2015년 12월 14일
소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.
이 절차의 전반적인 목표는 병아리 소뇌의 외부 생식층에 대한 유전자 변형을 표적으로 하여 체외 환경에서 과립 세포 형태 및 행동을 관찰, 검사 및 수정하는 것입니다. 이 방법은 신경 전구 세포가 어떻게 이동, 증식 및 분화하는지와 같은 발달 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구와 관련된 비용 및 편의성 측면에서 상당한 이점을 제공한다는 것입니다.
이 방법은 닭 과립 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 파충류 및 포유류와 같은 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 갈색 수정란을 배아에 도달할 때까지 섭씨 38도의 계란 인큐베이터에 넣습니다. 14일차 배아 14일째, 난자의 구멍을 잘라 배아를 노출시키고 병아리 배아의 목을 베십시오.
얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 머리를 넣고 해부 현미경으로 관찰했다. 표준 집게를 사용하여 각 눈 뒤를 절개하여 조직을 통해 눈과 위턱을 제거합니다. 그런 다음 인두를 완전히 절개하여 아래턱을 제거합니다.
다음으로, 표준 집게를 사용하여 두개골 표면의 피부를 벗겨냅니다. 그런 다음 전두골과 두정골을 제거하여 복부 측면에서 뇌를 드러냅니다. 인두 연골과 보조 중간엽을 제거합니다.
그런 다음 뇌 등쪽을 위로 향하게 놓고 뒷뇌의 중간엽 등쪽을 조심스럽게 제거하되 p가 손상되지 않도록 주의합니다. 다음으로, 중뇌와 뒷뇌 사이의 조직을 완전히 절개하여 소뇌를 포함한 뒷뇌를 분리합니다. 소뇌의 측면 접합부와 뒷뇌의 알러판(aller plate) 양쪽 조직에 있는 조직을 완전히 절개합니다.
소뇌 전체를 제거하고 해부 전반에 걸쳐 PIA의 무결성을 유지하도록 주의합니다. 마지막으로, 형성되는 맥락막신경총을 제거하고 절개된 소뇌를 얼음처럼 차가운 HBSS로 이동합니다. 주걱 또는 팁을 잘라낸 3ml 목초지 피펫을 사용하여 소뇌 전체를 조직 다지기의 멸균 플랫폼으로 옮깁니다.
조리개를 넓히려면 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오. 티슈 다지기의 절단 속도를 최대값의 50%로 설정합니다. 그런 다음 300 밀리리터 목초지 피펫을 사용하여 300 마이크로 미터 두께로 필요한 방향으로 소뇌를 자릅니다.
얇게 썬 소뇌를 차가운 HBSS로 덮습니다. 그런 다음 절단 팁이 있는 3리터 목초지 피펫을 사용하여 HBSS와 슬라이스를 20밀리리터의 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어 있는 60mm 페트리 접시로 옮기고 광섬유 광원으로 조명되는 해부 현미경 아래에 페트리 접시를 놓습니다. 그런 다음 워치메이커 집게를 사용하여 뇌 조직의 개별 절편을 분리하고 조직의 무결성과 매체의 측면 위치를 기준으로 전기천공할 절편을 식별합니다.
전기의 양극을 60mm 페트리 접시의 바닥에 고정하여 electroporation 챔버를 구성합니다. 절연 테이프를 사용하여 전극을 덮기 위해 약 1ml의 HBSS를 추가합니다. 다음 장소는 0.4마이크로미터 배양입니다.
HBSS로 덮인 전극 위에 삽입합니다. 절단 팁이 있는 3ml 목초지 피펫을 사용하여 식별된 슬라이스를 인서트당 최대 5개까지 배양 인서트로 옮깁니다. 그런 다음 조각을 분리하여 배양에 정착시키십시오.
시상 방향으로 삽입합니다. 피펫을 사용하여 뇌 절편에서 과도한 배지를 제거합니다. 삽입물과 전극 사이에 접촉이 있도록 삽입물이 전극에 놓이도록 합니다.
이 설정에서. 슬라이스가 있는 배양 삽입물은 매체의 표면에 놓여 회로를 유지하지만 음극의 공간적 표적화를 허용합니다. P 10 피펫 팁 피펫을 사용하여 각 슬라이스의 표적 영역 표면에 20% 빠른 녹색으로 희석된 5마이크로리터의 DNA를 사용합니다.
패스트 그린(fast green)을 첨가하면 DNA 용액이 DNA가 광범위하게 분산되는 것을 방지할 수 있을 만큼 점성이 있습니다. 그런 다음 원하는 표적 조직의 음극을 놓고 샘플을 전해질합니다. 음극을 실제로 건드리지 않고 가능한 한 조직에 가깝게 두어 음극이 조직과 직접 접촉하지 않도록 하십시오.
원하는 대로 각 개별 소뇌 절편에 있는 외부 과립층의 여러 영역에서 전기천공을 반복합니다. 완료되면 배양 인서트를 각 배양물에 30mm 페트리 접시로 옮깁니다. 배양 인서트 아래에 1ml의 예열 배양 배지를 추가합니다.
인서트가 매체에 뜨지 않도록 하십시오. 배양 삽입물은 매체와 접촉해야 하지만 슬라이스를 그 안에 담그면 안 됩니다. 최대 3일 동안 배양물을 배양하여 모든 배양을 교체합니다.
24시간마다 배지를 신선한 예열, 중간 추종 배양으로 섭취하십시오. 배양 삽입물의 슬라이스를 4% 파라 포름알데히드가 포함된 30mm 접시에 1시간 동안 옮깁니다. 배양 위에 파라 포름알데히드를 첨가하십시오.
고정되면 삽입하십시오. PBS에서 각각 5분씩 세 번 씻습니다. 그런 다음 안과 가위를 사용하여 배양물에서 전기로 촬영되고 배양된 소뇌 절편 각각을 해부합니다.
각 슬라이스 주위를 자르고 인서트의 부착된 영역과 함께 제거하여 삽입합니다. 인서트 표면에서 슬라이스를 제거하려고 하지 마십시오. 기포가 생기지 않도록 주의하면서 커버 슬립 아래에 선택한 장착 매체의 약 1ml에 슬라이스를 장착합니다.
슬라이드가 건조되면 슬라이드를 수집하고 레이저 스캐닝을 사용하여 이미지화합니다. 컨포칼 현미경 칼빈딘. E 14 소뇌 조직의 염색은 in vitro 1일, 2일, 3일에 대조군 GFP 플라스미드로 전기천공을 한 후 빨간색으로 표시됩니다.
일관된 칼빈딘 염색은 체외에서 최소 3일 동안 배양에서 조직 무결성이 유지됨을 보여줍니다. 다음은 다양한 위치에서 외부 과립층으로 성공적으로 전기천공된 RFP 및 GFP 인코딩 플라스미드의 저배율 이미지입니다. GFP 플라스미드는 별표로 표시된 바와 같이 단일 fum을 표적으로 했습니다.
예를 들면 8 0 1 인핸서에 의해 구동되는 GFP를 인코딩하는 구조체가 외부 과립층으로 전기천공된 예가 나와 있습니다. 8 0 1의 발현은 외부 과립층 내의 과립 세포 전구체를 정의합니다. 다양한 세포 형태학이 in vitro 3일에서 명확하게 볼 수 있으며 세포 거동을 모니터링할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 과립 세포 발달을 관찰하고 조작하기 위해 다양한 유전 도구를 사용하여 개별 소뇌 절편을 선택하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 조직의 구조적 무결성 및 Perkin 세포 또는 Bergman gl Once Mastered와 같은 다른 세포 유형의 상대적 위치에 대한 추가 질문에 답하기 위해 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 제대로 수행된다면 12개의 닭 배아에 대해 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
본 연구는 ex vivo 전기 침투법을 사용하여 병아리 소뇌의 외부 과립층을 대상으로 유전자 변형을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 통해 뇌 발달의 중요한 기간 동안 과립 세포의 형태 및 행동을 검토하고 수정할 수 있습니다.
Spatially targeted ex vivo electroporation of chick cerebellar slices enables precise genetic manipulation of granule cell precursors, supporting mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation. This approach provides a controlled system for dissecting proliferation and differentiation pathways relevant to pediatric brain tumor origins and cerebellar development. The method's adaptability across species enhances its value for comparative and translational neuroscience pipelines.
This ex vivo electroporation method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and phenotypic analysis in cerebellar tissue slices.