2015년 12월 3일
이동 능력은 중간엽 기질 세포(MSC)를 포함한 다양한 세포 유형의 핵심 기능입니다. 그러나 피해 후 이동 능력의 변화를 정량화하는 것은 어려운 일입니다. 이 프로토콜은 엄격한 통계를 사용하여 손상 후 MSC 이동 용량의 변화를 정량화하는 쉽게 적용할 수 있는 이동 분석을 설명합니다.
이 분석의 전반적인 목표는 용해성 담배 연기 추출물로 인한 손상 후 폐 중간엽 기질 세포의 이동 능력의 변화를 감지하는 것입니다. 이 방법은 폐 재생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있으며, 여기에는 폐 복구를 돕기 위해 폐 전구 세포의 이동 능력을 향상시킬 수 있는 방법이 포함됩니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 이동에 대한 더 나은 정량적 측정을 제공하는 동시에 경제적으로 수행하고 쉽게 맞춤화할 수 있도록 최적화되었다는 것입니다.
이 시연에서는 스크래치 분석을 사용하여 쥐 폐 중간엽 기질 세포(MSC)의 이동 능력을 정량화할 것입니다. 용해성 담배 연기 추출물에 노출된 후 MSC는 60mm 플레이트에서 완전한 배지로 성장하며 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 손상됩니다. 스크래치 분석에 적절한 confluence는 이미징 소프트웨어가 스크래치의 경계를 올바르게 식별할 수 있도록 하기 때문에 중요합니다.
이 예는 멸균 환경에서 긁기에 적합한 95% confluence의 MSC를 보여줍니다. 손상된 MSC 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 플레이트의 상단 가장자리를 가로질러 멸균된 플라스틱 자와 같은 직선 모서리를 놓습니다. 직선 가장자리는 나중에 이미징을 위해 현미경 스테이지에 배치할 때 플레이트에 필요한 회전 조정량을 최소화합니다.
매체를 제거하지 않고 멸균 직선 가장자리가 안내하는 멸균 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 플레이트를 가로질러 약 5mm 간격과 50mm 길이의 4개의 평행한 긁힘을 만듭니다. 60mm 플레이트에 여러 개의 스크래치가 발생해도 MSC의 세포 이동에 영향을 미치는 방식으로 미세환경이 변경되지는 않지만 다른 세포 유형에 대해서는 고려해야 할 사항이 될 수 있습니다. 매체를 흡입하고 2ml의 예열 완전 매체로 플레이트를 부드럽게 세척합니다.
이렇게 하면 세포가 긁힌 자국의 중심에 달라붙는 것을 방지하고 긁힘으로 인해 느슨해진 세포를 제거할 수 있습니다. 이미징을 방해하지 않는 위치에서 플레이트 아래쪽의 1에서 4까지 긁힌 자국이 있는 멸균 영구 마커 라벨을 사용하여 4ml의 새 완전 배지로 교체합니다. 스크래치 너비에 차이가 있을 수 있으므로 마이그레이션 전과 후에 동일한 스크래치의 이미지를 비교하는 것이 중요하기 때문에 각 스크래치의 스크래치 초기 이미지를 촬영해야 합니다.
스크래치 분석이 여러 플레이트에서 수행되는 경우, 다음 플레이트에서 스크래치를 만들기 전에 단일 플레이트의 모든 스크래치에 대한 초기 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다. 카메라와 함께 도립 위상차 현미경을 사용하여 분석에 필요한 이미지를 획득합니다. 배양 플레이트를 현미경에 놓고 저전력 대물렌즈를 사용하여 스크래치를 찾습니다.
제일. 스크래치를 완전히 수평으로 유지하면서 스크래치를 완전히 수평으로 유지하고 시야의 중앙에 스크래치 길이의 90%를 포함하는 데 필요한 만큼 많은 이미지를 얻으면서 스크래치가 화면에서 완전히 수평으로 나타나도록 해야 합니다. 이미지 간에 겹치지 않는 스크래치의 별개 부분에서 이미지를 가져옵니다.
스크래치 길이의 첫 번째와 마지막 5%에서 이미지를 촬영하지 마십시오. 배양 접시 가장자리에서 빛의 굴절로 인해 이미지가 노출되어 분석이 불가능하기 때문입니다. 처음부터 이미지를 저장하고 폴더의 첫 번째 이미지를 저장하십시오. 같은 방법으로 스크래치 2, 3, 4에 대한 이미지를 얻고 각 스크래치의 이미지를 별도의 폴더에 저장합니다.
이 초기 이미징 직후 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 이 분석을 시작하기 4-7시간 전에 세포가 이동하도록 합니다. Image J 소프트웨어를 다운로드하고 상처 치유 도구 플러그인을 설치하십시오.
이미지 J에서 이미지 파일을 연 다음 프로세스를 클릭하고 가장자리를 찾아 상처 치유 도구를 위해 스크래치를 둘러싼 세포를 강조 표시합니다. 스크래치 영역을 계산하려면 이미지 조정 및 색상 임계값을 클릭하고 임계값 색상이라고 표시된 드롭다운 메뉴에서 색상 임계값 메뉴 내에서 값을 BNW로 변경합니다. 아래쪽 슬라이더를 오른쪽으로 완전히 이동하여 이미지를 완전히 검은색으로 만든 다음 위쪽 슬라이더를 조정하여 스크래치와 셀 앞면 사이의 대비를 최대화합니다.
이미지에 스크래치의 윤곽이 선명하게 표시될 때까지 상단 밝기 슬라이더를 왼쪽에서 오른쪽으로 천천히 조정합니다. 스크래치의 가장자리가 확인되면 추가 도구를 클릭합니다. 이미지 J 도구 모음의 드롭다운 메뉴에서 MRI 상처 치유 도구를 선택하고 M 버튼을 눌러 스크래치 영역을 강조 표시하고 계산된 영역을 출력합니다.
결과 팝업 창에서 결과 창의 모든 숫자를 복사하여 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다. 개별 스크래치에서 데이터를 분리해야 합니다. 세포가 4-7시간 동안 이동한 후, 각 플레이트의 세포가 이동할 수 있는 시간이 동일하도록 긁힌 것과 동일한 순서로 플레이트를 스크래치 이미지화하기 위해 이미지 획득 절차를 반복합니다.
세포는 온도와 pH 변화에 대한 민감도에 따라 여러 시점에서 이미징할 수 있습니다. 그런 다음 초기 스크래치 이미지에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 이미지 J를 사용하여 최종 스크래치 이미지를 분석합니다. 스크래치 영역을 계산하여 마이그레이션을 올바르게 정량화할 수도 있습니다.
Confluence는 스크래치 분석의 성공에 매우 중요합니다. 95% 합류점에서 쥐 폐 MSC의 성공적인 긁힘이 여기에 나와 있습니다. 반대로, 70% 합류점은 스크래치를 성공적으로 만들기에는 너무 낮으며 잘못된 경계를 생성할 수 있습니다.
이는 이미징 소프트웨어에 의해 정의된 대로 해당 스크래치 영역 경계가 있는 대표적인 마이그레이션 전 및 마이그레이션 후 원본 이미지입니다. 이 그래프는 0% 또는 4% 담배 연기 추출물에 노출된 상태에서 이동 전이나 후에 95% 합류점에서 쥐 폐 MSC 플레이트에 걸쳐 만들어진 4개의 긁힌 자국 각각에 대해 계산된 평균 긁힘 면적을 픽셀 단위로 보여줍니다. 스크래치 면적에서 계산된 평균 변화를 비교한 결과, 4%의 담배 연기 추출물에 노출된 후 쥐 폐 MSC의 이동이 적은 것으로 나타났습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 우리가 작업하고 있던 특정 세포 유형에 대한 세포 합류를 최적화하고 주의 깊게 모니터링해야 한다는 것을 기억하고 가능한 한 균일하게 긁힘을 생성하는 연습을 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 다른 기술을 수행하여 세포 이동에 영향을 미칠 수 있는 변형 및 단백질 발현에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.
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이 기사는 용해성 담배 연기 추출물에 노출된 후 폐 중간엽 줄기세포(MSC)의 이동성 변화를 정량화하도록 설계된 이동 분석법을 제시합니다. 이 방법은 경제적이고 맞춤화할 수 있는 동시에 더 나은 정량적 측정을 위해 최적화되었습니다.
Quantifying mesenchymal stromal cell migration is critical for evaluating regenerative potential in lung repair strategies. This optimized scratch assay provides reproducible, image-based quantification to de-risk target validation in pulmonary fibrosis and COPD therapeutic development. The method supports mechanistic screening of environmental stressors on stromal cell function, enabling data-driven go/no-go decisions in early discovery.
This assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy screening, particularly for pulmonary regenerative therapies.