애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석 생체

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 애기장대 세포의 염색질에서 단백질과 DNA 사이의 상호 작용을 밝히는 것입니다. 이 방법은 어떤 유전자가 주어진 전사 인자에 의해 조절되는지 또는 어떤 시스템 변형이 유전자의 전사 상태와 관련이 있는지와 같은 식물 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가교 단계를 통해 식물 발달 중에 발생하는 염색질 조직의 변화를 수정하고 캡처할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 애기장대 탈리아나(arabidopsis thaliana)의 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 식물 목에 적용하고 다른 식물 종에 적용할 수도 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 두 명의 박사 과정 학생인 Dorota Komar와 Alfonso Mouriz입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 애기장대를 배양한 후 50ml 튜브에 1.5g의 식물 재료를 수집하고 가교 중에 얼음 위에 보관합니다.

그런 다음 실험실에서 가열된 바늘을 사용하여 튜브 뚜껑에 작은 구멍을 뚫습니다. 튜브에 40ml의 1x pbs와 1.08ml의 포름알데히드를 추가합니다. 튜브의 뚜껑을 나사로 조이고 튜브를 데시케이터에 넣습니다.

10분 동안 진공 침투한 다음 용액이 휘젓지 않도록 조심스럽게 진공 청소기를 해제하십시오. 샘플을 혼합한 후 진공 및 혼합 단계를 반복합니다. 침투 시 식물 재료를 관찰하고 약간 반투명해지고 튜브 바닥으로 가라앉는지 확인하십시오.

2.5ml의 2몰 글리신을 최종 농도 0.125몰에 추가하고 5분 동안 진공을 적용합니다. 진공 청소기를 해제한 후 튜브를 뒤집어 뚜껑의 구멍을 통해 떨어지도록 하여 용액을 버리십시오. pbs를 사용하여 식물을 두 번 헹구고 물로 한 번 헹굽니다.

그런 다음 액체 질소를 사용하여 얼리기 전에 종이 타월로 식물을 말리십시오. 각 면역 침전마다 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 15마이크로리터의 자기 비드를 준비합니다. 1ml의 염색질 면역침전 또는 칩 희석 완충액을 비드에 첨가하고, 회전하여 혼합한 다음, 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.

비드가 자석에 약 1분 동안 부착되도록 한 후 세척을 반복하기 전에 피펫맨을 사용하여 상층액을 제거합니다. 200마이크로리터의 칩 희석 버퍼에 비드를 다시 현탁시킵니다. 면역침전을 위해 각 식물 블라인드에 대해 준비된 두 개의 튜브 중 하나에 필요한 양의 특정 항체를 추가합니다.

성공적인 chip 실험의 핵심 요소는 관심 단백질의 면역침전을 위해 선택된 항체입니다. 식물 전사 인자에 대해 제기된 항체는 칩 실험에 유용할 수 있지만 혈청은 철저한 테스트가 필요합니다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에서만 확인된 항체가 chip에 반드시 유효한 것은 아닙니다.

음성 대조군으로 두 번째 튜브에 동일한 양의 비특이적 IGG를 추가합니다. 항체가 비드에 부착될 수 있도록 회전하는 바퀴에서 밤새 섭씨 4도의 튜브를 배양합니다. 모르타르와 절구를 사용하여 분말이 균일하고 연한 녹색이 될 때까지 냉동 식물 재료를 액체 질소에 철저히 분쇄합니다.

분말을 새 50ml 튜브로 옮깁니다. 흄 후드 아래에 추출 버퍼 30 ml를 넣고 티슈 파우더가 젖도록 잘 섞습니다. 이 단계부터 샘플을 항상 섭씨 4도로 유지하고 계속 진행하기 전에 조직이 완전히 해동되었는지 확인하십시오.

기공 크기가 22-25마이크로미터인 여과 조직을 통해 새로운 50ml 튜브에 슬러리를 통과시켜 슬러리를 제거합니다. 그런 다음 1, 000 번 g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리기를 사용하십시오. 펠릿에서 상등액을 부드럽게 기울입니다.이 상등액은 약 2 밀리리터 부피가 되어야 합니다.

5ml의 추출 버퍼 2로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 10분 동안 1, 000회 g 및 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 상등액을 디캔팅한 후 펠릿을 300마이크로리터의 추출 완충액 3에 다시 현탁시킵니다.

별도의 튜브에 600마이크로리터의 추출 버퍼 3을 추가한 다음 다시 부유한 펠릿을 깨끗한 버퍼 위에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 16, 4 섭씨 온도에 g 1 시간 동안 관을 원심 분리기, 피펫을 가진 상층액의 흡인에 선행하는. 다음으로, 300 마이크로 리터의 초음파 처리 버퍼를 사용하여 핵 펠릿을 천천히 다시 현탁시켜 초음파 처리 효율에 영향을 줄 수있는 기포 형성을 피하십시오.

서스펜션을 깨끗한 1.5ml 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 현탁액을 초음파 처리하여 핵을 용해시키고 염색질을 200 - 600개의 염기쌍 단편으로 무작위로 공유합니다. 아가로스 젤에 DNA 파편 크기를 확인하고십시오, 그 후에 12, 000 시간 g 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 해결책을 회전시키십시오.

상등액을 새 1.5ml 튜브에 옮기고 펠릿을 버립니다. 상층액의 10분의 1을 새 튜브에 분취하고 섭씨 영하 20도에서 얼기 전에 입력으로 표시합니다. 마지막으로, 칩 희석 완충액에서 염색질을 10배 희석하여 0.1%의 최종 SDS 농도를 달성합니다.

그런 다음 샘플을 얼려 섭씨 영하 20도에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 하룻밤 동안 항체로 비드를 배양한 후 1ml의 칩 희석 완충액을 사용하여 비드를 세 번 세척한 다음 희석된 염색질 1ml에 비드를 다시 현탁시키고 섭씨 4도의 회전 휠에서 밤새 튜브를 배양합니다. 다음 날, 구슬을 섭씨 4도의 마그네틱 랙에 놓고 용액을 제거한 후 1ml의 저염 세척 버퍼를 사용하여 비드를 두 번 세척한 다음 고염 세척 버퍼를 사용하여 비드를 한 번 세척합니다.

1ml의 염화리튬 세척 버퍼를 사용하여 비드를 한 번 세척한 후 1ml의 TE 버퍼를 사용하여 비드를 두 번 세척합니다. TE 세척 버퍼를 완전히 제거하려면 흡입하십시오. 입력 샘플이 해동되면 각각 5마이크로리터를 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고 앞으로 칩 샘플과 유사하게 처리합니다.

200마이크로리터의 5% 킬레이트 이온 교환 수지를 첨가하여 가교를 역전시키고 섭씨 95도에서 2-3분마다 흔들어 10분 동안 배양합니다. 30초 동안 16, 000회 g에서 스핀다운하고 상층액을 새 마이크로분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 1밀리리터당 10밀리그램의 프로토나제 K 2마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 단백질을 소화하고 DNA를 방출합니다.

반응을 멈추기 위하여는, 10 분 동안 95 섭씨 온도에 외피하고, 16, 30 초 동안 000 시간 g에 빨리 회전시키고, 새로운 관으로 상등액을 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 세척한 후 1에서 10까지 물로 희석하고 반응당 5마이크로리터를 사용하여 qPCR에 의한 결합 부위의 풍부도를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다.

아리비도프시스(Aribidopsis) 잎은 왁스 층으로 덮여 있고 상체(trichome)는 기포 형성을 선호하는데, 이 두 가지 모두 가교 시약이 식물 조직에 침투하는 것을 어렵게 만듭니다. 여기에 표시된 것은 고정 효율을 높이기 위해 진공 가교 결합된 가교 묘목 샘플입니다. 이 그림은 초음파 처리 주기의 수가 증가하면 칩 샘플에서 DNA의 평균 크기가 점진적으로 감소하여 20 - 30 주기 후에 200 - 600 염기쌍 범위에서 최적의 농축에 도달한다는 것을 보여줍니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 개화의 마스터 유전자인 FT 유전자의 전사 조절에 중요한 4개의 영역이 분석을 위해 선택되었습니다. 칩 결과는 EBS 단백질이 테스트된 4개 영역 중 하나, 즉 FT의 전사 시작 부위에 가까운 조절 서열을 결합했음을 보여줍니다. 마지막으로, 전사 활성 염색질과 상관관계가 있는 lysines 9 및 14에서 히스톤 h3 아세틸화된 항체를 사용하여 수행된 칩 분석은 이 돌연변이에서 꽃이 피는 이 마스터 유전자의 관찰된 상향 조절과 일치하는 테스트된 FT의 4가지 게놈 단편 모두에서 야생형 식물에 비해 돌연변이 DBS에서 H3K9/14ac의 더 높은 함량을 보여주었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

유전자 발현 분석과 같은 다른 조치와 함께 이 절차를 따르면 다음과 같은 다른 질문에 답하는 데 기여할 수 있습니다. 단백질과 DNA에 결합하는 생물학적 역할은 무엇입니까? 전사 활성화(transcriptional activation)인가 억제(repression)인가? 그리고 어떤 히스톤 변형이 연관되어 있습니까?

개발 후, 이 기술은 식물 후성 유전학 분야의 연구자들이 환원 세포의 염색질 상태를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 그리고 이것은 다른 식물 종으로 확장될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 in vivo에서 DNA에 대한 관심 aribidopsis 단백질의 결합을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

2-메톡시에탄올, 포름알데히드 또는 초음파 처리기 시약, 병원균 및 줄기 돌연변이를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 사용하는 동안 항상 보호복, 장갑 또는 청력 보호구와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.