Name: 실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 M1 및 M2 편광 골수 유래 대식세포의 대사 특성을 평가하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 대식세포 대사와 표현형을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

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>jove_content<Jan Van den Bossche는 네덜란드 심장 재단(Netherlands Heart Foundation)으로부터 Junior Postdoc 보조금(2013T003)과 ZonMW(91615052)로부터 VENI 보조금을 받았습니다. Menno de Winther는 네덜란드 심장 재단(2007T067)의 저명한 연구자이며, 네덜란드 심장 재단 보조금(2010B022)의 지원을 받고 있으며, AMC 펠로우십을 보유하고 있습니다. 우리는 또한 네덜란드 심혈관 연구 이니셔티브(Netherlands Cardiovascular Research Initiative), 네덜란드 대학 의료 센터 연맹(Dutch Federation of University Medical Centers), 네덜란드 보건 연구 개발 기구(Netherlands Organization for Health Research and Development) 및 네덜란드 왕립 과학 아카데미(Royal Netherlands Academy of Sciences)의 GENIUS 프로젝트 "죽상동맥경화증에 대한 최상의 증거 기반 제약 표적 생성"(CVON2011-19)에 대한 지원에 감사드립니다. 오픈 액세스 출판을 가능하게 한 Seahorse Bioscience에 감사드립니다. 저자는 이전에 Seahorse 분석기에 대한 모든 도움을 준 Riekelt Houtkooper와 Vincent de Boer(Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands)에게 감사를 표합니다.

1. 배양 및 편광 골수 유래 대 식세포 <ol><li> 날 0 : 관심의 6 ~ 10 주 된 쥐에서 격리 대퇴골과 경골 뼈 (이 분석에서 C57BL / 6). </li><li> 뼈에서 근육 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 9cm의 페트리 접시에 뼈를 배치합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 가득 9cm 페트리 접시에 뼈를 전송하고 부드럽게 30 초 동안 판을 흔들. </li><li> 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 가득 신선한 9cm 페트리 접시에 뼈를 전송합니다. </li><li> 멸균 가위로 양쪽 끝에서 대퇴골과 경골을 잘라. </li><li> 10 ML의 주사기와 25 G 바늘을 사용하여 10 ml의 얼음처럼 차가운 멸균 PBS와 뼈를 플래시합니다. 50 ㎖ 튜브에서 골수를 수집한다. </li><li> 23 G 바늘을 이용하여 새 50 ㎖ 튜브에 골수 세포를 옮긴다. </li><li> 25 G 바늘이 단계를 반복합니다. 참고 :이 단계는 세포 덩어리와 뼈 잔류 물을 제거하기 위해 필요하다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기. </li><li> SUP 폐기ernatant 40 ml의 세포 배양 배지 (RPMI-1640 플러스 2 mM L- 글루타민, 10 % FCS, 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ml) 및 15 % 여과 L-929 세포에서 세포를 재현 탁 ( ATCC, CCL-1) L-929 세포 조정 배지 대신에 M-CSF (또는 대안 10 NG / ㎖ 재조합 M-CSF를 포함 -conditioned 중). 참고 : L-929 세포 조절 매체의 생성을 2013 년 11 초 저널에 설명 된 </li><li> 문화 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시 당 20 ml의 배지에서 두 15cm 페트리 접시 (대 식세포이 플라스틱으로 분리되지 않으므로 세포 배양 처리 플레이트를 사용하지 않는) 한 마우스에서 세포. </li><li> 20 ㎖에게 이전 세포 배양 배지를 제거하지 않고, 제 3 일에 10 ㎖에게 신선한 세포 배양 배지를 추가한다. </li><li> 이렇게 하루 6. 20 ml의 신선한 배양액 각 판의 기존 매체를 대체, 비 부착 세포도 제거됩니다. </li><li> 8 일 : <ol><li> 그들에게 5m를 배양하여 세포를 분리(멸균 H 2 O 135 mM의 염화칼륨 플러스 15 MM의 구연산 나트륨,) 37 ° C에서 10 ml의 구연산 식염수와 10 ml의 PBS로 씻는다. 세포 계수기를 사용하여 8 일째에 성숙한 골수 유래 대 식세포 (BMDM)를 계산. </li><li> 육안 검사 또는 유동 세포 계측법에 의해 성숙의 형성 (CD11b를 + F4 / 80 +) BMDM를 확인합니다. 100 μL PBS에서 20 분 동안 PBS에서 1/100 항 CD16 / CD32와 블록 10 5 세포, 실온에서 항 -CD11b-FITC 1/200 플러스 1/200 방지 F4 / 80-APC-Cy7으로 품어, 세척 및 유동 세포 계측법에 의해 분석한다. 참고 :. 배양 마우스 골수 유래 대 식세포는 잉 등 (11)에 의해 이전이 저널에 자세히 게시되었습니다. </li></ol></li><li> 시드 50,000 세포를 100 μl의 배지에서 세포 배양 용 마이크로 플레이트에 웰 당 (최적의 세포 수는 최적화 될 필요가있다). 배경 보정 우물 (A1, A12, H1, H12)에서 세포를 씨와이 우물 만 매체 (어떤 세포)를 넣어하지 마십시오 팁 :. 각도에서 피펫을 잡고중간에 가장 균일 한 세포 층의 우물의 측면 아래로 한판 승부. </li><li> 세포를 1 시간 동안 세포 배양 후드에서 실온에서 정착 할 수있다. 이것은 세포의 분포를도 홍보하고 가장자리 효과를 줄일 수 있습니다. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 현미경과 문화를 사용하여 준수를 모니터링합니다. </li><li> 세 HR 도금 후, 10 NG / ㎖ LPS 또는 NG 20 / 24 시간 동안 세포를 자극 ml의 IL-4는 각각 M1 또는 M2 식세포를 생성하는 재조합 마우스. 제어와 같은 치료 순진한 (M0) 대 식세포를 포함합니다. IL-6, IL-12의 LPS 유도 된 분비를 측정하여 적절한 M1 및 M2 식세포 편광을 평가 TNF (ELISA) 및 IL-4 유도 된 아르 기나-1 활성 및 / 또는 MMR (CD206) 및 MGL (CD301) 표면 발현 이전 3,11 설명 된대로 (유동 세포 계측법). 참고 :이 시점에서, 세포 (사전)이 될 수있는 다른 요소로 자극 할 수 있습니다 관심 또는 대 식세포의 약리 화합물로 처리 한. 때문에에게 별도의 우물 사이의 변화는 서브 수 있습니다tantial, 그것은 조건 당 최소 4 이상적으로 6 우물을 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 세포 외 플럭스 분석 2. 준비 <ol><li> 일일 분석을 실행하기 전에 센서 카트리지를 수화물 : <ol><li> 다음 유틸리티 판에 거꾸로 센서 카트리지를 놓습니다. </li><li> calibrant 용액 200 μL와 유틸리티 플레이트의 각 웰을 채우고 calibrant 용액에 센서를 침지 유틸리티 판에 센서 카트리지를 하향 조정한다. </li><li> calibrant 솔루션 수준이 아닌 CO 2 37 ° C 배양기 O / N에서 침수 센서와 위치를 유지하기에 충분히 높은 확인합니다. </li></ol></li><li> 다음 분석의 일에 분석 배지를 제조 : <ol><li> 37 ° C에서 따뜻한 50 ㎖ XF 기본 매체. </li><li> 2 mM의 최종 농도를 얻기 위해 500 μL 200 밀리미터 L- 글루타민을 추가합니다. </li><li> 1 N의 NaOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정하고 0.2 μm의 필터를 소독하고 37 ℃에서 분석 매체를 유지합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 편광 식세포에서 세포 배양 배지를 제거하고, 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 보관 (예를 들어 ELISA 적절한 식세포 편광을 조사하기 위해). 100 μL 분석 매체와 세포를 씻으 잘 당 180 μL 분석 매체를 추가하고 세포가 씻겨되지 않은 현미경으로 확인합니다. 분석을 실행하기 전에 1 시간 동안 이산화탄소없이 37 ° C를 인큐베이터에있는 세포 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 37 ° C에, 표 1에 따뜻한 바와 같이 D까지 10 × 주입 화합물의 혼합물을 준비, 7.4 및 필터 소독하여 pH를 조정합니다. <ol><li> 10 배에서 세포 배양 웰에 최종 농도가 이들의 혼합물의 모든 화합물을 확인하고 각각의 세포 유형에 대해 이러한 농도를 최적화한다. </li></ol></li><li> 포트 A, B, C 및 D, respe에서 제조 된 10 배 주입 화합물의 혼합물을 표시된 양 (표 1)과 함께 제공되는 가이드로드를 사용하여 센서 카트리지를 장착ctively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 혼합 / 사출 </td><td> 화합물 </td><td> 볼륨은 10 배 혼합물 (μL)를 얻기 위해 추가 </td><td> 볼륨 분석 중간 (㎖) </td><td> 실행 중에 주입 볼륨 (μL) </td><td> 분석에서 최종 농도 </td></tr><tr><td> 에이 </td><td> 2.5 M (45 %) 포도당 </td><td> (300) </td><td> 2.7 </td><td> (20) </td><td> 25 mM의 </td></tr><tr><td> 비 </td><td> oligomycin 5 밀리미터 (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> (22) </td><td> 1.5 μM </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> 5 mM의 FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> (25) </td><td> 1.5 μM </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM의 나트륨 피루브산 솔루션 </td><td> (300) </td><td></td><td></td><td> 1 밀리미터 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> 5mM의 antimycin (AA) </tD&gt; <td> (15) </td><td> 3.0 </td><td> (28) </td><td> 2.5 μm의 </td></tr><tr><td></td><td> 5 MM의 로테 논 (ROT) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1.25 μM </td></tr></tbody></table> 표 1. 사출의 혼합물을 포함한다. 세포 외 유출 분석기를 사용하여 편광 M1과 M2 BMDM 3. 바이오 에너지 특성화 <ol><li> 2 분 MIX 3 분 법안 시간과 (적어도) 3 혼합 및 속도 측정과 분석 마법사를 사용하여 분석 템플릿을 작성하면 4 주사의 각 전 (표 1)과 마지막 주사 후 반복합니다. 주의 : 이러한 농도는 골수 유래 대 식세포 및 RAW264.7 대 식세포 세포주에 적용되어, 각각의 세포 유형에 대해 최적화되어야한다. FCCP 혼합물에 첨가 피루브산은 호흡의 최대 연료 필요하다. </li><li> 시작 바닥을 눌러 실행을 시작하고 장치의 지침을 따르십시오. 차 우선로드수화 프로브 리지 판은 장치 및 다음로드 셀 플레이트에 의해 보정을 허용합니다. </li><li> 분석 후에,주의 깊게 분석 배지를 버리고 공급자 상세히 기술 된 바와 같이 세포 증식 분석 키트를 이용하여 미래의 휴대 정상화 -20 ° C에서 분석 된 세포 배양 용 마이크로 플레이트를 저장한다. <ol><li> 간단히, 증류수 성분 B 20 배 희석 1 배 세포 용해 완충액을 제조하고 화합물 1X 세포 용해 완충액에 400 배 희석. 물론 당 200 μl를 추가 실온에서 5 분 품어와 ~ 180 nm의 여기와 ~ 520 nm의 방출 최대와 형광을 측정한다. 주 : 비 부착 세포 작업시 또는 불량한 부착이 우려,이 프로토콜은 모든 분석 배지를 폐기 요구하지 않기 때문에 직접적인 세포 증식 키트가 대안으로 이용 될 수있는 경우이다. 그러나,이 직접 프로토콜은이 실험실에서 사용되는 프로토콜에 비해 약간 덜 민감하다. </li></ol></li><li> 형광 측정 한 후, 정상화각각의 세포 수 및 모든 나이브 식세포 웰의 평균 세포 수는 1로 설정되어있는 비율. (예 BCA 분석을 사용하여) 단백질 정량 세포 카운트를 정규화하는 다른 방법으로 사용될 수있다 : 참고. 그러나, 우리의 손이 분석은 세포 증식 분석 키트에 비해 덜 민감했다. </li></ol>

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</ol>

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우리 실험실의 목적은 대 식세포 편광 기능이 죽상 동맥 경화증 및 기타 염증성 조건 (12)의 결과를 향상시킬 수있는 궁극적 인 목표에 영향을받을 수있는 방법을 이해하는 것입니다. 대식 편광을 평가하기 위해, 하나의 전형적 LPS (+ IFNγ) - 유도 및 M1과 M2의 마커 유전자 (qPCR에)의 유전자 발현 IL-4 유도 된 측정은 ELISA에 의해 IL-6, IL-12, TNF 및 NO 분비 (결정 과은 Griess 반응) 및 IL-4에 의한 CD71, CD206, CD273 및 CD301 표면 유동 세포 계측법에 의해 식 ()와 아르 기나 활동 3,13을 검사합니다. 또한, (DII-oxLDL 흡수, LipidTOX 중성 지질 염색) 및 거품 세포 형성 분석 (형광 라텍스 비드 및 / 또는 pHrodo 대장균)와 식세포 작용 분석 (어 넥신 V / PI 염색법으로) 세포 자멸사 분석법에 수행 될 수있다 대 식세포의 기능 (14)을 평가한다. 또한, 세포 외 플럭스 분석 생체 에너지를 편광 MAC의 프로파일을 측정하기 위해 수행 될 수있다새로운 대체 기능 판독으로 rophages. 이 원고 식세포 편광 그들의 에너지 원으로 증가 당분 전환 LPS 유도 된 대 식세포와 대사 리 프로그래밍을 유도하는 것을 나타낸다. 반대로, IL-4에 의한 M2의 대 식세포는 ATP의 주요 소스로 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 사용합니다. 중요한 것은, 대사 재 프로그래밍뿐만 아니라 M1과 M2 편광 대 식세포의 특정 요구 사항에 에너지를 제공합니다. 실제로, 대사 변화는 대 식세포 표현형 10,15,16의 직접 규제이다 대사 산물 농도에 영향을 미친다. 또한 별개의 식세포 편광 상태의 드라이버 (도 2에 여기에 도시 된 바와 같이)이 새로운 기술은 지난 몇 년 동안 immunometabolism 조사 영역의 급속한 성장을 지원 따라서, 식세포 대사뿐만 아니라 특성이다. 그러나, 매크로 대사 프로파일의 강력한 측정파지는 어려운 남아 있고 자신의 한계를 가지고 있었다. 본 연구에서는 세포 외 플럭스 분석기는 견고하게 실시간으로 당분, 당분 보유, 최대 당분 용량, 비 당분 산성화, 기초 및 최대 호흡, ATP 생산, 예비 호흡기 용량, 양자 누출 및 비 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위해 적용 대 식세포의 최소량. 따라서, 우리는 다음과 같이 수정 제조자의 프로토콜을 개선 하였다. 표준 미토 스트레스 테스트 (# 103015-100)은 포도당과 피루브산과 3 주사 (OM, FCCP, AA / ROT)와 프로토콜과 매체를 이용하여 제안합니다. 우리는, 글루코스 / 피루 베이트 배지와 분석을 시작 (해당 작용 스트레스 시험 # 103,020에서 100 사이에서 등) 포트의 제 주입 포도당을 추가하고 이러한 방식으로 포트 C.에서 FCCP의 uncoupler 함께 피루브산을 추가하도록 선택할 모든 관련 해당 작용 파라미터 ECAR 측정 1-9 mitochondri 대한 모든 관련 정보로부터 유도된다OCR 측정 4-15에서 알 기능. 이 언 커플 링에 최대 호흡을 연료로 FCCP와 함께 피루브산을 주입하는 것이 중요합니다. 이 조합 된 프로토콜을 사용하기 전에, 하나는 2- 데 옥시 -D- 글루코스 (2-DG)는 기저 값 (1-3)을 분석 한 후 ECAR 수준을 낮추는 것을 확인해야하며, 기록 ECAR 레이트 4-6 실제로 기인 것을 해당 작용한다. 또한, 사람은이 원고에 사용되는 화합물의 농도와 세포 수는 골수 유래 대 식세포 및 RAW264.7 대 식세포 세포주에 유효하며, 다른 세포 유형에 대해 최적화되어야한다는 것을 이해한다. 또한, 하나는 골수 유래 대 식세포를 생성하는 데 사용되는 M-CSF는 (M2)과 같은 항 염증 표현형을 촉진 있음을 알아 두셔야합니다. 골수 유래 대 식세포에서 제시된 결과는 따라서 세포 culturi 동안 M-CSF를 필요로하지 않는 차 조직 상주 식세포 또는 대식 세포주와 측정에 완벽하게 비교할 수 없습니다 수 있습니다NG. 기존의 방법에 비해,이 프로토콜은 대 식세포의 최소량을 요구하고 신속 거의 모든 대사 기본적인 전지 특성을 제공한다. 이것은 다른 면역 분석법 및 생체 에너지 프로파일 링에 사용되는 셀에도 여전히 다른 목적의 분석 후에 사용될 수를 수행하기에 충분한 잉여 셀을 초래한다. 또한, 특히 96 웰 플레이트 형식으로 동시에 실시간으로 여러 조건을 평가할 수있다. 그러나, 개별 웰 사이의 변화는 상당한 따라서 조건 당 적어도 4 웰의 사용은 종종 바람직하다 할 수있다. 계정에 이러한 제한을 촬영, 설명 세포 외 플럭스 분석은 여전히​​ 10 개 이상의 실험 조건을 실행할 수 있습니다 (N = 6) 기존의 기술보다 훨씬 더 인, 한 번에. 전반적으로,이 문서는 모든 관련 해당 작용과 미토콘드리아 PARAM을 측정 할 수있는 쉽고 재현성 기능 분석을 제공합니다편광 식세포의 부분 집합에 eters. 이 기술은 대 식세포의 기능을 평가하고 대 식세포의 (대사) 표현형에 서로 다른 조작의 효과 (예를 들어 유전자 허물고, 새로운 의약품 등)을 평가하기 위해 미래의 응용 프로그램 역할을 할 수 있습니다. 이와 같이, 플럭스 외 데이터는 대 식세포 활성화 상태의 심층 특성화를 허용하도록, 다른 분석과 함께 사용될 수있다.

대식 세포는 거의 모든 질환에서 핵심적인 역할을하지만, 그 표현형을 조절하는 분자 메커니즘은 아직 완전히 풀리지 아니다. 대 식세포는 높은 이질성을 표시하고 미세에 응답 한 다른 표현형을 채택한다. LPS (+ IFNγ)의 고전 (M1) 또는 M (LPS) 대 식세포는 염증을 촉진하고 미생물 위협이 다른 유형에 대한 호스트를 보호 활성화 유도 된. 기타 (M1)의 편광을 유도하는 자극으로 TNF와 단독으로 또는 조합 IFNγ을 사용합니다. IL-4 및 / 또는 IL-13은 대안 식세포 활성화를 유도하고 이러한 M2 또는 M (IL-4) 세포는 강력한 억제제 3 지속적인 면역 반응의 컨트롤러이다. 편광 대 식세포는 LPS 활성화 (M1)의 대 식세포가 강화 된 당분 4-6로 대사 스위치를 겪고과 세포 대사의 뚜렷한 규제를 표시합니다. 반대로, 향상된 지방산 산화 (FAO) 및 미토콘드리아 oxidativ전자 인산화 (OXPHOS)는 IL-4에 의한 M2의 대 식세포 7-9에서 지속적인 에너지를 제공합니다. 따라서, 변경 대사는 적절한 편광 및 염증 조절을위한 전제 조건뿐만 아니라, 편광 식세포 부분 집합의 특성도이다. 중요한 것은, 당분 또는 OXPHOS의 억제 / FAO는 각각 8, 10, M1 또는 M2 활성화를 저해하는 것으로 입증되었습니다. 이와 같이, 대 식세포의 식별 대사 변화는 편광 상태 및 염증 가능성을 평가하기위한 수단으로 적용될 수있다. 대식 세포 대사를 측정 일관된 분석 따라서 약물, 유전자 노크 여부를 예측하는데 사용될 수있는 다른 처리는 대 식세포 및 편광 기능에 영향을 미친다. 이 비디오에서는, 세포 외 플럭스 분석기는 순진, M1과 M2 대 식세포의 생체 에너지 프로파일을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 원고는 측정 할 수 최적화 프로토콜 세부모든 관련 해당 작용 매개 변수 (해당 작용, 최대 당분과 당분 준비 제도 이사회)와 하나의 분석에서 미토콘드리아의 기능 특성 (총 호흡, 기초 미토콘드리아 호흡, ATP 생산, 양성자 누출, 최대 호흡 및 예비 호흡기 용량)의. 이 실험 장치를 사용하여 생체 에너지가 세포 (유전자 과발현 또는 약물 치료를 허물고 예를 들어 유전자) 제어 및 &#39;변경&#39;사이에 비교 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>23G 및 25G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>#300800 및 #300600</td><td>플러시된 골수</td></tr><tr><td>10ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>#307736</td><td>플러시된 골수</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Greiner</td><td>#639161</td><td>골수 세포 배양</td></tr><tr><td>CyQUANT 세포 증식 분석 키트&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>#C7026</td><td>나중 시점에서의 세포 정량화를 위해 (부착 세포에만 작동)</td></tr><tr><td>CyQUANT 직접 세포 증식 분석 키트&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>#35011</td><td>분석 직후 세포 정량화용(비부착성 세포)XF</td></tr><<tr><td>sup>e96 세포 배양 마이크로플레이트</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#101085-004</td><td>세포를 배양하고 분석을 수행하는 96웰 플레이트</td></tr>, <tr><td>재조합 마우스 인터루킨-4(IL-4)</td><td>Peprotech</td><td>#214-14-B</td><td>, 대체 대식세포 활성화</td></tr><tr><td>를 유도하는 데 사용지질다당류 (LPS)</td><td>Sigma</td><td>#L2637</td><td>Pro-inflammatory stimulus</td></tr><tr><td>Seahorse Sensor 카트리지&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102416-100</td><td>pH 및 O2 측정을 위한 프로브가 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>Seahorse XF Calibrant&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#100840-000</td><td>밤새 프로브를 수화하는 데 필요&nbsp;</td></tr><tr><td>XF 베이스 미디엄&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102353-100</td><td>pH 변화를 효율적으로 측정할 수 있는 버퍼가 없는 매체</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td>세포에 추가되면 당분해를 촉진합니다.</td></tr><tr><td>올리고마이신 A</td><td>Sigma</td><td>#75351</td>은 <td>미토콘드리아 ATP 합성효소</td></tr><tr><td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td><td>Sigma</td><td>#C2920</td><td>Uncouple 미토콘드리아 호흡</td></tr><tr><td>100mM 피루브산 나트륨 용액</td><td>Lonza</td><td>#BE13-115E</td><td>해당작용 없이 최대 미토콘드리아 호흡을 허용합니다</td></tr><tr><td>Antimycin A Sigma</td><td></td><td>#BE13-115EA8674</td><td>미토콘드리아의 복합체 III을 억제합니다</td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>#BE13-115EA8674R8875</td> 미토콘드리아<td>의 복합체 III을 억제합니다. mitochondria</td></tr><tr><td>Casy Cell Counter</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#05 651 697 001</td><td>세포 계수 기기</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>#14-0161</td><td>Fc receptor block flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>#47-4801</td><td>대식세포 염색 항체</td></tr><tr><td>anti-CD11b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>#11-0112</td><td>대식세포 염색 항체</td></tr></tbody></table>

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 m1과 m2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

특이적 대사 경로는 점점 더 대식세포 하위 집합의 중요한 특징으로 인식되고 있습니다. LPS에 의해 유도된 고전적으로 활성화된 M1 또는 M(LPS) 대식세포는 전염증성인 반면, IL-4는 대체 대식세포 활성화를 유도하며 이러한 M2 또는 M(IL-4)은 염증 완화 및 상처 치유를 지원합니다. 최근의 증거는 M1 및 M2 대식세포 분극 조절에서 대사 재프로그래밍의 중요한 역할을 보여줍니다. 
이 원고에서는 세포외 플럭스 분석기를 적용하여 나이브, M1 및 M2 편광 마우스 골수 유래 대식세포의 대사 특성을 평가합니다. 이 기기는 pH 및 산소 센서를 사용하여 해당작용 및 미토콘드리아 산화 대사와 관련될 수 있는 세포 외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정합니다. 따라서 해당과정과 미토콘드리아 산화 대사는 모두 하나의 단일 분석으로 실시간으로 측정할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 염증성 M1 대식세포가 해당작용 대사를 강화하고 미토콘드리아 활성을 감소시킨다는 것을 입증합니다. 반대로, 항염증성 M2 대식세포는 높은 미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS)를 보이며 향상된 예비 호흡 능력(SRC)을 특징으로 합니다. 
제시된 기능 분석은 특정 사이토카인, 약리학적 화합물, 유전자 녹아웃 또는 기타 개입이 대식세포의 대사 표현형 및 염증 상태에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위한 프레임워크 역할을 합니다.

세포 외 플럭스 분석 및 세포 정량화 끝나면 데이터 세포 수에 대한 정규화 및 분석 될 수있다. 도 1a 및도 1b에 도시 된 바와 같이, 이것은 일반적 ECAR 및 OCR 플롯을 산출 할 것이다. 혈당 (A)의 주사 후, ECAR의 증가는 해당 작용 속도를 나타낸다. oligomycin (B)와 ATP 합성 효소 억제 후 ECAR의 추가 증가는 당분 예약 및 용량 (그림 1A)에 대한 정보를 제공합니다. OCR 값을 분석 할 때, 주사 (B) oligomycin 미토콘드리아 ATP 합성에 사용되는 산소 소비량의 계산을 허용한다. FCCP (C)는 미토콘드리아 호흡으로 분리하고 해당 OCR 측정은 최대 및 예비 호흡 능력에 대한 데이터를 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 로테의 주입 (ROT) 및 antimycin의 (AA)는 미토콘드리아 복잡한 I를 차단하고 III 잔류 OCR은 비 미토콘드리아의 산소 단점을 나타냅니다umption (그림 1B). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> 그림 1 : XF 세포 외 플럭스 분석에서 파생 된 대사 매개 변수를 설정합니다. (A)는 세포의 당분의 다음 매개 변수 (MPH / 분에서) ECAR 값으로부터 계산 : 해당 작용, 최대 당분 해 능력과 당분 예약. 기초 호흡, ATP 생산, 양자 누출, 최대 예비 호흡 및 호흡 용량 (pmole의 / 분)에서 (B) OCR 측정은 미토콘드리아 기능의 다음의 기본 파라미터를 계산하는 데 사용된다. Gluc = 포도당; OM = oligomycin; FCCP = 카르 보닐 시안화 4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐; AA = antimycin의; 부패 = 로테 논은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 실행 한 후, ECAR 및 OCR 측정 1 틸다음 ECAR 측정으로부터 각각의 웰에 대한 L (15)은 엑셀에 수출 할 수 있고, 다음 파라미터는 당분 해 계산 될 수있다 : 비 당분 산성화 = 평균. ECAR (1,2,3) 당분 = 평균. ECAR (4,5,6) - 평균. ECAR (1,2,3) 최대 당분 용량 = 평균. ECAR (7,8,9) - 평균. ECAR (1,2,3) 당분 예약은 평균을 =. ECAR (7,8,9) - 평균. ECAR (4,5,6) OCR 레이트에서 다음 대사 특성이 결정될 수있다 : 비 미토콘드리아 호흡 = 평균. OCR (13,14,15) 기저 호흡 = 평균. OCR (4,5,6) - 평균. OCR (13,14,15) ATP 생산 = 평균. OCR (4,5,6) - 평균. OCR (7, 8, 9) 양성자 누출 =평균. OCR (7,8,9) - 평균. OCR (13,14,15) 최대 호흡 = 평균. OCR (10,11,12) - 평균. OCR (13,14,15) 예비 호흡기 용량 (SRC) = 평균. OCR (10,11,12) - 평균. OCR (4,5,6) <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> 그림 2 :. 순진한의 대사 특성 (M0), LPS- (M1) 및 IL-4- (M2) 편광 식세포 8 개인 우물의 평균 (SEM)의 각각의 측정, 평균과 표준 오류가 표시됩니다. (A) 세포 외 산성화 속도 (시속 / 분에서 ECAR)와 (B) 산소 소비 속도 (OCR, pmole의 / 분)에 차등 편광 (M1 및 M2) 및 순진한 대 식세포 (M0)를 측정한다. (CyQUANT로 측정) 및 나이브 식세포 평균 셀 카운트에서 1로 설정 한 모든 측정은 세포 수에 대한 정규화 된이 켜졌 = 포도당; B = oligomycin; C = FCCP; D는 antimycin의 A + 로테 논을 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 2a에 도시 된 바와 같이, LPS와 대 식세포의 활성화는 당분 해 대사를 증가 유도한다. 도 2b에서 산소 소비율 (OCR)을 볼 때 LPS와 IL-4 처리 된 대 식세포의 차이는 더욱 명백하다. 최대 산화 대사가 높은 M (LPS)로 억제하면서 실제로, IL-4는 M2 식세포에 기초 특히 최대 호흡을 유도한다. 하나는 증가 당분이 M (LPS) 대 식세포에 오히려 고유하며 M (IFNγ) 대 식세포가 해당 작용을 강화 표시되지 않기 때문에 반드시 M1의 대 식세포의 특성 않음을 유의해야한다. 전반적으로,이 세포 외 플럭스 분석은 그쪽을 보여줍니다LPS 활성화 된 대 식세포 디스플레이 당분 해 대사를 개선하고 예비 호흡 능력을 가지고 있지 않는 반면, t, M2 식세포 향상된 산화 대사를 특징으로하고, 특히 높은 예비 호흡 용량 (SRC)되는 IL-4 유도.

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

본 세포외 플럭스 분석의 전반적인 목표는 미분화 상태 및 M1, M2로 분극화된 골수 유래 대식세포의 대사 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 사이토카인, 화합물 또는 유전자 코드가 대식세포의 대사 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위한 프레임워크로 활용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량의 대식세포만으로도 분석이 가능하다는 점입니다.또한, 이 방법은 단 한 번의 분석으로 모든 관련 당분해 및 미토콘드리아 파라미터를 측정합니다. 이 방법은 골수 유래 대식세포의 대사 표현형에 대한 통찰을 제공하지만, 모든 유형의 대식세포나 면역 세포에도 적용할 수 있습니다. 다른 과학자들로부터 세포 대사 플럭스 분석 지원 요청을 자주 받았기에 이 방법을 J에 게재하기로 결정했습니다. 배양 8일 차에 육안 검사로 성숙한 대식세포의 존재를 확인하고, 성숙한 골수 유래 대식세포를 10 milliliters의 구연산 식염수에서 5분 동안 배양합니다.세포가 떨어져 나왔을 때 37 °C에서 유지합니다. 배양물을 10 mL의 PBS로 세척하고 살아있는 세포 수를 측정합니다. 그런 다음 웰당 5 × 10⁴개의 세포를 분주합니다.XFE 96 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰에 100 µL의 배양 배지를 분주하며, 이때 피펫을 각 웰의 측면 중간 지점까지 약 45도 각도로 유지합니다. 세포를 분주하기 위해, 배경 보정 웰인 A1, A12, H1, H12에는 배지만 추가합니다. 그 후 세포 배양 후드 내의 상온에서 세포가 가라앉을 때까지 1시간 동안 둡니다.부착 배양을 확인한 후, 세포를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 플레이팅 3시간 후, 조건에 따라 웰당 4~6개의 세포를 24시간 동안 자극합니다. extracellular flux assay 전날 골수 유래 대식세포를 분극화하기 위해, 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 뒤집어 놓은 다음 각 플레이트 웰에 200 µL의 crin 용액을 채웁니다.다음으로, 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위로 내려 센서들을 Cain 용액에 담그고, 센서가 계속 잠겨 있을 수 있도록 Cain 용액의 높이가 충분한지 확인합니다. 그 후, 카트리지를 이산화탄소가 없는 37 degrees Celsius 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 분극된 대식세포로부터 상층액을 조심스럽게 제거하고, 새로 제조한 어세이 용액 100 microliters로 세포를 세척합니다.웰당 배지. 각 웰에 180 µL의 분석 배지를 첨가하고, 현미경을 사용하여 세포가 씻겨 내려가지 않았는지 확인합니다. 세포가 여전히 부착되어 있다면, 분석을 수행하기 전 세포를 배양하는 동안 플레이트를 37 °C 비이산화탄소 배양기에 1시간 동안 보관합니다.표에 지정된 대로 10가지 주입 화합물 혼합물을 준비하고 혼합물을 37 °C로 가온합니다. 그런 다음, 제공된 로딩 가이드를 사용하여 센서 카트리지의 포트 A, B, C, D에 적절한 부피의 화합물을 로드하여 세포 외 플럭스 분석(extracellular flux assay)으로 분극화된 대식세포의 바이오에너지를 특성화합니다. 분석 마법사를 사용하여 2분간의 혼합(mix) 시간과 3분간의 측정(measure) 시간으로 구성된 분석 템플릿을 생성하고, 4회의 각 주입 전과 마지막 주입 후에 최소 3회의 혼합 및 속도 측정 루프를 설정합니다.그 후 분석을 시작하고 장비의 지침을 따르십시오. 장비와 세포 플레이트의 보정을 위해 수화된 프로브가 담긴 카트리지 플레이트를 로딩합니다. 분석 종료 후 지침에 따라 모든 분석 배지를 조심스럽게 버리고, 분석된 세포 배양 마이크로플레이트를 정규화 전까지 -20 °C에서 보관하십시오.세포 증식 분석 키트를 사용하여 세포를 정규화하려면, 플레이트를 해동하고 웰당 200 µL의 갓 준비한 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)에 세포를 넣고 상온에서 5분 동안 배양하십시오. 마지막으로, 약 480 nm의 들뜸 파장과 약 520 nm의 방출 최대 파장에서 형광을 측정하십시오. 획득한 형광 측정값을 사용하여 모든 나이브 대식세포(naive macrophage) 웰의 평균 세포 수를 1로 설정한 비율을 계산한 다음, 이 비율을 Seahorse Wave 분석 소프트웨어로 내보내십시오.데이터를 정규화하기 위해, 세포외 플럭스 분석(extracellular flux assay)은 일반적으로 세포외 산성화율(ECAR) 또는 산소 소비율(OCR) 그래프를 산출하며, 이 대표 그림에서 보는 바와 같이 글루코스 주입 후 관찰되는 ECAR의 증가는 당분해 속도를 나타냅니다. oligomycin을 이용한 ATP 합성 효소 억제 후 ECAR에서 관찰되는 추가적인 증가는 당분해 예비능 및 용량에 대한 추가적인 정보를 제공합니다. OCR 값을 분석할 때, CIN 주입은 미토콘드리아 ATP 합성에 사용되는 산소 소비량의 계산을 용이하게 하며, FCCP는 미토콘드리아 호흡을 탈커플링(uncouple) 시킵니다.해당 OCR 측정 결과는 최대 및 예비 호흡 능력을 나타내며, antimycin a 주입은 미토콘드리아 복합체 1과 3을 차단하여 잔여 OCR이 비미토콘드리아 산소 소비량을 나타내게 합니다. LPS를 이용한 대식세포 활성화는 당분해 대사를 증가시키며, 산소 소비율을 관찰하면 LPS 처리 대식세포와 IL-4 처리 대식세포 간의 차이가 더욱 분명하게 나타납니다.실제로, LPS 처리된 대식세포에서는 최대 산화 대사가 매우 억제되는 반면, IL-4는 M2 대식세포에서 강력한 호흡을 유도합니다. 숙달되면, 세포 외 플럭스 분석(extracellular flux assay)은 적절히 수행될 경우 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 언커플링(uncoupling) 시 최대 호흡을 촉진하기 위해 FCCP와 함께 VET를 주입해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.이 기법 이후, 효율적인 대식세포 분극화를 평가하기 위해 ELISA와 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기법은 면역학 분야의 연구자들이 광범위한 면역 세포의 대사 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 대식세포의 대사 표현형을 평가하기 위한 세포 외 플럭스 분석 수행 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

본 프로토콜은 MFP 라벨이 부착된 악성 균주 H37Rv에 감염된 대식세포와 말초 혈액 단혈세포의 분화에 기초하여 인간 M1 또는 M2 편광 대식세포에서 진코박테리움 결핵 감염을 연구하고, M1의 마커를 포함한 10색 마커를 사용하여 유동 세포암법으로 분석하는 방법을 제공한다.

M1 및 M2 인간 단세포 유래 세포의 편광 및 진균 결핵 감염에 대한 유동 세포측정을 분석

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.

임플란트 표면의 M1 및 M2 인간 단핵구 유래 대식세포의 분극 및 특성화 

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

체외 이식 모델을 사용하여, 저지방 쥐의 내장 백색 지방 조직의 앞부분 일부를 7일에서 10일간 배양하여, 고지방 식이 섭취 중 지방 조직 염증을 유도하고 연구할 수 있게 합니다.

고지방 식이와 유사한 지방 조직 염증을 위한 체외 마우스 모델

Toxoplasma gondii는 조직 문화 모델 했었 수있는 환경 스트레스에 대한 응답으로 낭종 형태로 변환됩니다. 이 동영상은 골수 파생 macrophages 뼈를 활성화하거나 fibroblast 세포 성장 매체 산도를 변경하여 낭종 벽 형성을 검토하기 위해 기술을 보여줍니다.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

배우세요 실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 M1 및 M2 편광 골수 유래 대식세포의 대사 특성을 평가하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 대식세포 대사와 표현형을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

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