 모양의 끝 위치가 유사합니다. 이 그림은 수성상의 녹색에서 볼 수 있듯이 WSCP 발현 세포의 용해물에서 엽록소 a와 WSCP의 양성 조립을 보여줍니다. 이 결과는 엽록소와 WSCP의 양성 조립을 위한 빠른 스크리닝 시스템으로서의 물 및 오일 에멀젼의 잠재력을 보여줍니다.

여기에서 입증된 바와 같이, WSCP 함유 용해물의 방울은 컨포칼 현미경 이미지에서 뚜렷한 엽록소 형광을 특징으로 합니다. 이는 WSCP-엽록소 복합체의 성공적인 조립이 물방울에서 직접 검출될 수 있음을 의미하며, 이는 물과 기름 에멀젼 기반 스크리닝 시스템의 기초를 제공할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 5시간 동안 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 엽록소를 빛과 산소에 노출시키지 않고 엽록소 작업을 신속하게 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술을 통해 단백질 환경이 엽록소의 전해 및 스펙트럼 특성에 미치는 영향을 탐구하는 데 사용되는 광범위한 수용성 엽록소 결합 단백질을 준비할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 시아노박테리아에서 엽록소를 추출 및 정제하고 물과 오일 에멀젼을 사용하여 수용성 단백질에 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

에테르, 메탄올 또는 아세톤과 같은 유기 용제로 작업하는 것은 해로울 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 화학 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.