고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

이 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립의 전반적인 목표는 고래류의 미오글로빈을 물개 및 기타 동물의 미오글로빈과 구별하는 것입니다. 이 방법은 고래류 육류에 대한 신속한 현장 스크리닝을 제공하여, 불법 거래 및 소비를 억제할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 0.3 g의 근육 조직을 균질화한 후 5분에서 10분 이내에 탁월한 특이성과 민감도로 성공적인 결과를 직접 확인할 수 있다는 점입니다.

따라서 이 방법은 현장에서 고래류 고기를 신속하게 검출할 수 있습니다. 또한 말고기나 돼지고기와 같은 다른 육류에도 적용 가능합니다. 고래류의 마이오글로빈에 반응성을 가진 단일클론항체를 생성하기 위한 합성 펩타이드를 설계하기 위해, 다양한 동물의 마이오글로빈 항원 반응 부위의 아미노산 서열을 분석합니다.

먼저 GenBank에서 참치, 닭, 타조, 가축 포유류, 물개 및 18종의 고래류의 마이오글로빈 아미노산 서열을 검색하여 가져옵니다. 그다음, 적절한 소프트웨어를 사용하여 서열을 정렬합니다. 런칭 바에서 Align Edit/Build Alignment를 선택하여 Alignment Explorer를 실행하십시오.

Create New Alignment을 선택하고 OK를 클릭하십시오. DNA 또는 단백질 서열 정렬을 구축하시겠습니까라고 묻는 대화 상자가 나타납니다. Protein이라고 표시된 버튼을 클릭하고, Data Open Retrieve sequences from File을 선택한 다음 서열 파일을 선택하십시오. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 데이터 세트 내 모든 서열의 모든 사이트를 선택하려면 Edit Select All 메뉴 명령을 선택하십시오.

메인 메뉴에서 Align by ClustalW 정렬을 선택하십시오. 단백질 가중치 행렬로 BLOSUM을 선택한 다음 확인 버튼을 클릭하십시오. 세 번째 단계는 서열 정렬을 분석하는 것입니다.

다섯 개의 항원 반응 부위에 집중하여 고래류 사이에서 보존된 단편을 찾습니다. 정렬에서 별표(*)는 합의 서열을 상징하며, 단일하게 완전히 보존된 잔기가 있는 위치를 나타냅니다. 고래류에서 두 개의 보존된 단편이 발견되었습니다.

그 후 후보 서열 단편을 합성하여 단클론 항체를 생성합니다. 단클론 항체와 콜로이드 금 용액 혼합물이 2시간 동안 붉은색을 유지하는 최소 pH로 정의되는 콜로이드 금 용액의 최적 pH를 결정함으로써 이 절차를 시작합니다. pH 값이 5에서 9까지 다양하게 설정된 100 µL의 콜로이드 금 용액에 0.15 µg의 정제된 검출 단클론 항체를 첨가합니다.

본 시연을 위해 pH 6과 pH 8을 테스트하였습니다. 이 최적화 단계에서는 pH 8이 최적의 pH인 것으로 판단되었습니다. 다음으로, pH 8의 콜로이드 금 용액 100 µL에 정제된 검출용 단클론 항체를 다양한 양으로 첨가하여 단클론 항체의 최적 농도를 결정하십시오.

본 연구에서 6 µg/mL로 확인된 최적 농도는 혼합물의 색상을 검은색 침전물 없이 붉은색으로 유지합니다. 최적화 단계의 결과에 따라, 정제된 검출 단클론 항체 60 µg을 콜로이드 금 용액 10 mL에 한 방울씩 첨가하십시오. 혼합물을 실온에서 10분 동안 부드럽게 유화시키십시오.

배경 간섭을 줄이기 위해 PBS 내 5% BSA 용액 2mL를 혼합물에 첨가하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 유화합니다. 혼합물을 4°C에서 10,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 결합되지 않은 항체가 포함된 상층액을 조심스럽게 제거하고, 생성된 펠릿을 1% BSA와 0.1% Tween-20가 포함된 PBS-T 4mL에 현탁합니다.

원심분리와 부유 과정을 한두 번 반복합니다. 최종 침전물을 1mL의 PBS-T에 부유시켜 사용 전까지 4°C에서 보관합니다. 면역 스트립 설계도는 여기에서 확인할 수 있습니다.

카드보드, 패드 및 니트로셀룰로오스 막의 치수는 프로토콜 텍스트에 기재되어 있습니다. 저장 수명을 연장하기 위해, 면역 스트립은 습도가 낮은 실험실 환경 조건에서 준비 및 조립해야 합니다. 마이크로피펫을 사용하여 콜로이드 금 표지 단클론 항체 용액을 컨쥬게이트 패드에 추가하여 포화시킨 후, 조립 전 37 °C에서 1시간 동안 패드를 건조시키십시오.

접합 패드가 마르면, 양면테이프를 사용하여 니트로셀룰로오스 막을 먼저 카드보드에 부착합니다. 면역스트립 프린터를 사용하여 니트로셀룰로오스 막의 테스트 존과 컨트롤 존에 각각 특이적 항원 캡처 단일클론 항체와 신속 항-마우스 IGG를 분주합니다. 두 존 사이의 거리는 5 mm 이상으로 유지합니다.

그런 다음 접합 패드를 니트로셀룰로오스 막의 한쪽에 붙이고, 흡수 패드를 반대쪽에 붙여 양쪽 패드가 약 2 mm 정도 겹치게 합니다. 샘플 패드를 접합 패드 위에 2 mm 정도 겹쳐서 카드보드 위에 붙입니다. 종이 절단기를 사용하여 너비 6 mm의 스트립으로 자릅니다.

스트립을 건조제와 함께 알루미늄 호일 봉투에 넣어 밀봉하고, 사용 전까지 4°C에서 보관하십시오. 교차 반응성 테스트를 위한 시료를 준비하려면, 0.03g의 생근육에 0.1%BSA가 포함된 PBS 1mL를 첨가하십시오. 그 다음 대나무 스틱이나 분쇄봉을 사용하여 시료를 균질화하십시오.

검사 영역의 반대쪽 끝부분을 잡고 샘플 패드 부분을 검체에 5~10분 동안 담그십시오. 결과를 직접 관찰하십시오. 다양한 근육 샘플을 3회 반복 테스트하십시오.

T 테스트 라인은 두 종류의 단클론 항체가 모두 고래류의 마이오글로빈을 검출할 때 양성 신호를 나타내도록 설계되었습니다. 비고래류 동물의 마이오글로빈은 이 두 단클론 항체 중 하나에 의해서만 검출될 수 있으므로, 다른 동물의 근육 샘플을 테스트하면 테스트 라인은 음성 결과를 나타냅니다. C 대조 라인은 신속 항-마우스 IGG가 콜로이드 금 표지 검출 항체와 결합하기 때문에 항상 양성 결과를 나타내야 합니다.

대조선(Control line)에서 결과가 나타나지 않은 것은 스트립 내 재료의 품질이 낮음을 나타냅니다. 하이브리도마 상청액을 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과, CGF5H9 단클론 항체는 고래류 및 기타 포유류를 약 17kDa의 예측 분자량에서 단일 염색 밴드로 검출합니다. 밍크고래의 경우 다른 고래류의 밴드보다 상대적으로 흐린 밴드를 보입니다.

참치, 물개, 닭에서는 밴드가 나타나지 않았습니다. 반면, 돼지에서는 약 50kDa에서 밴드가 관찰되었습니다. 도트 혈액 분석에서도 동일한 결과가 얻어졌습니다.

CSF1H13 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 혈액 분석 결과 돼지와 참치에서 다수의 비특이적 밴드가 관찰되었으나, CSF1H13은 고래류에만 반응하므로 특이성이 매우 높습니다. 또한 물개는 약 17kDa의 예측 분자량에서 밴드가 나타납니다. 도트 블롯 혈액 분석에서도 동일한 결과가 얻어집니다.

정제된 CGF5H9를 사용하여 다양한 종의 근육 추출물을 대상으로 간접 ELISA를 수행한 결과, 소, 염소, 개, 토끼 및 고래류에서는 양성 신호가, 돼지에서는 약한 양성 신호가 나타났으며, 참치, 닭 및 물개에서는 음성 신호가 나타났습니다. CSF1H13은 고래류와 물개에 대해 높은 친화력을 보였습니다. 두 단클론 항체 모두 서로 다른 과에 속하는 네 가지 고래류 종 모두와 강하게 반응하였으며, 이는 다양한 고래류 종에 대한 광범위한 반응성을 나타냅니다.

면역 콜로이드 금 스트립의 특이성을 이 대표적인 결과들로 확인할 수 있습니다. 고래류가 아닌 근육 샘플을 사용한 경우, 대조선(control line)에만 단일 밴드가 나타납니다. 반면, 고래류 근육 샘플을 사용하면 테스트선(test line)과 대조선 모두에서 신호 밴드가 나타납니다.

숙달되면, 적절하게 수행했을 때 표지 항체 준비와 스트립 제작은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 펩타이드를 신중하게 설계하는 것이 중요합니다. 적합한 단클론 항체를 선별하기 위해 여러 가지 방법을 사용하십시오.

그리고 라벨링된 항체를 준비하기 위해 고품질의 콜로이드 금을 사용하십시오. 이러한 절차에 따라, 고래류의 종 및 유래지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 PCR 기반 DNA 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 해양 포유류에 대해서만 강한 친화력을 보이는 CSF1H13 단클론 항체는 다양한 형태의 ELISA에 활용될 수 있으며, 이는 해양 포유류 마이오글로빈의 생물학적, 생리학적 및 화학적 측면을 연구할 수 있는 많은 다른 기회를 제공합니다.

이 영상을 시청한 후, 특이적 단클론 항체를 제작하고 이를 신속 진단 스트립에 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.