고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

이 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립의 전반적인 목표는 고래류의 미오글로빈을 바다표범 및 다른 동물의 미오글로빈과 구별하는 것입니다. 이 방법은 고래 고기에 대한 신속한 현장 검사를 제공하여 불법 거래 및 소비를 억제할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 03g의 근육을 균질화한 후 5분에서 10분 안에 뛰어난 특이성과 민감도로 성공적인 결과를 직접 관찰할 수 있다는 것입니다.

따라서 이 방법은 현장에서 고래류 고기를 신속하게 감지할 수 있습니다. 말고기나 돼지고기와 같은 다른 고기에도 적용할 수 있습니다. 고래류의 미오글로빈에 대한 반응성을 가진 단클론 항체를 증가시키기 위한 합성 펩타이드를 설계하기 위해 다양한 동물의 미오글로빈 항원 반응성 영역의 아미노산 서열을 분석합니다.

먼저 GenBank에서 참치, 닭, 타조, 가축 포유류, 바다표범 및 18종의 고래류에서 추출한 미오글로빈의 아미노산 염기서열을 검색합니다. 그런 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 시퀀스를 정렬합니다. 실행 표시줄에서 Align Edit/Build Alignment를 선택하여 Alignment Explorer를 시작합니다.

새 선형 작성을 선택하고 확인을 클릭합니다. DNA 또는 단백질 염기서열 정렬을 구축하고 있는지 묻는 대화 상자가 나타납니다. Protein이라고 표시된 버튼을 클릭하고, Data Open Retrieve sequences from File을 선택한 다음 sequence file을 선택합니다. 편집 모두 선택 메뉴 명령을 선택하여 다중 시퀀스 정렬을 만들기 위해 데이터 집합의 모든 시퀀스에 대한 모든 사이트를 선택합니다.

메인 메뉴에서 Alignment by ClustalW를 선택합니다. BLOSUM을 단백질 중량 매트릭스로 선택한 다음 확인 버튼을 클릭합니다. 세 번째 단계는 서열 정렬을 분석하는 것입니다.

5개의 항원 반응 부위에 초점을 맞추고 고래류 사이에서 보존된 단편을 찾습니다. 별표는 정렬의 합의를 상징하며 완전히 보존된 단일 잔차가 있는 위치를 나타냅니다. 고래류에서 두 개의 보존된 단편이 발견되었습니다.

그런 다음 후보 서열 단편을 합성하여 단클론 항체를 발생시키는 데 사용합니다. 단클론 항체와 콜로이드 금 용액 혼합물을 2시간 동안 빨간색으로 유지하는 최소 pH로 정의된 콜로이드 금 용액에 대한 최적의 pH를 결정하여 이 절차를 시작합니다. pH 값이 5에서 9까지 다양한 100마이크로리터의 콜로이드 금 용액에 0.15마이크로그램의 정제된 검출 단클론 항체를 추가합니다.

이 시연의 목적을 위해 pH 6 및 pH 8을 테스트합니다. pH 8은 이 최적화 단계에서 최적의 pH로 간주되었습니다. 다음으로, pH 8에서 100마이크로리터의 콜로이드 금 용액에 다양한 양의 정제된 검출 단클론 항체를 첨가하여 단클론 항체의 최적 농도를 결정합니다.

이 연구에서 밀리리터당 6마이크로그램인 최적 농도는 혼합물의 색상을 검은색 침전물 없이 빨간색으로 유지합니다. 최적화 단계의 결과에 따라 10mL의 콜로이드 금 용액에 60마이크로그램의 정제된 검출 단클론 항체를 적하 방향으로 첨가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 부드럽게 유화합니다.

PBS에 있는 5%BSA 용액 2ml를 혼합물에 첨가하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 유화하여 배경 간섭을 줄입니다. 10, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 혼합물을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 접합되지 않은 항체가 포함된 상등액을 조심스럽게 제거하고 생성된 펠릿을 1%BSA 및 0.1%Tween-20을 함유한 PBS-T 4mL에 현탁시킵니다.

원심분리와 현탁액을 한두 번 반복합니다. PBS-T 1mL에 최종 침전물을 현탁시키고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 면역 스트립 디자인의 그래픽이 여기에 나와 있습니다.

판지, 패드 및 니트로셀룰로오스 멤브레인의 치수는 프로토콜 텍스트에 나열되어 있습니다. 보관 수명을 연장하려면 면역 스트립을 습도가 낮은 실험실 환경 조건에서 준비하고 조립해야 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 콜로이드 골드 표지 단클론 항체 용액을 접합체 패드에 첨가하여 포화시킨 다음 조립하기 전에 패드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 건조시킵니다.

접합체 패드가 건조되면 양면 테이프를 사용하여 먼저 니트로셀룰로오스 멤브레인을 판지에 붙입니다. 면역스트립 프린터를 사용하여 특정 항원 포획 단클론 항체와 신속한 항마우스 IGG를 각각 니트로셀룰로오스 멤브레인의 테스트 영역과 제어 영역에 분배합니다. 두 영역 사이에 5mm 이상의 거리를 유지하십시오.

그런 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인의 한쪽 면에 접합 패드를 붙이고 다른 면에 흡수 패드를 붙여넣고 각 면의 패드를 약 2mm씩 겹칩니다. 샘플 패드를 접합체 패드 위에 2mm 정도 놓고 판지에 붙입니다. 종이 커터를 사용하여 6mm 너비의 스트립을 만듭니다.

스트립을 건조제가 든 알루미늄 호일 백에 포장하고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 교차 반응성 테스트를 위한 샘플을 준비하려면 0.03g의 생근육에 0.1%BSA가 포함된 PBS 1mL를 추가합니다. 그리고 대나무 막대기 또는 분쇄 막대를 사용하여 샘플을 균질화하십시오.

면역 스트립의 끝을 테스트 영역 반대쪽으로 잡고 샘플 패드 부분을 5-10분 동안 검체에 담그십시오. 결과를 직접 관찰하십시오. 다양한 근육 샘플을 세 번 테스트합니다.

T 테스트 라인은 두 단클론 항체가 모두 고래류 미오글로빈을 검출할 때 긍정적인 신호를 표시하도록 설계되었습니다. 고래류가 아닌 동물의 미오글로빈은 이 두 단클론 항체 중 하나에 의해서만 검출될 수 있기 때문에 다른 동물의 근육 샘플을 테스트할 때 테스트 라인에서 음성 결과가 나타납니다. C 제어 라인은 신속한 안티 마우스 IGG가 콜로이드 골드 표지 검출 항체와 결합하기 때문에 항상 긍정적인 결과를 보여야 합니다.

Control 라인의 실패한 결과는 스트립의 재료 품질이 좋지 않음을 나타냅니다. 하이브리도마 상등액을 사용한 서양 혈액 분석은 CGF5H9 단클론 항체가 약 17kDa의 예상 분자량에서 고래류 및 기타 포유류를 단일 염색 띠로 검출한다는 것을 보여줍니다. 일반적인 밍크고래는 다른 고래류의 띠보다 비교적 희미한 띠를 보여줍니다.

참치, 바다표범, 닭고기에는 띠가 없습니다. 돼지의 경우 약 50kDa의 대역이 관찰됩니다. 점 혈액 분석에서도 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

CSF1H13 단클론 항체를 사용한 서양의 혈액 분석에서는 돼지와 참치에 대한 여러 개의 비특이적 띠가 나타나지만, CSF1H13은 고래류와만 반응하기 때문에 특이성이 매우 높습니다. 그리고 씰은 약 17kDa의 예상 분자량으로 밴드를 가지고 있습니다. 점 혈액 분석에서도 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

정제된 CGF5H9를 사용하여 다양한 종의 근육 추출물에 대한 간접 ELISA의 결과는 소, 염소, 개, 토끼 및 고래류에 대해 긍정적인 신호, 돼지에 대한 약한 긍정적인 신호, 참치, 닭 및 바다표범에 대한 부정적인 신호를 보여줍니다. CSF1H13는 고래류와 바다표범에 대한 높은 친화력을 보여줍니다. 두 단클론 항체 모두 서로 다른 과에 속하는 4가지 고래류 종 모두와 강력하게 반응할 수 있으며, 이는 다양한 고래류 종에 대한 광범위한 반응을 나타냅니다.

면역 콜로이드 금 스트립의 특이성은 이러한 대표적인 결과에 의해 나타납니다. 고래류가 아닌 근육 샘플을 사용하면 대조선에 단일 밴드만 생성됩니다. 그러나 고래 근육 샘플을 사용하면 신호 대역이 테스트 라인과 제어 라인 모두에 존재합니다.

일단 숙달되면 표지된 항체의 준비와 이러한 스트립 구성은 적절하게 수행되면 4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 펩타이드를 신중하게 설계하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 적절한 단클론 항체를 스크리닝하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다.

그리고 고품질의 콜로이드 금을 사용하여 표지된 항체를 준비합니다. 이러한 절차에 따라 PCR 기반 DNA 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 고래류 종 및 고래가 어디에서 왔는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 강하고 해양 포유류에만 친화력을 보이는 CSF1H13 단클론 항체는 해양 포유류에서 미오글로빈의 생물학적, 생리학적, 화학적 측면을 연구할 수 있는 다른 많은 기회를 제공하는 다양한 형태의 ELISA에 사용될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 특정 단클론 항체를 개발하고 이후에 빠른 테스트 스트립에 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.