Name: 애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis에서 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 염색질 면역 침전 분석법을. 이 기술은 식물 유전자 조절 메커니즘을 밝히고 발달 중 염색질 변화를 포착하는 데 활용됩니다.

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저자는 그림 4에 설명된 대표적인 결과를 정교화하기 위해 이 저널에 발표된 일부 데이터를 사용할 수 있도록 허용한 The Plant Cell에 감사를 표합니다. 이 작업은 EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS(보조금 계약 316965)와 스페인 경제부 장관(보조금 BIO2010-15589 및 BIO2013-43098-R)의 지원을 받았습니다.

식물 재료 1. 가교 (1 시간) <ol><li> 애기 실험에 사용 된 선 성장 (- WT - 야생형 돌연변이 대를, 및 / 또는 태그를 표현하는 라인 대 관심의 단백질의 태그 버전을 표현하는 라인은 어떤 단백질에 융합되지 않음) 큰 페트리 접시에 12-18일에 대한 (150mm) MS 한천 배지 (1 L : 무라 시게 및 1X 스쿡 염, 10g의 수 크로스, 0.5 g의 MES, pH가 5.7 (KOH), 1 % 아가)와. 토양과 지렁이의 1 혼합 : 또는 3을 포함하는 화분에 식물을 재배한다. 주의! 포름 알데히드는 피부 접촉 및 삼키면, 흡입 독성, 그리고 적절한 개인 보호 장비를 착용 화학 후드에서 처리되어야합니다. 1.2 단계 - 1.6 흄 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 실험실 버너 가열 바늘 50 ㎖ 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 확인합니다. 1 %의 최종 농도로 1X PBS 40 ml를 첨가하고 완충 포름 알데히드 1.08 ㎖ (스톡 37 %의olution). 그 50 ㎖ 튜브에 식물 재료의 1.5 G를 수집합니다. 가교 동안 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 뚜껑 50 ml의 튜브를 닫습니다. 데시 케이 터에 튜브를 삽입하고 진공을 적용합니다. 진공 상태를 10 분 동안 조직을 침투 용액을 휘젓는 않도록 조심스럽게 진공을 해제. 샘플을 섞는다. 두 번 반복합니다. 함침 후, 식물 재료를 관찰하고 약간 반투명하게 확인 및 튜브 (도 2)의 바닥에 가라하는 경향이있다. </li><li> 5 분 동안 진공을 적용 M. 0.125의 최종 농도를 달성하기 위해 2 M 글리신 2.5를 가하여. 글리신은 포름 알데히드 가교 결합의 경쟁 억제제 역할을합니다. </li><li> 뚜껑에 구멍이 폐쇄 된 50ml 튜브를 반전시킴으로써 PBS 알데히드 글리신 용액을 버린다. </li><li> 단계 1.5에 기재된 바와 같이 물이 세정액을 버리고 1X PBS로 두 번으로 한번 묘목을 헹군다. 종이 수건을 건조 및 액체 nitroge에 동결엔. 참고 : 냉동 조직 주 동안 -80 ° C에서 유지 될 수있다. </li></ol> 항체 2. 준비 (1 일) 참고 : 면역 들어, 단백질 G 또는 단백질 항체 중쇄의 불변 도메인에 대한 높은 선호도와 링커를 통해 항체가 결합 자석 구슬의 사용이 권장됩니다. DNA - 단백질 복합체가 비드 - 항체 복합체의 표면에 비특이적으로 부착 할 수있다. 그 때문에, 결합 비특이적 백그라운드를 정량화하는 특이 항체없이 제어를 수행 할 필요가있다. <ol><li> 각각의 면역 들어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 자석 구슬의 15 μl를 준비합니다. 비즈의 양은, 면역 침강과 같은 항체에 사용될 염색질의 양에 달려있다. </li><li> TU를 구슬로 염색질 면역 침전 (칩) 희석액 1 ㎖를 추가 회전에 의해 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심을 배치, 세탁자기 랙에. 구슬 자석에 부착 있도록 약 1 분을 기다립니다. 랙에 여전히 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 두 번 반복합니다. 참고 : 구슬과 항체 (AB) 및 제없이 항체 만 자기 구슬 (무 AB) 제어 한 두 가지 면역 세트가 필요한 각 공장 라인. </li><li> 칩 희석액 200 μL의 비드를 재현 탁. (정확한 희석은 각 Ab의 다릅니다 실험적으로 최적화되어야하거나, 상업 항체의 경우에, 제조업 자의 지시에 따라) 각각의 식물 라인으로 작성된 두 개의 튜브 중 하나에 특정 Ab의 필요한 양을 추가한다. 면역이 샘플을 사용하십시오. 음성 대조군으로서 사용될 다른 튜브에 비특이적 IgG의 동일한 양을 추가한다. </li><li> 항체가 구슬에 연결할 수 있도록 4 ° C에서 회전 바퀴에 O / N을 품어. </li></ol> 3. 염색질 추출 (4 시간) </p&gt; <ol><li> 분말이 균일하고 밝은 녹색이 될 때까지 박격포와 유 봉을 사용하여 철저하게 액체 질소에 냉동 식물 재료를 갈기. 새로운 50 ML 튜브에 분말을 전송합니다. </li><li> 흄 후드에서 3.6, 작업 - 단계 3.2. 추출 버퍼 (1) 30 ㎖ (E × B 형 1)를 추가하고, 조직 분말을 담가 잘 섞는다. 이 단계에서 항상 4 ° C에서 샘플을 유지. 냉동 조직과 액체 질소 먹다 남은 음식은 버퍼가 정지하게됩니다. 튜브를 4 ~ 5 번 매 2 분을 반전시켜 완전히 고정 된 조직을 해동해야합니다. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에서 새로운 50 ML 튜브와 원심 분리기를에 22 ~ 25 μm의 기공 크기를 갖는 여과 조직을 통해 전달하여 슬러리의 선택을 취소합니다. 주 :이 단계에서, 모든 핵 소기관 펠렛 것이다. E × B 형 (1)는 높은 밀도를 제공하고 소기관 구조의 붕괴를 방지하기에 충분한 수 크로즈를 포함한다. </li><li> 부드럽게 경사 분리하여 상층 액을 제거합니다. 이 역에서GE는, 약 2 ML의 녹색 펠렛을 관찰합니다. </li><li> E × B 형 5ml에 펠렛을 재현 탁 펠릿 2. 부유이 시점에서 어렵다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 참고 : E × B 형이 1 % 트리톤 X-100이 열려 엽록체 버스트와 엽록소를 제거하는 데 도움이 포함되어 있습니다. </li><li> 추출 버퍼 3 (E × B 형 3) 300 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 깨끗한의 microfuge 관에서, E × B 형 3. 600 ㎕의 단계 3.6에서 재현 탁 펠렛을 가지고 신중하게 깨끗한 E × B 형 3의 상단에 레이어 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 16,000 XG에 1 시간 동안 스핀. 참고 :이 단계는 샘플에서 세제를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫으로 흡입하여 상층 액을 제거합니다. 천천히 초음파 효율에 영향을 미칠 수있는 기포 형성을 방지하기 위해 위아래로 피펫 팅에 의해 초음파 처리 완충액 300 μL의 핵 펠렛을 재현 탁. 조심스럽게 모든 서스펜션을 피펫 깨끗한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 참고 :이버퍼는 핵을 용균과 염색질을 해제, SDS가 포함되어 있습니다. </li><li> 핵을 용균 무작위로 작은 조각으로 염색질을 전단 할 수있는 현탁액을 초음파 처리. (자료 / 시약의 표에 설명 사용할 수있는 초음파 장치에 대해 4 ° C에서 설정 30 초 ON / 30 초 OFF로 20 ~ 30 회)를 200-800 BP 사이의 조각이 풍부한 염색질을 렌더링 초음파 조건을 사용합니다. 초음파 염색질의 2 μL (그림 3)로드, 아가 로스 겔 (13)에 얻어진 DNA 단편의 전기 영동 분리에 의한 초음파의 효율성을 확인합니다. 주의! 초음파 장치가 방음 캐비닛에 포함되지 않은 경우 초음파 단계에서 귀 보호 장비를 착용해야합니다. 중요한 단계는! 염색질의 분열은 주로 초음파 장비에 따라 달라집니다. 초음파 처리 조건은 적절한 크기의 DNA 농축을 달성하도록 조정되어야한다. 만나다염색질 단편화를 최적화하는 방법의 예를 들면도 3. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 한 번 용액을 스핀. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 피펫으로 상층 액을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청 1/10을 -20 ° C에서 입력 및 동결로 표시. </li><li> 0.1 %의 최종 농도 SDS를 희석 칩 희석 버퍼 염색질 10 배 희석. 참고 : 시료는 냉동 및 몇 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 관심의 단백질과 DNA의 구조 4. 면역 침전 (1 일, 3 시간) <ol><li> 단계 2.2에 기재된 바와 같이 항체의 잉여를 제거하는 칩 희석액의 1 ml의 단계에서 2.4 세 번 구간 코팅 비드를 세척 하였다. 칩 희석액 200 μL에 재현 탁. 고립 된 염색질의 50 μl를 추가합니다. 4 ° C에서 회전하는 바퀴에 O / N을 품어. 주 : concentrati 확인microvolume UV - 마주 분광 광도계에서 염색질의에. 고립 된 염색질의 50 μL은 DNA의 10 μg의를 포함해야합니다. </li><li> 4 ° C가 단계 4.2-4.5 작업. 단계 2.2에 설명 된대로 낮은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 높은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> LiCl을 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> TE 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 후, 완전히 피펫으로 흡입하여 튜브에 남아있는 TE 버퍼를 제거해야합니다. </li><li> 입력 샘플 (단계 3.9)를 꺼냅니다. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송 입력의 5 μl를하고 칩 샘플로 계속합니다. 5 %의 킬 레이팅, 이온 교환 수지의 200 μl를 첨가하여 가교 역마다 2-3 분간 진탕 95 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 30 초 동안 16,000 XG에 스핀 다운 조심스럽게 피펫 팅하여 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 참고 : TRA 동안반전 가교 ditional 방법 그러므로 프로토콜 일일 짧게 만드는 효율적인 decrosslinking 10 분간에 DNA 용출 허용 염화나트륨, 95 ° C에서 킬레이트 이온 수지와의 인큐베이션과 O / N 항온 처리를 포함한다. </li><li> 프로 테이나 제 K의 2 μL (10 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 30 분간 단백질을 소화와 DNA를 분리하기 위해, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 10 분 동안 95 ℃에서 배양하여 반응을 정지. </li><li> 빠르게 30 초 동안 16,000 XG에 스핀과 피펫 팅하여 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> DNA는 표준 DNA 단편을 정제 키트를 사용하여 분리 청소. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 진행합니다. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 키트에서 DNA 결합 열을 전송합니다. 컬럼의 중심으로의 DNase없는 물 20 μl를 첨가하고 60 초 동안 16,000 XG에서 회전시켜 DNA를 정제하여 용리. 포인트를 중지 샘플 몇 주 동안 -80 ° C에 저장 될 수있다. </li></OL&gt; 5. qPCR에 의한 면역 DNA에 결합 부위의 풍요를 측정 (4 시간) 참고 : 침전 된 염색질에서 분리 된 DNA는 인해 관심의 단백질에 결합으로, 총 염색질에서 칩 에드되었습니다하는 DNA 단편을 결정하기 위해 분석되어야한다. <ol><li> 60 ° C의 융점 (Tm)이 ​​30 % -80 %의 GC 함량을 갖는 관심 영역 게놈 디자인 프라이머. 염색질은 초음파 처리에 의해 단편화 된 바와 같이, 증폭 된 서열의 길이는 150-200 뉴클레오티드 (표 1) 이상이어야한다. 참고 : 프라이머 디자인을위한 유용한 도구가 프라이머 3 프로그램 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 프라이머 디자인에 대한 추가 가이드 라인은 14, 15, 이전 보고서 8에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 프라이머가 특정되어 있는지 확인하기 위해 BLAST 프로그램을 사용하여 (특히 프로모터 시퀀스 결합 비슷한 TF를 공유 할 수 있습니다) 및 프라이머 효율 날기를 테스트g 입력 DNA (단계 4.9)의 1:10 희석 물. 게놈의 특정 영역은 다른 사람보다 더 정제 될 것입니다. 이는 PCR 프라이머를 설계하고, 입력 희석 DNA 그들을 체크하는 것이 중요하다. </li><li> 각 PCR 반응 용 튜브에 피펫으로 물과 희석 DNA 5 μl를 정제 된 DNA 1:10 희석. 주 : DNA는 1.5 ml의 마이크로 원심 관의 벽에 부착 할 수로서, 필요한 양만 희석. 여러 동결 해동 사이클 부착 DNA 분자의 수를 증가시킨다. 입력의 각 프라이머 쌍, 증폭를 들어, AB-칩과 무 Ab의 칩을 분석해야한다. </li><li> PCR 믹스를 완료하기 위해, 1X의 최종 농도 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 추가하고, 각 프라이머의 0.5 μM. DNase의없는 물 20 μL까지 채 웁니다. </li><li> SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 반응을 수행합니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 참고 : 전 중칩 데이터를 분석하는 방법을 isting, 두 사람은 가장 일반적으로 사용된다. 그 중 첫 번째는 &#39;노 항체 컨트롤을 기준으로&#39; &#39;상대 농축&#39;, &#39;배경 위에 신호&#39;또는로 명명 배 농축 방법이다. 두 번째 방법은 &quot;입력 %&quot;로 지정됩니다. <ol><li> 배 농축 방식에 의한 데이터 분석. <ol><li> qPCR의 반응 후의 된 샘플의 이름과 원시 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다. </li><li> 각 샘플에 대해, 원시 형 Ct 값에서 대응하는 AB 급 제어 얻어진 원료 코네티컷 값을 뺀다. 참고 :이 수학 연산 한 후, 노 구간 샘플에 대한 코네티컷 값이 0과 동일합니다. </li><li> 기본 2 단계 6.1.2 (표 2)에서 얻은 부정적인 나머지 동일한 지수 (전원)와 지수의 조작에 의해 배 농축을 계산합니다. 농축 배 = 2 - (CT (샘플) - 코네티컷 (무 AB)) 참고 :이 운전 방식에서D 칩 에드 샘플에서 특정 DNA 단편의 풍부가 더-Ab의 제어에서이 조각의 풍요 로움과 비교된다. 이 방법의 가정은 배경 신호의 레벨이 다른 프라이머 세트, 샘플 및 복제 실험 간 재현성이라는 것이다. 그러나,이 &#39;noise&#39; 신호 레벨은 프라이머 세트, 샘플 및 실험 사이에서 변할 않는다. </li></ol></li><li> 입력 방법의 %의 데이터 분석. <ol><li> 샘플 이름과 qPCR에 반응 후에 얻어 된 원료 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다. </li><li> 입력으로 하였다 염색질의 총 추출 분획으로부터 대수베이스 (2)의 값을 감산하여 입력 샘플들에 대한 원시 형 Ct 값을 조정한다. 참고 : 전체 염색질의 10 %가이 프로토콜의 입력으로 하였다으로 감산 값이 3.32에 해당이 프로토콜에서. 로그인 2 (10) 3.32 같습니다. </li><li> B (100)와 지수 연산의 값을 승산함으로써 입력의 %를 계산ASE (2) 및 시료 (표 3)의 원료 코네티컷 값으로부터 감산 조정 된 입력 값들의 나머지와 동일한 지수 (전력). 입력의 % = 100 * 2 (조정 입력 - 코네티컷 (샘플)) 참고 :이 절차로, 총 격리 된 염색질 (입력 샘플)에 칩 에드 샘플의 특정 DNA 풍부 사이의 관계가 계산됩니다. 칩 데이터 분석에 대한 더 자세한 사항은 해링 등. 8에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명 된 칩 프로토콜은 아라비돕시스 식물의 생체 내에서 단백질과 특정 DNA 서열 사이의 상호 작용을 분석 재현성 강력한 기술이다. 관심의 단백질 결합 부위의 성공적인 식별 관련 상호 작용이 실제로 일어나고있는 식물 기관 또는 발달 단계의 적절한 선택이 필요합니다. 또, 식물 재료의 적절한 고정 및 초음파 처리에 의해 최적의 염색질의 전단을 수득하는 것이 중요하다. 선택한 단백질 / 태그의 효율적인 면역에 매우 특이 항체는 필수적이다. 식물 칩 방식의 사용은 잠재적으로 상이한 프로토콜 단계를 방해 할 수있는 이차 대사 산물 및 셀 벽의 존재와 관련된 어려움에 직면 해있다. 또한, 식물 기관의 복잡성은 종종 다수의 세포 유형을 함유 여기서 INT의 DNA 결합 단백질erest가 차등 존재하거나 활성화 할 수 있습니다,이 방법의 사용을 방해했다. 이 칩에 사용하는 것이 가장 바람직하다 가능한 그 이유로, 관심 단백질의 존재 및 / 또는 활성은 이미 입증되었...

최근 몇 년 동안, 분자 적 유전자 및 게놈 툴의 다양한 모델 종 애기 장대에서 개발되어왔다. 이 기술은 식물 개발을 규제하는 방법을 이해하는 엄청난 발전을 촉진했다. 모델로 애기 장대를 이용하여 연구 개발 과정 중, 꽃이 피는 시간의 유전 적 제어가 광범위하게 분석하고있다. 이 연구는 식물은 호르몬과 식물의 나이 내생 단서에 대한 응답으로 꽃을 매우 정밀하게 시간을 조절하는 것으로 나타났습니다, 또한 시즌 1의 자연주기와 시간을 꽃 동기화 등 광주 및 온도 등의 환경 신호에, 2. 개화시기의 변화와 애기 돌연변이의 분리 및 특성 규명은 내인성 및 환경 인자에 응답하여 개화시기를 조절하는 유전자의 복잡한 네트워크를 공개에서 결정되었다. 이 유전자 회로는꽃의 스위치로서 작용 몇 마스터 유전자 수준에서 통합 및 꽃 개시의 정확한 타이밍은 개화 촉진 및 꽃 적분기 유전자 1,3 상류 작업 활동을 억압의 균형에 의존한다. 게놈 접근의 최근 사용에 의해 원조 꽃 개시의 제어에서의 역할에 대해 확인 된 유전자의 기능적 특성은, 꽃이 피는 시간의 변조에 전사 조절의 중심 역할을 계시했다. 사실, 꽃 인코딩 전사 마스터 유전자의 대부분은 4 요인. 또한, 크로 마틴 리모델링 단백질 복합체의 수는 개화 마스터 유전자의 발현에 영향을 미친다. 자신의 변경된 꽃 시간 동안 고립 된 애기 장대 돌연변이 체의 수는 염색질 수정의 다양한 암호화하는 유전자의 돌연변이를 가지고 밝혀졌다. 히스톤의 번역 후 변형을 소개 다른 염색질 remodelers전자 꼬리는 DNA에 비해 뉴 클레오의 위치를 변경하거나 애기 5,6에서 꽃의 적절한 규제 히스톤 변형에 의해 필요한 표준 히스톤을하고 있습니다 교환한다. 이 크로 마틴 리모델링 활동 중 일부는 증착 또는 특정 히스톤 잔류 물에 아세틸 또는 메틸화와 같은 공유 수정의 제거를 촉진. 이러한 히스톤 마크는 특히 꽃 유전자의 전사 활성을 조절하는 다른 크로 마틴 리모델링 복합체, 전사 인자 또는 전사 기계의 구성 요소를 모집 전문 이펙터에 의해 인식됩니다. 염색질 면역 침전 (칩)는 생체 내 DNA 결합 관심의 단백질 사이트를 (그림 1)의 확인을 할 수 있습니다. 이 절차는 DNA에 크로스 링크에 특정 화학 물질의 기능의 단백질을 이용한다. 얻어진 DNA 단백질 복합체는 다음 AGA 특정 항체를 이용하여 면역 침전 될 수있다이달 전사 인자, 염색질 - 결합 단백질, 또는 특정 변형 및 이종 에피토프는 원하는 단백질을 부착 (일반적으로 &quot;태그&quot;라 함). 이러한 immunoprecipitates로부터 정제 DNA는 관심있는 특정 서열의 엔리치 평가하기 위해 정량적 PCR (qPCR에) 반응에서 주형으로서 사용될 수있다. 이러한 방식으로, 전사 인자의 결합 부위 또는 특정 유전자 히스톤 마크들의 분포는 7,8를 설립 할 수있다. 또한, 대규모 병렬 시퀀싱을 가능 차세대 시퀀싱 (NGS)와 결합 칩 기술은 전사 인자의 결합 부위뿐만 아니라 히스톤 변형 공개 에피 지노믹스 풍경 게놈 전체의 식별을 가능하게하고있다. 또한, 유전자 발현의 동시 분석을 전사 조절기의 결합 또는 특정 히스톤 마크 증착 activi 전사와 상관 관계가 어떻게 모니터링 허용유전자 (9)의 타이. 애기 장대의 칩 프로토콜의 사용은 전사 레귤레이터 다양한 염색질 개화 마스터 유전자의 조직 및 방법이 구조적 변화는 유전자 발현에 영향을 5,6에 미치는 영향을 평가할 수있다. 이전 결과 짧은 일 애기 궤적 조기 BOLTING (EBS)이이 유전자 쇼에서 꽃과 꽃 FT의 마스터 유전자의 상향 조절의 가속도를 꽃과 돌연변이의 억제 자 역할을 것을 보여 주었다. 또한, FT의 기능 상실 돌연변이는 완전히 FT는 EBS 돌연변이 조기 개화과 EBS 10 꽃이 마스터 유전자의 억제에 필요한 것으로 요구 된 것을 나타내는, EBS 돌연변이 식물의 개화 표현형을 억제 , 11. EBS는 특히 히스톤 H3의 디 바인딩과 일에 트라이 메틸화 수있는 PHD-포함하는 단백질을 암호화FT (12)의 크로 마틴 매개 억압에서 EBS의 역할을 제안하는 전자 라이신 4 잔류 물 (/ 3 H3K4me2). 칩 방식의 사용은 애기 PHD 함유 단백질 EBS 10,11는 식 (12)을 억제하는 꽃 적분기 FT 유전자의 조절 영역을 결합하는 것을 보여 주었다. 칩 기술을 이용하여 만들어진 추가의 데이터는이 단백질이 애기 개발의 초기 단계에서 꽃이 마스터 유전자의 크로 마틴의 히스톤 아세틸 화, 활성화 된 전사의 특징 인 낮은 수준을 유지하기 위해 요구되는 것으로 나타났다. 함께 유전자 및 유전자 발현 데이터와 이러한 관찰은이 애기 PHD - 함유 단백질이 꽃 적분기 (12)의 FT 유전자 발현을 변조시킴으로써 개화시기의 미세 조정에 중심적인 역할을 가지고 있음을 보여준다. 여기에 제시된 작품은 히스톤의 분석뿐만 아니라 다른 용뿐만 아니라 유용한 최적화 된 방법을 제공염색질은 단백질 관련, 증가 된 효율 및 실험 시간을 단축. 또한,이 보고서 칩 프로토콜의 사용은 애기 장대의 개화의 발병에 유전자 발현 제어 충격이 염색질 - 중재 메커니즘 염색질 변형의 변화 및 ​​식물 유전자의 전사 상태 사이의 관계에 새로운 통찰력을 제공하는 방법과 어떻게 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Murashige와 Skoog 기초 소금 혼합물)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 37%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>흄 후드 아래에서 사용</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 믹스 cOmplete ULTRA 정제, 미니, EDTA 프리, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor 표준 초음파 처리 장치</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A 또는 단백질 G Life Technologies와 결합된 Dynabeads 마그네틱 비드</td><td></td><td>10003D/10001D</td><td>제조사 확인 항체 친화도</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps 세제 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr><tr><td>(마우스, 쥐, 토끼&hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>자기 랙 - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac 다클론 항체 - 프리미엄&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteina K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag 항체, 클론 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

애기 장대 단백질 dna 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

복잡한 유전자 조절 네트워크는 식물의 생물학적 과정과 발달 전환을 조율합니다. 유전자의 선택적 전사 활성화와 침묵은 환경 신호와 발달 신호에 대한 식물의 반응을 매개합니다. 따라서 식물 유전자 발현을 제어하는 메커니즘에 대한 통찰력은 식물에서 생물학적 과정이 어떻게 조절되는지에 대한 깊은 이해를 얻는 데 필수적입니다. 여기에 설명된 염색질 면역침전(ChIP) 기술은 모델 종 Arabidopsis thaliana의 유전자 또는 게놈 영역에서 단백질의 DNA 결합 부위를 식별하는 절차입니다. 전사 인자(transcription factor), 염색질 단백질(chromatin protein) 또는 번역 후 변형된 히스톤 버전과 같은 관심 단백질의 DNA와의 상호 작용은 ChIP 프로토콜로 효율적으로 분석할 수 있습니다. 이 방법은 in vivo에서 단백질-DNA 상호 작용의 고정, 염색질의 무작위 단편화, 특정 항체를 가진 단백질-DNA 복합체의 면역침전, PCR 기술에 의한 관심 단백질과 관련된 DNA의 정량화를 기반으로 합니다. 애기장대에서 이 방법론을 사용하는 것은 다양한 식물 생물학적 과정을 제어하는 전사 조절 메커니즘을 밝히는 데 크게 기여했습니다. 이 접근법을 통해 애기장대 염색질 단백질 EBS의 결합 부위를 개화 FT의 마스터 유전자 조절 영역에 확인할 수 있었습니다. FT의 게놈 영역에서 특정 히스톤 마크의 축적에 대한 이 단백질의 영향은 ChIP 분석을 통해서도 밝혀졌습니다.

여덟 가지 주요 단계는 성장하고 식물 재료, 염색질의 가교, 염색질 격리, 염색질의 분열, DNA와의 복합체의 선택적 분리의 수확을 포함 생체 내 단백질 DNA 상호 작용의 식별을 위해이 칩 프로토콜에 선출 될 수있다 면역 침전, 단백질 분해, DNA 정제와 qPCR의 분석 (도 1)에 의해 관심있는 단백질. 칩 프로토콜에서 중요한 단계는 가교 결합 반응에서 DNA - 단백질 상호 작용의 정착이다. 통상적으로, 포름 알데히드 가교 식물 칩에 사용된다. 포름 알데히드는 조직을 침투 DNA 1 6 NH 2 단백질의 그룹 또는 단백질, 뉴클레오티드 사이의 메틸렌 다리를 만듭니다. 생체 내에서 핵 단백질 복합체의 효율적인 정착 포름 알데히드 식물 핵 내의 염색질에 도달해야하고, 그 식물 조직이 완전히 잠기 t에서 필수적인그는 포름 알데히드 버퍼는 면역 중에 단백질-DNA 복합체가 효율적으로 내려 오게되어 있는지 확...

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 애기장대 세포의 염색질 내에서 단백질과 DNA 사이의 상호작용을 밝혀내는 것입니다. 이 방법은 특정 전사 인자에 의해 조절되는 유전자가 무엇인지, 또는 유전자의 전사 상태와 관련된 시스템 수정 사항은 무엇인지와 같은 식물 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가교 결합 단계를 통해 식물 발달 과정에서 발생하는 염색질 구조의 변화를 고정하고 포착할 수 있다는 점입니다.이 방법은 Arabidopsis thaliana의 단백질 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 식물 목에 적용하거나 다른 식물 종에 맞게 조정하여 사용할 수 있습니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 두 박사 과정 학생인 Dorota Komar와 Alfonso Mouriz가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Arabidopsis를 배양한 후, 식물 조직 1.5g을 50mL 튜브에 수집하고 가교 결합(cross-linking) 과정 동안 얼음 위에 보관하십시오.그런 다음, 실험실 버너로 가열한 바늘을 사용하여 튜브 뚜껑에 작은 구멍을 뚫습니다. 튜브에 1x pbs 40 milliliters와 formaldehyde 1.08 milliliters를 넣습니다. 튜브 뚜껑을 돌려 잠근 후, 튜브를 데시케이터에 넣습니다.10분 동안 진공 침투시킨 후, 용액이 소용돌이치지 않도록 주의하며 천천히 진공을 해제합니다. 샘플을 혼합한 후, 진공 및 혼합 단계를 반복합니다. 침투가 완료되면 식물 조직을 관찰하여 약간 투명해지고 튜브 바닥으로 가라앉았는지 확인합니다.최종 농도가 0.125 M이 되도록 2 M glycine 2.5 milliliters를 첨가하고 5분 동안 진공을 가합니다. 진공을 해제한 후, 튜브를 뒤집어 뚜껑의 구멍을 통해 용액이 흘러나오게 하여 제거합니다. pbs로 어린 식물을 두 번 헹구고, 물로 한 번 더 헹굽니다.그 후 액체 질소로 동결시키기 전에 페이퍼 타월에서 식물체를 건조시킵니다. 각 면역침강 반응당, 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 15 µL의 자기 비드를 준비합니다. 비드에 1 mL의 크로마틴 면역침강(ChIP) 희석 완충액을 첨가하고, 회전 혼합한 후 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 마그네틱 랙에 배치합니다.비즈가 자석에 부착되도록 약 1분간 기다린 후, 피펫맨을 사용하여 상층액을 제거하고 세척 과정을 반복합니다. 비즈를 200 µL의 칩 희석 완충액에 다시 현탁합니다. 면역침강을 위해, 각 식물 블라인드에 대해 준비된 두 개의 튜브 중 하나에 필요한 양의 특이 항체를 첨가합니다.성공적인 ChIP 실험의 핵심 요소는 관심 단백질의 면역침전을 위해 선택한 항체입니다. 식물 전사 인자에 대해 제작된 항체는 ChIP 실험에 유용할 수 있으나, 혈청에 대한 철저한 검증이 필요합니다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에서만 확인된 항체가 반드시 ChIP 실험에서도 유효한 것은 아닙니다.음성 대조군으로서, 두 번째 튜브에 동일한 양의 비특이적 IGG를 첨가합니다. 항체가 비드에 결합할 수 있도록 튜브를 회전 휠에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 막자사발을 사용하여 액체 질소에서 냉동된 식물 시료를 가루가 균질해지고 연한 녹색이 될 때까지 철저히 갈아줍니다.분말을 새로운 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 흄 후드 내에서 추출 버퍼 1 30 milliliters를 가하고, 조직 분말이 충분히 적셔지도록 잘 섞어줍니다. 이 단계부터 샘플은 항상 4°C로 유지하며, 다음 단계로 진행하기 전에 조직이 완전히 해동되었는지 확인하십시오.슬러리를 22에서 25 µm 공극 크기의 여과지로 걸러 새로운 50 mL 튜브에 옮겨 불순물을 제거합니다. 그다음 1,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 부피가 약 2 mL 정도인 펠렛으로부터 상층액을 조심스럽게 따라냅니다.5 mL의 추출 버퍼 2로 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 1,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 펠릿을 300 µL의 추출 버퍼 3에 재현탁합니다.별도의 튜브에 추출 버퍼 3 600 µL를 넣은 다음, 재부유시킨 펠릿을 깨끗한 버퍼 위에 조심스럽게 층을 이루도록 얹습니다. 4 °C에서 16,000 ×g로 1시간 동안 원심분리한 후, 피펫으로 상청액을 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 소니케이션 버퍼 300 µL를 사용하여 핵 펠릿을 천천히 재부유시키되, 소니케이션 효율에 영향을 줄 수 있는 기포가 형성되지 않도록 주의합니다.현탁액을 깨끗한 1.5 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 현탁액을 초음파 처리하여 핵을 용해시키고 염색질을 200~600 base pair 크기의 단편으로 무작위로 분절합니다. 아가로스 겔에서 DNA 단편 크기를 확인한 후, 용액을 12,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심 분리합니다.상청액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 펠릿은 폐기합니다. 상청액의 10분의 1을 새 튜브에 분주하고, -20 °C에서 냉동 보관하기 전에 'input'으로 표시합니다. 마지막으로, 크로마틴을 ChIP 희석 완충액으로 10배 희석하여 최종 SDS 농도가 0.1 %가 되도록 합니다.샘플은 영하 20 °C에서 수 주 동안 냉동 보관할 수 있습니다. 비드를 항체와 함께 하룻밤 동안 배양한 후, 1 mL의 칩 희석 버퍼를 사용하여 비드를 3회 세척하고, 비드를 1 mL의 희석된 크로마틴에 재현탁시킨 후 4 °C의 회전 휠에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 비드를 4 °C의 마그네틱 랙에 놓고 용액을 제거한 뒤, 1 mL의 저염 세척 버퍼로 비드를 2회 세척하고, 고염 세척 버퍼를 사용하여 비드를 1회 세척합니다.리튬 클로라이드 세척 버퍼 1 mL를 사용하여 비즈를 한 번 세척한 후, TE 버퍼 1 mL를 사용하여 비즈를 두 번 세척하십시오. TE 세척 버퍼를 완전히 제거하기 위해 흡입하여 제거합니다. 입력 샘플이 해동되면, 각 샘플 5 µL를 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고, 이후 과정은 칩 샘플과 동일하게 처리하십시오.5% 킬레이팅 이온 교환 수지 200 µL를 첨가하여 교차 결합을 해제하고, 2~3분마다 흔들어주며 95 °C에서 10분 동안 배양합니다. 16,000 ×g에서 30초 동안 원심 분리한 후, 상층액을 조심스럽게 새 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 10 mg/mL Proteinase K 2 µL를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양하여 단백질을 분해하고 DNA를 추출합니다.반응을 중단하려면 95 °C에서 10분 동안 배양하고, 16,000 ×g에서 30초 동안 빠르게 원심분리한 후 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 정제한 후, 물로 1/10로 희석하고 반응당 5 µL를 사용하여 qPCR로 결합 부위의 풍부도를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다.애기장대 잎은 왁스 층으로 덮여 있고 트리콤(trichome)은 기포 형성을 촉진하며, 이 두 가지 요인 모두 가교제가 식물 조직에 침투하는 것을 어렵게 만듭니다. 여기에는 고정 효율을 높이기 위해 진공 가교 처리를 거친 유묘 샘플이 제시되어 있습니다. 이 그림은 초음파 처리 횟수가 증가함에 따라 칩 샘플 내 DNA의 평균 크기가 점진적으로 감소하며, 여기서 보여주는 바와 같이 20~30회 처리 후 200~600 base pairs 범위에서 최적의 농축 수준에 도달함을 입증합니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 개화의 핵심 유전자인 FT 로커스의 전사 조절에 중요한 네 개의 영역이 분석 대상으로 선정되었습니다. ChIP 결과, EBS 단백질이 테스트한 네 영역 중 하나인 FT의 전사 개시 부위 근처 조절 서열과 결합하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 전사 활성 크로마틴과 상관관계가 있는 리신 9 및 14번의 히스톤 h3 아세틸화에 특이적인 항체를 사용하여 수행한 ChIP 분석 결과, 테스트한 FT의 네 가지 게놈 단편 모두에서 야생형 식물보다 DBS 돌연변이체에서 H3K9/14ac의 풍부도가 더 높게 나타났으며, 이는 해당 돌연변이체에서 관찰된 개화 핵심 유전자의 발현 상향 조절과 일치합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 안에 완료할 수 있습니다.유전자 발현 분석과 같은 다른 조치들과 함께 이 절차를 수행하면 다음과 같은 다른 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다: 단백질의 DNA 결합이 갖는 생물학적 역할은 무엇인가? 그것이 전사 활성화 단계인가 아니면 억제 단계인가? 그리고 어떤 히스톤 수정과 연관되어 있는가?이 기술의 개발 이후, 식물 후성유전학 분야의 연구자들은 환원 세포 내의 염색질 상태를 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 그리고 이는 다른 식물 종으로도 확장될 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 관심 있는 Arabidopsis 단백질이 in vivo에서 DNA에 어떻게 결합하는지 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.2-methoxyethanol, 포름알데히드 또는 초음파 세척제, 병원체 및 줄기 돌연변이를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호복, 장갑 또는 청력 보호구와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

각인은 식물과 동물의 복제에 현상입니다. DNA의 methylation은 각인의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다. 배젖를 분리 및 각인 유전자의 methylation 상태를...

에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖

특정 식물 유전자 히스톤 수정을 감지하는 신뢰할 수있는 유용한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 접근 방식은 염색질 immunoprecipitation (칩)와 실시간으로 양적 PCR을 결합하여. 그것은 다양한 생리 과정에서 역할과 특정 유전자 히스톤 수정을 감지 수 있습니다.

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한...

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

학습하세요 Arabidopsis에서 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 염색질 면역 침전 분석법을. 이 기술은 식물 유전자 조절 메커니즘을 밝히고 발달 중 염색질 변화를 포착하는 데 활용됩니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석

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