Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

이 프로토콜의 전반적인 목표는 poly cyonic MGT 구조체를 사용하여 심장 섬유아세포에서 유도된 심근세포를 효율적으로 생성하는 방법을 입증하는 것이며, gata 4, F 2 C 및 TBX 5의 최적 비율을 표현합니다. 이 방법은 유도된 심근세포 연구를 위한 귀중한 플랫폼을 제공하며, 유도된 심근세포 프로그래밍에 대한 사후 스크리닝 및 기계론적 연구를 통해 높은 수준의 연구를 촉진하는 동시에 해당 분야를 임상 응용 분야로 이동시킬 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 단 하나의 레트로바이러스 구조체를 사용하여 심근아세포를 심근세포로 효율적으로 전환할 수 있다는 것입니다.

신생아 알파 미오신 중쇄 GFP 형질전환 마우스를 75%volume to volume으로 청소합니다. 에탄올은 안락사를 수행합니다. 그런 다음 멸균되고 뭉툭하고 구부러진 집게를 사용하여 한쪽 겨드랑이 아래에서 다른 쪽 겨드랑이 아래까지 수평 절개를 만들어 체강을 엽니다.

심장을 해부하여 얼음이 들어 있는 24웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. Cold PBS는 형광 현미경을 사용하여 심장 전체의 GFP 발현을 관찰합니다. 멸균 집게와 가위를 사용하여 60mm 중앙 우물 배양 접시에 3-4G FP 양성 하트 3개를 놓고 하트를 1입방 밀리미터 미만의 작은 조각으로 다집니다.

다진 심장을 10cm 접시에 옮기고 2ml의 섬유 아세포 또는 FB 배지로 덮습니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 최소 3시간 동안 플레이트를 방해받지 않고 그대로 두십시오. 배양 후 다진 심장 조직이 들어있는 접시에 8ml의 예열 FB 배지를 천천히 첨가합니다.

그런 다음 3일마다 배지를 변경하는 것을 제외하고는 방해 없이 조직을 배양합니다. 7일째에 배양 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 세척합니다. 각 플레이트에 EDTA 0.05% 트립 3밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

FB 배지 5ml를 첨가하여 트립신을 비활성화한 다음 세포 스크레이퍼로 세포를 부드럽게 분리합니다. 다음으로, 세포를 수집하고 40미크론 세포 여과기를 통해 여과하여 심장 조직 조각으로 오염되지 않도록 합니다. 200배 G에서 200배 G로 분리된 신생아 마우스 심장부터 시작하여 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.

각 심장을 아직 느슨하게 연결된 네 조각으로 자릅니다. 8ml의 따뜻한 0.05% 트립신 EDTA가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 심장을 옮기고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 트립신 EDTA를 버리고 중간 속도로 1분 동안 따뜻한 2형 콜라겐분해효소 와류 5ml를 첨가한 다음 섭씨 37도의 수조에서 3-5분 동안 튜브를 배양합니다.

그런 다음 1분 동안 튜브를 다시 소용돌이칩니다. 조직 조각이 가라앉고 상층액을 5ml의 차가운 FB 배지가 들어 있는 새 튜브에 모으도록 합니다. 조직 조각에 5ml의 새로운 타입 2 콜라겐 분해 효소를 추가하고 와류 및 배양 단계를 반복합니다.

상층액을 포함하는 모든 세포를 40미크론 세포 스트레이너를 통해 여과하여 결합합니다. 이 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 심장 섬유아세포 분리 방법 중 하나를 따릅니다.

최종 세포 펠릿을 10ml의 자기 활성화 세포 분류 또는 최대 완충액으로 한 번 세척합니다. 살아있는 세포 계수를 위해 10마이크로리터를 제거하고 나머지 세포를 200배 G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 1배 10에서 7번째 세포까지 원심분리합니다. 90마이크로리터의 냉각 최대 완충액에 10마이크로리터의 허벅지 1.2 공액 자성 마이크로비드로 세포 펠릿을 재현탁하고 혼합합니다.

구슬을 섭씨 4도에서 30분 동안 잘 배양합니다. 세포를 펠릿화하기 위해 최대 완충액 10ml를 추가하고 5분 동안 200배 G에서 샘플을 원심분리합니다. 최대 완충액 10ml로 한 번 세척하고 세포 배양 후드에 총 2ml의 부피로 세포 펠릿을 재현탁합니다.

최대 구분 기호를 설정하고 LS 열을 추가합니다. 컬럼을 3ml의 최대 버퍼로 평형을 이룹니다. LS 컬럼을 통해 세포 현탁액을 통과시키고 2ml의 최대 완충액으로 3회 세척합니다.

그런 다음 분리기에서 LS 컬럼을 제거하고 2ml의 최대 버퍼로 3회 용리합니다. 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 EIT를 수집합니다. EIT를 200배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

분리된 섬유아세포를 10밀리리터의 FB 배지에 재현탁시키고 세포를 계수하고, 심장 섬유아세포를 재프로그래밍하기 위해 사전 코딩된 24웰 플레이트에서 적절한 밀도의 조직 배양 접시에 세포를 파종합니다. 폴리브레인을 함유한 유도 심근세포 또는 ICM 배지 500마이크로리터를 세포가 있는 24개의 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 10마이크로리터의 레트로바이러스를 분리된 섬유아세포의 각 웰에 추가합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 24-48시간 동안 레트로바이러스 입자로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 바이러스가 포함된 배지를 500마이크로리터의 새 ICM 배지로 교체하고 2-3일마다 배지를 교체합니다. ICM 배지에 pur mycin의 밀리리터당 2마이크로그램을 보충하여 바이러스 형질도입 세포의 양성 선택을 시작합니다.

3일 동안 선택한 후 배지를 1마이크로그램/밀리리터 pur mycin의 유지 용량으로 변경하여 심장 섬유아세포가 심근세포로 전환되는 것을 시각화합니다. 도립 현미경을 사용하여 GFP 발현을 위해 pur mycin selected plates를 관찰합니다. 마지막으로, 바이러스 치료 14일 후 ICM 배지를 B 27로 교체합니다.

중간 자발적 박동 세포 좌위는 심장 트로포닌 t 및 알파를 포함한 심장 마커의 바이러스 전달 발현 후 3-4주에 나타날 수 있습니다. 악티닌은 10일에서 14일까지 면역화학으로 검출할 수 있습니다. 여기서, 심장 트로포닌 T 발현은 섬유아세포에서 변환된 I CMS에서 볼 수 있으며, ICM에서 GFP 알파 액티닌 발현을 발현하는 것은 여기에서 볼 수 있습니다.

유세포 분석에 의한 분석은 특히 유도된 심근세포의 pur mycin 선택 후 심장 트로포닌 T 발현이 유사하게 증가함을 보여줍니다. 여기에 설명된 신화는 단일 구조에서 NGT 전사 인자의 레트로 바이러스 전달을 기반으로 유도된 심근세포를 효율적으로 생성할 수 있도록 합니다.