Name: 정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의) 6 -tagged 재조합 Shadoo 단백질의 봉입체로 표현 대장균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 대장균에서 봉입체로 발현된 재조합 Shadoo 단백질을 정제하고 아밀로이드 섬유로 리폴딩하는 이단계 크로마토그래피 방법을. 이 기술은 단백질 구조 장애 연구에 신속하고 비용 효율적인 단백질 생산을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 Sho cDNA를 제공해 준 Natalie Doude와 David Westerway(앨버타 대학), 플라스미드 구축을 위해 Christophe Chevalier(INRA), BL21Sol 박테리아를 제공한 Michel Brémont(INRA)에게 감사를 표합니다. TEM 지원은 Christine Longin(INRA)이고 의견 및 교정은 Edith Pajot-Augy(INRA)입니다.

플라스미드 및 Shadoo 식의 1 세대 주 : 유전자 부호화 뮤린 Shadoo 단백질 (Shadoo 25부터 1백22까지)를 발현 벡터를 pET-28 (11)에 서브 클로닝 하였다. 이 클론은 E.으로 변화되었다 앞서 설명한 바와 같이 11 대장균 N 말단 헥사 히스티딘 태그 (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG)와 Shadoo 단백질을 발현하는 균주를 SoluBL21. 플라스미드는 저자에서 요청하실 수 있습니다. 그 아미노산 서열로부터 계산 Shadoo의 분자량은 12,243.2 다이다. 참고 : laminal 흐름 후드 아래에 또는 가까운 분젠 화염에 세균 모든 조작을 수행합니다. <ol><li> 표준 열 쇼크 프로토콜을 사용하여 pET-28-그의 6 -Shadoo 플라스미드 유능한 SoluBL21 박테리아 변환. 플라스미드 1~5 μL이 믹스 (전형적으로 10 내지 100 PG튜브에서 박테리아의 50 μL로 NG). 45 초 동안 42 ℃에서 열 쇼크를 수행한다. </li><li> 배양은 40 ㎎ / ㎖ 카나마이신 (도 1b)로 보충 된 루리아 - 베르 타니 배지에서 0.5 내지 0.7의 600까지 37 ℃에서 형질 전환 된 박테리아. </li><li> 배양에 240 μg의 / ㎖ 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드, ITPG를 첨가하여 Shadoo 발현 O / N을 유도한다. 37 ° C에서 150 rpm으로 진탕 배양 균. 참고 : 일반적으로 박테리아 문화가 600 3 O / N의 도달한다. 주 : 형질 전환 박테리아 단백질 생산 미래 -80 ℃에서 저장 될 수있다. 이를 위해, 세균 배양 씩에 10 % -50 % (v / v)의 멸균 글리세롤을 추가하고 -80 ° C에서 그들을 동결. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" /> Shadoo 표현의 Shadoo 식 구조, 박테리아의 변화와 유도의 그림 1. 제도 (로 1 단계에서 설명). </stroNG&gt; (A) Shadoo 대한 발현 구성체는 단백질, NT를 N 말단에 융합 헥사 히스티딘 태그를 암호화한다. 방식 Shadoo 단백질이 C 말단 (CT) 다음에 기본 아르기닌 / 글리신 반복 (녹색 실린더), 소수성 도메인 (HD) 및 단일 N 글리코 실화 부위 (CHO)를 포함하고 있음을 보여준다. (B) 애완 동물 (28) - 그의 6 -Shadoo 플라스미드는 42 ℃에서 45 초간 열 충격에 의해 SoluBL21 박테리아로 변환됩니다. 형질 전환 된 박테리아는 선택적 한천 / ㎖ 카나마이신 40 μg의를 포함에 도금되어있다. 플레이트에서 단일 콜로니는 1,000-3,000 ml의 통 플라스크에 문화를 접종하는 데 사용됩니다. 재조합 단백질의 발현이 1 mM의 IPTG로 유도된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 저압 액체 크로마토 Shadoo 단백질 2. 그래피 (LPLC) <ol><li> 세포 용해 및 Inclusion 기관 준비 <ol><li> 세균 현탁액을 수집하고 원심 분리 튜브 (그림 2)로 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 2,500 XG에 스핀. 경사 및 세포 배양의 500 ml의에서 파생 된 각각의 펠릿에 대한 재현 탁 펠렛 (항 단백 분해 효소 칵테일 50 mM 트리스, 10 mM의 EDTA, pH를 8) 15 ml의 버퍼에 의해 상층 액을 제거합니다. 주 : 펠릿을 재현 탁시키고 동결 며칠 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 냉동은 박테리아 세포 용해를 용이하게한다. </li><li> SDS-PAGE 분석 및 쿠마 염색으로 원유 세균 펠릿을 사용하여 재조합 단백질의 과발현을 확인합니다. <ol><li> 이를 위해, 세균 배양의 원심 분리기 1 ml의 세포 펠렛합니다. 5 분 동안 100 ° C에서 100 μL 램 믈리 변성 펠렛 솔루션 (277.8 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 4.4 % SDS, W 44.4 % / V 글리세롤, 블루 0.02 % 브로 모 페놀)와 열을 추가합니다. </li><li> 12 % 아크릴 아마이드 겔에 부하 시료 10 μL를 실행 SDS-PAGE 및 VISUALIZE은 쿠마시 염색으로 단백질을 분리 하였다. </li></ol></li><li> ) 2.1.2에서 완전히 재 부유 펠릿에 0.5 % 최종 농도 트리톤 X-100을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃ 수욕 중에서 현탁 배양한다. </li><li> 세균 세포를 용해시키기 위해 빙 냉수에 6-12 미크론에서 피크 - 투 - 피크 진폭을 5 분 동안 초음파 처리 현탁액. </li><li> 전송 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 서스펜션을 초음파. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기 튜브. </li><li> 경사 분리하여 상층 액을 제거하고 튜브 당 결합 완충액 (20 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4의 0.5 M의 NaCl, 8 M 우레아, 5 mM의 이미 다졸) 5 mL를 추가한다. </li><li> 회전 바퀴 O / N에 장소 튜브가 완전히 봉입체에서 단백질을 재현 탁합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" /> 포함의 정제의 그림 2. 계획Shadoo 발현 체 (단계 2.1에 기재된 바와 같이). 형질 전환 된 박테리아를 원심 분리에 의해 수확하고 용해 완충액에 재현 탁된다. 현탁액을 30 분 동안 37 ° C에서 배양 한 후, 세균 세포를 기계적으로 파괴하는 초음파 처리된다. 초음파 처리는 시료의 가열을 방지하는 얼음에 행해진 다. 깨진 세포를 원심 분리에 의해 수확 봉입체에서 단백질을 가용화 8 M 요소를 포함하는 버퍼에 재현 탁하고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 니켈 2+ - 친 화성 크로마토 그래피 주 : 크로마토 그래피 5 ㎖ 킬레이트 세 파로스 칼럼 (도 3a), 니켈 2+ -charged 이용한 FPLC 시스템에서 수행된다. 모든 용액 / 분으로 1 ml의 유속으로 컬럼에 로딩된다. <ol><li> 충전하기 위해 세 파로스 칼럼에 0.2 M 니소 4 수용액 10 ㎖를 주입니켈 2 + -ions와. </li><li> 이미 다졸의 낮은 농도 (20 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4의 0.5 M의 NaCl, 8 M 우레아, 5 mM의 이미 다졸)을 함유하는 결합 완충액 중 30 ~ 50 ml를 주입함으로써 니켈 2+ -ions 충전 칼럼을 평형화. </li><li> 50 ml를 주입 루프 요소 - 용해 단백질을로드합니다. </li><li> 완전히 결합되지 않은 단백질의 최대 값을 제거하기 위하여 10 ml의 낮은 다졸 결합 완충액 (20 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4의 0.5 M의 NaCl, 8 M 우레아, 5 mM의 이미 다졸)으로 컬럼을 세척하여 관류 분획을 회수 열에서. </li><li> (mM 트리스 -HCl, pH 7.4, 0.5 M의 NaCl, 8 M 우레아, 80 mM의 이미 다졸 20) 비특이적으로 컬럼에 결합 된 단백질을 용출 세척 완충액 중 50 ~ 100 ㎖로 칼럼을 세척 하였다. </li><li> 20 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 0.5 M의 NaCl, 8 M 우레아를 함유하는 완충액에 80에서 8백까지 mM의 이미 다졸을 15 분 선형 구배를 적용. 그라데이션 적용하는 동안 1 ml의 분수를 수집합니다. 참고 : 그의 - 태그 - 단백질은 재치 용출(경쟁자로 사용) 이미 다졸 함유 버퍼의 하 구배. </li><li> (2.1.3.1 참조) 각 부분의 8 μL 나누어지는을 가지고 4 μL 배 램 믈리 변성 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 5 분 동안 100 ℃에서 열 솔루션. </li><li> 부하 쿠마시 염색으로 단백질 크기 마커 10 μL 및 12 % 아크릴 아미드 겔에 각 시료 10㎕를 실행 SDS-PAGE 분리 및 가시화 단백질. 주 : 계산 Shadoo의 분자량은 그것의 아미노산 서열이다 형성 12,243.2 다. </li><li> 풀 Shadoo를 포함하는 모든 분획. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" /> (단계 2.2에서 2.4 사이의 설명 참조) 3. 정제 절차도. (A)의 Ni 2+ -ions은 폴리 히스티딘 - 태그 된 단백질의 정제를 허용 선택적 히스티딘 잔기에 의해 조정될 수있다. 이미 다졸을 통해 단백질을 용출하는데 사용된다니켈 - 이온 2+로 조정하고 결합 된 단백질을 대체 할 수있는 능력. (B) 크기 배제 칼럼 상으로 분리되어 A 행의 Ni 2+에 보유 된 다양한 유체 역학적 반경의 단백질. 단백질이 작은 사람에게 가장 큰에서 용출된다. (C)를 ​​사용하기 전에, Shadoo을 포함하는 분획을 모으고 요소, 이미 다졸 및 염을 제거하는 탈염된다. 품질 관리 분석은 SDS-PAGE / 쿠마 염색, 웨스턴 블로 팅을 포함한다. 정제 Shadoo은 동결 건조 할 수있다. -20 ° C에서 저장 될 때 동결 건조 Shadoo 달 동안 안정하다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 크기 배제 크로마토 그래피 주 : 초 정제 단계가 다른 단백질 제 정제 공정 중에 공동으로부터 용출 Shadoo 단백질을 분리하는 크기 배제 크로마토 그래피로 이루어져(그림 3B). <ol><li> 1.5 ㎖ / 분의 유속으로 20 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4의 0.5 M의 NaCl, 8 M 우레아 250㎖를 주입함으로써 전체 베드 부피 120 ㎖가 슈퍼 덱스 컬럼을 평형화. </li><li> 평형 열 2.2.9에서 Shadoo를 포함하는 부하 풀링 분수. 위의 버퍼의 일정한 흐름에 따라 40 ml를 열 공극 부피 후 1 ml의 분수를 수집합니다. </li><li> 각 부분의 10 μL 나누어지는을 가지고 분수가 Shadoo를 포함하는 알 상술 한 바와 같이 SDS-PAGE 분석 및 쿠마 염색을 수행합니다. </li><li> Shadoo를 포함하는 풀 분수. </li></ol></li><li> 탈염 주 : 탈염 과정은 또한 생물 물리학 적 및 생화학 적 연구 (도 3c)에 적합한 완충액 Shadoo 재조합 단백질을 얻기 위해 염, 이미 다졸 및 우레아를 제거한다. 동일한 결과를 버퍼에 대하여 투석 샘플을 얻을 수있다. <ol><li> 150 ml의 53 ML의 탈염 열 평형/ 분 5 ㎖의 유속으로 10mM의 아세트산 암모늄 완충액, pH가 5의. </li><li> 로드 열 Shadoo 분획을 풀링. 아세트산 암모늄 완충액의 주입시 수동 UV 검출기의 출력에서​​의 280 nm에서 신호의 증가를 보여 분획을 수집한다. </li><li> 동결 건조 탈염 Shadoo을 -20 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 적절한 버퍼 내의 동결 건조 Shadoo 같은 된 10 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH가 5를 용해, 종래 사용하기. 주 : 폴리 히스티딘 태그는 엔테로 키나제로 제거 할 수있다. </li></ol></li></ol> 생리 학적 pH에서 아밀로이드 피 브릴에 Shadoo의 체외 조립 (3) 주 : 자발적으로 Shadoo 단백질 집계 및 pH를 ≥ 7 (11)에서 섬유를 형성한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" /> Shadoo이 아밀로이드 원 섬유에 접힘 그림 4. 제도 (descri로떨고있는 동안 산성 용액에서의 pH ≥ (7)의 버퍼에 용해 할 때 3 단계에서 침대). 정제 Shadoo 자발적 아밀로이드 원 섬유로 변환, Shadoo 1 M GDN-HCl로 배양에 아밀로이드 원 섬유로 변환합니다. 품질 관리 분석 전자 현미경과 THT ​​염색을 포함한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 20 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4의 2 μM의 최종 농도로 희석 Shadoo. 280 nm에서의 용액의 흡광도를 측정하고 20,970의 Shadoo 아미노산 조성물로부터 추론 흡광 계수를 이용하여 농도를 측정한다. </li><li> 아밀로이드 구조 (그림 4)에 자연 단백질 변환을 할 수 있도록, 몇 주 4 ℃에서 원뿔형 플라스틱 튜브에 용액 500 μl를 품어. </li><li> 갓 최종 conce에 T (THT) thioflavin 준비 추가Shadoo 용액 100 μL 분취 10 μM의 ntration. RT에서 5 분 동안 용액을 배양한다. 아밀로이드 구조 (17)의 존재를 확인하는 435 나노 미터의 여기 파장을 사용하여 460에서 520 nm의 형광 발광을 측정한다. </li></ol> 산성 pH 값에서 아밀로이드 피 브릴에 Shadoo의 체외 조립 4. <ol><li> 2 μM의 최종 농도 1 M GdnHCl, 20 mM의 나트륨 아세테이트 완충액, pH를 5로 희석 Shadoo. </li><li> 를 3-7 일 동안, 37 ℃에서 연속 진탕 원추형 튜브 용액 500 μl를 배양한다. </li><li> 3.3에서와 같이 용액의 분취 량을 첨가하여 THT 아밀로이드 피 브릴의 존재를 확인한다. </li><li> Shadoo 아밀로이드 피 브릴를 정화, 10 mM의 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.0으로 대해 얻어진 현탁액을 투석. </li><li> 4 ℃에서 정제 섬유를 저장합니다. </li></ol><img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg"/&gt; 니켈 2+으로부터 용출도 5 대표 결과. 단백질 분획 킬레이트 컬럼 (A)와 크기 배제 컬럼 (B) SDS-PAGE 및 쿠마시 염색을 이용하여 분석을 하였다 -charged. 정제 Shadoo의 식별이 SPRN 방지 Shadoo 항체 (C)를 ​​사용하여 평가 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+at+the+crossroads+of+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Prion protein at the crossroads of physiology and disease.</a> Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).</li>
<li>Colby, D. W., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">De novo generation of prion strains.</a> Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435, 773-778 (2005).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+amyloid+formation+and+membrane+interaction+with+amyloidogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).</li>
<li>Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+of+lipid-prion+interactions%3A+insights+on+charge+effect%2C+Cu%28II%29-ions+binding+and+prion+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).</li>
<li>Watts, J. C., Westaway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prion+protein+family%3A+diversity%2C+rivalry%2C+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).</li>
<li>Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PrP-like+proteins+Shadoo+and+Doppel%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The PrP-like proteins Shadoo and Doppel.</a> Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).</li>
<li>Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+versus+doppel+protein+misfolding%3A+new+insights+from+replica-exchange+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations.</a> Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).</li>
<li>Daude, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Shadoo+proteins+convert+to+amyloid-like+forms+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions.</a> Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadoo+binds+lipid+membranes+and+undergoes+aggregation+and+fibrillization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CNS+glycoprotein+Shadoo+has+PrP%28C%29-like+protective+properties+and+displays+reduced+levels+in+prion+infections%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections.</a> The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-resistant+prions+selectively+decrease+Shadoo+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002382(2011).</li>
<li>Westaway, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Shadoo+in+prion+infections+traces+a+pre-clinical+event+inversely+related+to+PrP%28Sc%29+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002391(2011).</li>
<li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PB1-F2+influenza+A+virus+protein+adopts+a+beta-sheet+conformation+and+forms+amyloid+fibers+in+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).</li>
<li>Tarus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+paths+of+the+nucleoprotein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus.</a> Biochimie. 94, 776-785 (2012).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+Thioflavin-T+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).</li>
<li>Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+system+as+a+screening+tool+for+pharmacological+assessment+of+g+protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors.</a> Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).</li>
<li>Schein, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cool+way+to+make+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cool way to make proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+genetic+strategies+for+recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+glycosylation+enhances+ubiquitin-mediated+proteasomal+degradation+of+Shadoo+in+Scrapie-infected+rodents+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells.</a> Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).</li>
<li>Englund, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+biosynthesis+of+glycosyl+phosphatidylinositol+protein+anchors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors.</a> Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).</li>
<li>Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPI-anchoring+of+PrP%3A+implications+in+sorting+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis.</a> Prion. 8, 11-18 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

발현 및 재조합 마우스 Shadoo 단백질의 다량의 정제 모두에 대한 쉽고 효율적인 프로토콜이 제시된다. 기재된 방법은 성공적인 가용화 및 (그의 6) -tagged Shadoo 재조합 단백질을 정제 할 수있다. 제목에서 지적했듯이 그것은 중요하다 원핵 박테리아 E. 표현하는 경우 대장균 Shadoo은 봉입체에 축적. Shadoo 정제에 앞서, 박테리아는 트리톤 X-100을 함유하는 완충액에 용해하여 초음파 처리되어야한다. 이어서 봉입체는 8 M 우레아 변성 용액에 용해 될 수있다. 또한, 전체 정제 과정 Shadoo가 중합 및 응집 경향 때문에 8 M 우레아 완충액에서 수행되어야한다. 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피 : 가용화 및 봉입체 정화 후 변성 단백질을 함유하는 상등액을 두 단계의 정제 과정에 적용된다. 선호도 chromatog그래피 단계는 니켈 2 +는 킬레이트 열을 -charged에 (그의 6) -ta...

인간의 양 및 크로이츠 펠트 - 야콥병에서 소 해면상 소에서 뇌, 스크래피를 포함 프리온 신경 퇴행성 질환은 치명적 및 불치이다. 프리온 질병은 주로 가교 β 시트로, α-나선 이루어지는 세포 프리온 단백질의 형태 적 변화에 의해 특징 1,2- 콘 포머 (conformer) 아밀로이드 농후. 크로스 - β-구조는 조밀 포함 높은 순서 결정과 같은 β-시트는 수소 결합 3,4 안정화. 프리온 아밀로이드 모집에 대한 템플릿을 제공하고 단량체 단백질 변환 부 성장 가장자리에 β-가닥에 의한 자기 복제를 할 수 있습니다. &quot;단백질 만&quot;가설에 따르면, 프리온 단백질 아밀로이드 콘 포머 (conformer)가 단독 감염원이다. 그러나, 일부 다른 생체 분자 프리온 질환에 필수적인 것으로 제안되어있다. 예를 들어, 세포막 곳 어디 conversi 것으로 생각되고켜짐 일어나며 일부 음으로 하전 된 지질은 변환 처리 5,6-을 강화하는 것으로 나타났다. 또한, 일부 단백질은 또한 프리온 병리에 관여 할 수있다. Doppel 및 Shadoo 7,8 : 특히, 프리온 단백질 가족의 다른 두 멤버가있다. Doppel는 디 황화 다리와 안정 상대적으로 견고한 구조를 가지고 있으며, 아밀로이드 원 섬유 (9)에 자기 중합 집계에 실패합니다. 반면, 프리온 단백질과 유사하게, Shadoo 아밀로이드 피 브릴 구조로 β 시트 - 풍부 구조의 자기 준을 채택 할 수있다. 그것은 Shadoo가 기본 조건 또는 음전하 막 10, 11 바인딩에 피 브릴 수있는 것으로 나타났다. 아밀로이드 섬유 형상으로의 변환은 Shadoo 병리와 연관 될 수있다. 실제로, 아밀로이드 형 구조는 질병을 야기하는 메커니즘이 제대로 이해된다. Shadoo은 소수성 도메인 (HD)와 직렬의 Arg / 대 Gly 맺는 일련의 유사한 반복 t프리온 단백질 (도 1a)의 N- 말단 부분 O. 프리온 단백질의 N 말단 부분으로서, Shadoo 매우 양전하와 기본적으로 구조화 단백질 11,12 것으로 나타나고있다. 직접적 프리온 단백질에 결합 할 수 있기 때문에 Shadoo 프리온 질환과 기능적으로 관련이있을 것 같다. 또한, 그것의 발현은 다운 프리온 병리학 13,14 동안 조절된다. 그러나 프리온 질환에 Shadoo의 역할은 아직 확립되어 있지 않습니다. 우리는 마우스 Shadoo 유전자의 코딩 서열을 운반하는 플라스미드를 개발 하였다. E. 플라스미드를 형질 전환시켰다 대장균 N- 말단 그의 6 융합 Shadoo 단백질의 생산. 이 발현 시스템은 잘 우리의 실험실에 설립되어 일반적으로 우리의 진행하는 프로젝트 6,15,16에 사용됩니다. Shadoo의 표현을위한 중요한 문제는 E.의 선택 대장균 균주. 유능한 BL21 균주는 일반적으로 재조합 프로의 표현에 사용되는 동안teins Shadoo 성공적으로 표현하고 변환 된 SoluBL21 균주에서만 정제 하였다. SoluBL21 관할 E. 대장균 발현 상위 BL21에서 검출 가능한 가용성 생성물을 수득되지 단백질의 생산을 위해 개발 BL21의 숙주 균주의 개선 돌연변이이다. SoluBL21 E.에서 Shadoo의 높은 수준의 표현 대장균 봉입체에서 단백질의 축적에 이르게. 비 - 천연 단백질은 E. 고도로 표현된다 일반적인 기능뿐만 대장균은,이 단백질은 불용성 봉입체에 축적되는 경향이있다. Shadoo 아마 여러도에 접힌 단백질에 의해 형성 고농축 동적 구조 비공유 소수성 또는 이온의 상호 작용 (또는이 둘의 조합)을 통해 집계합니다. (I) 변성 매체로부터 다른 생체 단백질의 선택적 분리, (ⅱ) 정제 된 단백질의 탈 변성 시험 관내 폴딩에 사용 : 결과적으로, 정제는 적어도 두 개의 단계를 포함기법. Shadoo의 선택적 분리는 8M 우레아 (또는 대안 6M 염산 구아니딘)를 함유하는 완충액에 달성되었다. (ⅰ) 탈 변성을 산성 pH의 용액에서 Shadoo의 중합을 수득하여 pH ≥의 용액 7 비정형 단량체 Shadoo 단백질, 또는 (ⅱ) 탈 변성을 얻었다 : 우레아 및 제거 단백질의 탈 변성은 다양한 프로토콜을 적용하여 수행 할 수있다 특성 크로스 - β 시트 모티브와 안정 아밀로이드 섬유로.

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 유능한 대장균</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometar</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>단백질 크기 마커&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged 재조합 shadoo 단백질의 봉입체로 표현<em&gt; 대장균</em

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

대장균 발현 시스템은 재조합 진핵 단백질의 생산을위한 강력한 도구이다. 우리는 Shadoo, 프리온 가족에 속하는 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 봉입체 설명 된 바와 같이 (그의) 6 -tagged 재조합 Shadoo의 정제를위한 크로마토 그래피 방법을 표현했다. 봉입체는 8 M 유레아에 용해하고 이온 친 화성 크로마토 그래피를 수행하는 니켈 2+ -charged 칼럼에 결합된다. 결합 된 단백질은 이미 다졸 구배로 용출된다. Shadoo 단백질을 함유하는 분획을 고도로 정제 된 단백질을 수득하는 크기 배제 크로마토 그래피를 실시한다. 마지막 단계 정제 Shadoo에서 염, 우레아 및 이미 다졸을 제거하는 탈염된다. 재조합 Shadoo 단백질 프리온 질환에서 발생하는 단백질의 입체 장애의 생물 물리학 및 생화학 연구를위한 중요한 시약이다. 대부분의 보고서는 프리온 신경 퇴행성 질환이 자상의 증착에서 발생한 것을 증명제작은 아밀로이드 원 섬유를 주문했다. 산성 및 중성에서 아밀로이드 원 섬유로 Shadoo을 피 브릴하는 방법을 설명하는 샘플 프로토콜 / 기본 pH 값이 표시됩니다. 생산하고 신속하고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 Shadoo은, 프리온 질환에 작업 실험실에서 연구를 용이하게 할 수있다 피 브릴하는 방법에 대한 방법.

정제 Shadoo 단백질의 5-10 mg의 세균 배양 리터당 얻어진다. 두 단계의 정제는 고순도의 재조합 Shadoo을 구하는데 필요하다. 첫 번째 단계는 그의 - 태그 - 단백질을 유지하는 니켈 2 + -charged 컬럼 친 화성 크로마토 그래피에 의해 수행된다. 용출 분획을 SDS-PAGE를 실시하고 쿠마 브릴리언트 블루 (그림 5A)로 염색한다. Shadoo 단백질을 함유하는 분획을 모으고 또한 그 크기에 따라 분리하여 단백질을 크기 배제 크로마토 그래피 (Shadoo 분자량이 약 12​​ kDa의 경우)에 의해 정제된다. 용출에 수집 된 분획을 SDS-PAGE / 쿠마 분석 (그림 5B)에 의해 시각입니다. 또한 Shadoo은 단백질 C 말단 영역 (도 5C)로부터 76에서 1백5까지 아미노산 사이에 민감한 에피토프에 결합하는 특정 항 Shadoo 항체를 사용 SPRN 웨스턴 블롯에 의해 입증된다. <...

대장균에서 봉입체로 발현되는 재조합 Shadoo 단백질의 정제와 정제된 Shadoo를 아밀로이드 구조로 섬유화하는 프로토콜을 위한 2단계 크로마토그래피 방법이 설명되어 있습니다.

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged 재조합 Shadoo 단백질의 봉입체로 표현<em&gt; 대장균</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

본 절차의 전반적인 목표는 Escherichia coli에서 봉입체(inclusion bodies) 형태로 발현된 재조합 shadu 단백질을 정제하고, 이를 아밀로이드 섬유(amyloid fibrils)로 재접힘(refold)시키는 것입니다. 이 방법은 프리온 질환과 같은 단백질 구조 이상 질환의 분자 메커니즘 분야에서의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대량의 단백질을 신속하고 저렴한 비용으로 예측 및 확보할 수 있다는 점입니다. PET 28, his six SHADU 플라스미드로 수용성 BL21 박테리아를 형질전환하려면, 튜브 내의 박테리아 50 µL에 10~100 pg의 플라스미드 또는 1~5 µL를 혼합하십시오.세포를 42 °C에서 45초 동안 열충격(heat shock) 처리합니다. 40 mg/mL의 kanamycin이 첨가된 LB 배지를 넣고 박테리아를 배양합니다. 형질전환된 박테리아를 37 °C에서 배양하여 600 nm에서의 흡광도가 0.5에서 0.7에 도달하면, 240 µg/mL의 IPTG를 첨가하여 shadow 발현을 유도하고 배양합니다.박테리아를 37 °C, 150 RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다. 단백질을 정제하려면 박테리아 현탁액을 원심분리관으로 옮겨 2,500 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 재현탁을 위해 15 mL의 50 mM Tris, 10 mM EDTA pH 8 및 프로테아제 칵테일을 사용하십시오.각 펠릿은 500 milliliters의 세포 배양액으로부터 유래되었습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 과발현 여부를 확인한 후, 재현탁된 펠릿에 Triton X 100을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가합니다. 그다음, 현탁액을 37 °C의 항온수조에서 배양합니다. 이어서, 얼음물 속에서 현탁액을 6~12 microns로 초음파 처리합니다.박테리아 세포를 파쇄하기 위해 5분 동안 최대 진폭으로 초음파 처리합니다. 그 후 초음파 처리된 현탁액을 깨끗한 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 15,000 ×g, 4 °C 조건에서 15분 동안 원심분리합니다.S 상층액을 제거하기 위해 데칸테이션을 수행하고 튜브당 5 mL의 결합 버퍼를 추가합니다. 봉입체로부터 단백질을 완전히 재부유시키기 위해 튜브를 회전 휠에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 니켈 크로마토그래피를 수행합니다.0.2 M 황산니켈 수용액 10 mL를 spheros 컬럼에

purification-refolding-to-amyloid-fibrils-his-6-tagged-recombinant

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을...

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

APP 세포 도메인 (AICD)의 대규모 정화하기위한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 유도하는 방법을...

아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

단백질은 네이티브 구조를 채택하거나 불용성 아밀로이드로 잘못 접힐 수 있습니다. 잘못 접히는 경로를 선호하는 조건은 다양한 유형의 아밀로이드 섬유의 형성으로 이어집니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 in vitro에서 네이티브 단백질을 아밀로이드로 빠르게 전환할 수 있습니다.

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

fumarylacetotatetate하이드라세아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현 및 정제는 예시(대장균, FPLC에서발현)로 기재된다. 정제된 단백질은 결정화 및 항체 생산에 사용되며 효소 공아에 사용됩니다. 선택된 광측정 분석제는 옥살로아세테이트 데카르박실라제 및 아실피루베테 하이드로라제로서 FAHD1의 다기능성을 표시하기 위해 제시된다.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

학습하세요 대장균에서 봉입체로 발현된 재조합 Shadoo 단백질을 정제하고 아밀로이드 섬유로 리폴딩하는 이단계 크로마토그래피 방법을. 이 기술은 단백질 구조 장애 연구에 신속하고 비용 효율적인 단백질 생산을 가능하게 합니다.

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)

더 많은 동영상 탐색