실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

이 세포외 플럭스 분석의 전반적인 목표는 두 개의 편광 골수 유래 대식세포인 naive M1 및 M의 대사 특성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 사이토카인, 화합물 또는 유전자 코드가 대식세포의 대사 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위한 프레임워크 역할을 할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 소량의 대식세포만 필요하다는 것입니다.

또한 하나의 단일 분석에서 모든 관련 해당작용 및 미토콘드리아 매개변수를 측정합니다. 이 방법은 골수 유래 대식세포의 대사 표현형에 대한 통찰력을 제공하지만 모든 유형의 대식세포 또는 면역 세포에도 적용할 수 있습니다. 우리는 다른 과학자들로부터 대사 접근 세포 플럭스 분석을 도와달라는 요청을 자주 받기 때문에 이 방법을 J에 발표하기로 한 아이디어를 가지고 있었습니다.배양 8일째에 육안 검사로 성숙한 대식세포의 존재를 확인하고 성숙한 골수 유래 대식세포를 10ml의 구연산염 식염수에 5분 동안 배양합니다.

세포가 분리되었을 때 섭씨 37도. 10ml의 PBS로 배양액을 세척하고 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 그런 다음 웰당 네 번째 셀에 10을 5번 파종합니다.

XFE 96 세포 배양에서 웰당 100마이크로리터의 배양 배지에 마이크로플레이트를 넣고 각 웰 측면의 약 절반 아래로 비스듬히 피펫을 유지합니다. 세포를 분주하려면 백그라운드 보정 웰 A 1, A 12, H 1 및 H 12에 배지를 단독으로 추가합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 후드에서 1시간 동안 실온에 정착시킵니다.

부착 배양을 확인한 후, 세포를 섭씨 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 도금 3시간 후 24시간 동안 조건별로 4-6웰의 세포를 적절하게 자극합니다. 세포외 플럭스 분석 전날 골수 유래 대식세포를 분극화하려면 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓고 각 플레이트에 200마이크로리터의 크린 용액을 잘 채웁니다.

다음으로, 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트로 내려 센서를 Cain 용액에 담그고 Cain 용액 수준이 센서를 물에 잠길 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인합니다. 그런 다음 카트리지를 이산화탄소가 없는 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 다음날, 편광된 대식세포에서 상층액을 부드럽게 제거하고 갓 준비한 100마이크로리터의 분석법으로 세포를 세척합니다.

웰당 중간. 각 웰에 180마이크로리터의 분석 배지를 추가하고 현미경을 사용하여 세포가 씻겨 나가지 않았는지 확인합니다. 세포가 여전히 부착되어 있는 경우, 세포가 배양하는 동안 분석을 실행하기 1시간 전에 섭씨 37도의 비이산화탄소 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.

표에 지정된 대로 10 x 주입 화합물 혼합물을 준비하고 혼합물을 섭씨 37도로 예열합니다. 그런 다음 제공된 로딩 가이드를 사용하여 적절한 부피의 화합물과 포트 A, B, C 및 D를 센서 카트리지에 로드하여 세포 외 플럭스 분석으로 편광 대식세포의 생체 에너지를 특성화합니다. Assay Wizard를 사용하여 2분 혼합 및 3분 측정 시간, 4회 주입 각각과 마지막 주입 후 최소 3회의 혼합 및 속도 측정 루프가 있는 분석 템플릿을 생성합니다.

그런 다음 분석을 시작하고 장치에 표시된 지침을 따릅니다. 카트리지 플레이트에 수화 프로브를 로드하여 장치와 셀 플레이트에서 보정할 수 있도록 합니다. 지시에 따라 분석이 끝나면 모든 분석 배지를 조심스럽게 폐기하고 분석된 세포 배양 마이크로플레이트를 정규화될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

Cell Proliferation Assay Kit를 사용하여 세포를 정규화하려면 플레이트를 해동하고 실온에서 5분 동안 웰당 200마이크로리터의 새로 준비된 세포 용해 완충액에서 세포를 배양합니다. 마지막으로, 약 480 나노미터 여기와 약 520 나노미터 방출 최대값으로 형광을 측정합니다. 획득한 형광 측정값을 사용하여 모든 naive macrophage well의 평균 세포 수가 1로 설정된 비율을 계산한 다음 이 비율을 해마 파도 분석 소프트웨어로 내보냅니다.

데이터를 정규화하기 위해 세포 외 플럭스 분석은 일반적으로 세포 외 산성화 속도 또는 ECAR 및 산소 소비율 또는 포도당 주입 후 이 대표 그림에서 볼 수 있는 OCR 플롯을 산출하며, 관찰된 ECAR의 증가는 해당과정 속도를 나타냅니다. 모든 리가 마이신과 함께 TP 합성효소 억제 후 ECAR에서 관찰된 추가 증가는 해당작용 예비력 및 용량에 대한 추가 정보를 제공합니다. OCR 값을 분석할 때 CIN 주입은 미토콘드리아 A TP 합성에 사용되는 산소 소비량 계산을 용이하게 하고 FCCP는 미토콘드리아 호흡을 분리합니다.

해당 OCR 측정은 알려진 최대 및 예비 호흡 용량 부패 및 항마이신 주사에 대한 데이터를 생성하지만, 비미토콘드리아 산소 소비량을 나타내는 잔류 OCR로 미토콘드리아 복합체 1 및 3을 차단합니다. LPS를 사용한 대식세포 활성화는 해당작용 대사를 증가시킵니다. LPS와 IL의 차이로 인해 4개의 처리된 대식세포는 산소 소비율이 관찰될 때 더욱 분명해집니다.

실제로, LPS 처리된 대식세포에서는 최대 산화 대사가 크게 억제되는 반면, IL 4는 M 2개의 대식세포에서 강력한 호흡을 유도합니다. 일단 숙달되면 세포 외 독감 분석이 제대로 수행되면 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 분리시 최대한의 호흡을 촉진하기 위해 FCCP와 함께 수의사를 주사하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기법 후에 Eliza와 같은 추가 분석을 수행하여 효율적인 대식세포 분극을 평가할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 광범위한 면역 세포의 대사 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 대식세포의 대사 표현형을 평가하기 위해 세포 외 플럭스 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.