Name: 독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 학습하세요 공기 샘플링 필터에서 독소와 DNA를 추출하고 정량 분석하는 방법을. 석영 섬유 필터를 사용하여 실내외 생물 에어로졸 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 분석 기법을 제공합니다.

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저자는 Weizmann Institute 화학부의 Yoav Barak 박사에게 지원과 조언을 아끼지 않은 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단(보조금 # 913/12)과 미네르바 재단의 지원을 받았으며 독일 연방 교육 연구부의 자금 지원을 받았습니다.

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<li>Hospodsky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+airborne+fungal+and+bacterial+concentrations+and+emission+rates+in+six+occupied+children%27s+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms.</a> Indoor air. , (2014).</li>
<li>Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+Bacterial+Populations+Above+Desert+Soils+of+the+McMurdo+Dry+Valleys%2C+Antarctica%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica.</a> Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).</li>
<li>Ovadnevaite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+NE+Atlantic+marine+aerosol+chemical+composition+and+abundance%3A+Seasonal+trends+and+air+mass+categorization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Geophys.+Res.+Atmos%22%5BJournal%5D)">Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization.</a> J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).</li>
<li>Lodge, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ES%26T+Books%3A+Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%2C+3rd+ed%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed.</a> Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Aerosol+Measurement%3A+Principles%2C+Techniques%2C+and+Applications%22">Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications</a>. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
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<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Lewtas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+combustion+emissions%3A+Characterization+of+causative+agents+and+mechanisms+associated+with+cancer%2C+reproductive%2C+and+cardiovascular+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.-Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects.</a> Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).</li>
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<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3A+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Diath.+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
<li>O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+production%3A+a+review+of+the+current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol production: a review of the current knowledge.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).</li>
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<li>Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+next-generation+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+with+quantitative+PCR+%28qPCR%29+for+enumeration+of+Cryptosporidium+oocysts+in+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples.</a> Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).</li>
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<li>Ebentier, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+a+suite+of+qPCR-based+microbial+source+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods.</a> Water Res. 47, 6839-6848 (2013).</li>
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이 작품은 필터에 수집 된 에어로졸 샘플에서 독소와 DNA의 존재를 모두 정량 추출 및 검출 방법을 설명합니다. 정확한 방법은 루틴을 필요로 한 실험자 여기서 설명한 몇몇 필수적인 중요한 점 접착 쉽게 수행 될 수있다. 독소 검출 단계, 파쇄 용액은 매우 점성과 피펫에 버블을 생성하는 경향이 있습니다. 너를 거품 제거하기 곤란하며, 이들은 마이크로 플레이트 리더 값의 변화로 이어질. 따라서, 먼저, 플레이트에만 모든 기포가 사라진 것을 확인한 뒤, 시료를 배치 분해물 용액의 첨가를 계속하는 것이 중요하다. 이 단계에서 기포 형성을 방지하는 유용한 기술 피펫 느리게 작동하고, 웰에 파쇄물을 배출 할 때 모든 방법을 눌러 아니다. 해물이 endoto에 추가되면 반응으로 즉시 시작신화는 가능한 빨리 판독을 시작하는 것이 필수적이며, 추출한다. 분해물 첨가 공정을 단축하기 위해, 멀티 채널 피펫이 사용될 수있다. 이 마이크로 킥킥 웃음 플레이트에 배치 한 후 일부 키트 프로토콜에 1...

필터에 공기 샘플링 대기 에어로졸 연구에서 기본적인 도구이다. 한 샘플링 필터는 다양한 화학적, 물리적, 및 수집 된 주변 입자의 생물학적 특성화를위한 시작점이다. 2-11이 방법의 장점은 여러 가지 분석 될 수 있다는 동일한 샘플에 오프라인으로 수행. 연구원을 모든 다른 분석에서 데이터를 가능하게 컴파일하면 대기 과학 분야의 복잡한 문제 해결에 수집 된 입자와 보조기구의 특성을 잘 이해를 얻을. 12, 13 예를 들어, 해양 및 내륙 공기 샘플은 같은 기간 동안 촬영 기간이 연구 샘플링 입자 독성 생물 조성물. (14)에 대해 비교 될 수 있으며, 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), 또한 내 독소라고도 그람 음성 박테리아 세포 벽의 성분은 육상과 샘플링 필터로부터 추출 된 내륙 사이트 및 사용하여 평가 하였다물러 amebocyte 용 해물 (LAL) 테스트. 병행하여, 박테리아 게놈 콘텐츠 평가 (총 세균, 그램 네거티브 및 시아 노 박테리아) 정량 중합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 사용하여 동일한 샘플상에서 수행 하였다. LAL 시험 독소를 함유하는 수용액에, 참게, 물러의 polyphemus에서 amebocytes의 수성 추출물을 첨가 한 다음에 형성 탁도 측정에 기초한다. 샘플에서 높은 내 독소 농도는 빠른 탁도 발생한다. 15 Q-PCR 분석은 특정한 DNA 단편을 증폭으로 방출 형광 신호에 기초한다. (16) 신호의 실시간 모니터링함으로써 PCR의 지수 단계 표준 곡선과의 반응 및 교정은 초기 DNA 량을 정량 할 수있다. 이 두 가지의 조합은 다른 설명 된대로, 14 및 독소의 레벨의 양호한 추정을 제공 할 수있는 다른 사람들과 함께 분석샘플 소스 박테리아의 양. 여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 에어로졸의 물리적 및 무기 화학 특성을 샘플링하는 방법은,보다 최근에 방법이 그 유기물 성분을 조사하기 위해 개발 된 공지되어 있지만,도 17은 에어로졸의 생물학적 성분에 부족한 연구되고있다. (18)는 현재의 근거 방법은 구체적으로, 추출 분석 및 공기 에어로졸 생물학적 부분을 식별하기위한 강력한 방법을 제공함으로써이 갭을 해결하는 것이다. (14) 여기에 설명 된 방법은 필터의 분석을 포함하는 생물학적 실내 및 실외 에어로졸 연구 프로젝트에 대폭적인 사용을 찾을 것으로 예상된다. 20-24

<table><tbody><tr><td>Filter Sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - 대용량 공기 샘플러</td><td>Ecotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>석영 극세사 필터</td><td>Whatman</td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - 실험실 챔버 용광로</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>오팔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Endotoxin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16368&nbsp;</td><td>실험실 시약, 96%</td></tr><tr><td>Airstream Class II 생물 안전 캐비닛 AC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>제어 표준 Cape Cod, Inc.의</td> <td>내독소</td> 협회<td>E0005-1</td><td>대장균&nbsp; O113 : H10, 0.5 &마이크로; g/바이알 1</td></tr>팩 <tr><td>LAL 시약 Water</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr>Luer-Lok Tip <td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>가 있는 10ml 멸균 주사기</td><td></td><td></td>309605</tr><tr><td>BD Precisionglide 주사기 바늘</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>305129</td><td>멸균&nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm-M 밀봉 테이프</td><td>Parafilm</td><td>P7543</td><td>Sigma 카탈로그 번호</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml, 발열원</td></tr><tr><td>무료 1.12 cm 직경 Cork Borer</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601 BD 시리즈 - 스틸</td><td>다양한 직경의 보어를 포함하는 코르크 보어 세트의 일부입니다.</td></tr><tr><td>50mm 페트리 디쉬</td><td>미니플라스트 아인-쉐머</td><td>72050-01</td><td>무균</td></tr><tr><td>소용돌이 지니 2&nbsp;</td><td>과학 산업, inc.</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 5415 D</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI 뚜껑 포함</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Flat bottom wells (뚜껑 포함(개별 포장)), sterile, pyrogen free</td></tr><tr><td>Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader</td><td>Biotek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA away</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>관심 미생물 종의 표준 DNA</td><td>ATCC 또는 기타 배양 수집</td><td></td><td>DNA 추출에 적합한 미생물 균주 또는 추출된 DNA</td></tr><tr><td>Neubauer-Improved</td><td>Marienfeld</td><td>640030</td><td>혈구계</td></tr><tr><td>TE 버퍼, Low EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)&nbsp; 0.1mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 PCR 등급 물&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>는 관심 미생물 종을 대상으로</td></tr> 합니다. <tr><td>Dual-Labeled Probes</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>는 관심 미생물 종을 대상으로 합니다</td></tr>. <tr><td>스크류 캡 튜브</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PowerSoil DNA 추출 키트&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬, 산 세척 425-600 &micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬, 산성 세척 < 106 &마이크로; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>세포 용해 완충액, Power Soil Kit</td></tr><tr><td>Magic Touch 얼음 양동이</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Splash-Free 96-Well Base</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>Rotor A-4-62 with MTP buckets&nbsp;</td></tr></tbody></table>

독소와 dna 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

야외 에어로졸 연구는 일반적으로 필터에 샘플링 된 입자상 물질을 사용합니다. 이 절차는 수집 된 입자의 다양한 특성 분석이 병렬로 수행 될 수있다. 여기에 제시된 방법의 목적은 필터로부터 추출한 생체 에어로졸 독소 및 DNA 콘텐츠 매우 정확하고 신뢰성있는 분석을 얻을 수있다. 샘플링 필터와 리포 폴리 사카 라이드와 같은 고 분자량의 유기 분자의 추출은 발열원이없는 수성 매질에서 샘플을 진동하는 것을 포함한다. 후속 분석을 혼탁도 측정을 이용하여 검출 할 수 효소 반응에 기초한다. 샘플링 필터에 대한 높은 유기 함량의 결과로서, 샘플의 DNA의 추출은 원래의 토양에 대한 설계 DNA 수율을 개선하기 위해 수정 된 상업적인 DNA 추출 키트를 사용하여 수행된다. 검출 및 정량 중합 효소 연쇄를 Reacti를 이용하여 특정 종의 미생물 정량(Q-PCR) 분석 기술 및 사용 가능한 다른 방법과 비교된다.

그것은 &quot;오프라인&quot;샘플링 필터를 분석을 사용하여 대기 에어로졸을 학습하는 것이 일반적이다 (도 2 참조). (32) 화학 샘플링없이 유기 (예 : 단백질, 탄화수소 분자 당) 및 무기 (예를 들어 금속 염)을 포함하는 콘텐츠 분석 . 생물학적 분석 가능한 비 생존 미생물 함량 DNA 방법 또는 현미경을 사용하여 종 식별뿐만 아니라 기반 DNA 정량을 포함한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53444/53444fig2.jpg" /> 도 2 : 파일러 시료 분석 흐름도 공기 샘플링 (A) 후 필터...

공기 샘플링 필터에서 대기 중 생물학적 입자에 대한 두 가지 상호 보완적인 분석, 즉 내독소 및 DNA의 추출 및 검출에 대해 설명합니다.

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

이 절차의 전반적인 목표는 필터로 채집한 부유 입자 추출물의 엔도톡신 및 DNA 함량을 정확하게 분석하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 건강상의 이유를 이해하는 것과 같이 실내 및 실외 생물학적 에어로졸 연구의 주요 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 필터 채집 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Yinon Mazar이 진행하겠습니다.대용량 시료 채취를 위해서는 석영 섬유로 제작된 필터를 사용하십시오. 또는 연구 목적에 가장 적합한 특정 유형의 필터와 필터 컷오프 크기를 선택하십시오. 유기 및 생물학적 화합물 시료 채취용 필터는 먼저 알루미늄 호일로 개별 포장하여 사전 베이킹(Prebake)하십시오.그 다음 실험실 전기로에서 450 °C로 최소 5시간 동안 가열합니다. 이렇게 하면 기존의 모든 유기 잔류물이 제거됩니다. 가열된 필터는 샘플링에 사용할 때까지 20 °C에서 보관하십시오.다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 것과 같은 대용량 시료 채취기를 세척하고 소독하십시오. 그런 다음, 미리 구운 필터를 필터 카세트에 넣고 제조업체의 지침에 따라 시료 채취기를 작동시켜 적절한 시료를 수집합니다. 2등급 생물안전 작업대 내에서, 깨끗한 1.12 centimeter 직경의 코르크 보러를 사용하여 깨끗하고 미리 구운 필터 재료를 22개의 원형 조각으로 절단하십시오.이 조각들을 사용하여 대조군으로 사용할 다양한 농도의 엔도톡신 스파이크 필터를 준비하십시오. 다음으로, 수집된 샘플이 포함된 필터를 깨끗한 1.12 centimeter 직경의 코르크 보러(cork borer)를 사용하여 절단하고, 각 샘플을 개별적인 파이로젠 프리 2 milliliter 튜브에 넣으십시오. 또한, 건조된 엔도톡신 스파이크 필터도 각각 별도의 파이로젠 프리 2 milliliter 튜브로 옮기십시오.각 튜브에 발열성 물질 제거수(pyrogen free water) 1 mL를 추가합니다. 그런 다음 실험실 쉐이커를 사용하여 실온에서 60분 동안 흔들어 줍니다. 다음으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플 튜브를 375 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.그다음, 엔도톡신이 포함된 상층액을 새로운 파이로젠 프리(pyrogen free) 2 mL 튜브로 옮깁니다. 엔도톡신 테스트를 위해 뚜껑이 있는 파이로젠 프리 96-웰 평저 마이크로플레이트를 준비합니다. 먼저 샘플 위치를 배치하십시오.다음으로, 마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 37 °C에서 5분마다 흔들어주는 kinetic 반응으로 설정합니다. 이후 405 nm에서 측정을 수행합니다. 5분 간격의 쉐이킹과 플레이트 판독을 18회 반복합니다.필터를 스파이크하는 데 이전에 사용한 표준 엔도톡신 용액 50 µL를 A1에서 A10 및 B1에서 B10 행에 넣어 샘플을 플레이트에 로드합니다. 공시료(blank)를 A11, A12, B11 및 B12에 넣습니다. 그다음, 원심분리한 스파이크 필터 추출물과 해당 공시료의 상층액을 C 및 D 행에 추가합니다. 마지막으로, 실험 샘플과 공시료의 상층액을 필요에 따라 나머지 웰에 추가합니다.검사를 활성화하려면, 각 웰에 50 µL의 limulus amebocyte lysate 용액을 빠르게 첨가하십시오. 플레이트를 수평으로 가볍게 흔들어 줍니다. 그 후 플레이트 리더에 넣고 실험 분석을 시작하십시오.완료되면 플레이트 리더에서 플레이트를 꺼냅니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 엔도톡신 수준을 결정하고, 샘플 필터에서 엔도톡신이 추출되는 효율을 계산합니다. 먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA가 첨가된 필터를 준비합니다.각 필터 샘플에 대해, 직경 425~600 µm의 비드 0.1 g과 직경 106 µm 이하의 비드 0.3 g을 혼합하여 0.5 mL 멸균 튜브에 준비합니다. 다음으로, 소독된 직경 1.12 cm 코르크 보러를 사용하여 각 필터 샘플의 무작위 위치에서 원형 조각 3개를 절단합니다. 절단한 필터 샘플을 각각의 스크류 캡 2 mL 튜브에 넣습니다.그다음, DNA 추출 키트에 제공된 세포 용해 버퍼 60 µL와 함께 유리 비드 혼합물을 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 닫고 샘플을 비드 비터(bead beater)에 넣습니다. 비드 비터를 사용하여 여과된 세포를 1분 동안 기계적으로 파쇄한 후, 샘플을 얼음에 1분 더 놓아 냉각시킵니다.이 사이클을 5회 반복합니다. 키트 공급업체의 프로토콜에 따라 용해된 세포에서 DNA를 추출하십시오. 용출 후, DNA 수율을 높이기 위해 용출된 샘플을 추출 컬럼에 한 번 더 로드하십시오.정량적 PCR 기기가 예열될 수 있도록 미리 전원을 켭니다. 기기 운용 소프트웨어의 새 프로그램 파일에 정량적 PCR 실행 세부 사항을 입력합니다. 다음으로, 표면 DNA 제오염제를 사용하여 작업대를 소독하고, 반드시 멸균된 튜브, 팁 및 시약만을 사용하십시오.또한, 작업대 옆에 얼음 버킷을 두고 tac polemoraris 믹스를 버킷에 넣습니다. 첨부된 텍스트 프로토콜의 표 4에 기술된 대로 정량 PCR 반응 믹스를 준비합니다. 그리고 반응 믹스는 사용할 때까지 암소의 얼음 위에서 보관하십시오.다음으로, 깨끗한 마이크로플레이트를 플레이트 홀더에 거치하여 작업 표면에 닿지 않게 하고 청결 상태를 유지합니다. 정량 PCR 마이크로플레이트의 웰에 표준 DNA, 샘플 DNA 또는 nuclease-free water를 1 µL씩 3반복으로 분주합니다. 그런 다음, 각 반응 웰에 마스터 반응 믹스를 9 µL씩 추가합니다.완료되면 플레이트를 광학 접착 필름으로 덮고 모든 면을 단단히 밀봉합니다. 써모사이클러에 넣기 전, 플레이트 버킷이 장착된 원심분리기에서 1000 ×g로 1분간 원심분리합니다. 마지막으로, 준비된 정량 PCR 프로그램을 활성화하여 실행합니다.내독소 추출 과정에서, 필터 샘플을 원심분리기에서 회전시켜 필터로부터 내독소를 추출합니다. 원심분리 속도에 따라 추출 효율이 달라지며, 특히 내독소 농도가 높을 때 이러한 차이가 두드러집니다.선택한 특정 필터와 수행한 프로토콜에 대해 추출 효율의 예비 테스트를 실시해야 합니다. 깨끗한 필터에 스파이킹했을 때의 추출 효율은 샘플링된 석영 필터보다 높게 나타나며, 이 두 효율 모두 표준 용액을 직접 검출했을 때보다 낮습니다. 숙달된 이후에는 적절하게 수행할 경우 엔도톡신 분석을 3시간 30분 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 마친 후, 대기 중 생물체의 이동과 관련된 추가적인 의문점을 해결하기 위해 DNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 공기 시료 필터에서 엔도톡신과 DNA를 효율적으로 추출하고 이를 정확하게 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 비디오는 화학발광 기반 방법을 통해 전혈 샘플의 내독소 활성을 조사하기 위한 신속한 생물학적 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 내독소 매개 패혈증의 조기 진단을 위한 빠르고 민감한 바이오마커 검사입니다.

내독소 활성 분석: 혈액 샘플의 내독소 활성을 조사하기 위한 화학발광 기반 생물학적 분석

이 비디오는 PEGylated 리포솜 독소루비신 나노 제형에서 내독소 오염을 추정하기 위한 Limulus amoebocyte lysate(LAL) 분석의 탁도 측정 형식을 설명합니다. 내독소와 LAL 시약의 반응에 따른 용액의 탁도는 샘플의 내독소를 추정하는 데 도움이 됩니다.

탁도 측정 Limulus Amoebocyte 용해물 분석: 나노 제형 약물에서 내독소 오염을 검출하고 정량화하는 기술

이 비디오는 투구게의 혈액 세포에서 유래한 Limulus Amoebocyte Lysate를 사용하여 나노 제형에서 박테리아 내독소의 존재를 결정하기 위한 겔 응고 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 나노 기반 제형을 포함한 의약품의 내독소 오염을 테스트하는 데 도움이 됩니다.

Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay: 나노 입자 제형에서 박테리아 내독소 검출 방법

이 비디오는 대식세포에서 전사 인자인 핵인자-카파-B(NF-κB) 및 활성인자 단백질-1(AP-1)의 톨-유사 수용체(TLR) 의존적 활성을 조사하는 분석을 보여줍니다. TLR은 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 인식하면 전염증 신호 연쇄 반응을 유발하여 NF-κB 및 AP-1을 활성화합니다. 공학적 리포터 대식세포는 NF-κB 및 AP-1 활성화 시 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP)를 생성하며, 이는 발색 반응을 통해 검출됩니다.

대식세포의 TLR-dependent NF-&kcy;B/AP-1 transcription factor signaling에 대한 분석

필터 카트리지로 물을 여과하고 필터를 제거하기 위해 하우징을 절단하지 않고도 환경 DNA(eDNA)를 추출하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 어류의 eDNA를 메타바코딩하기 위해 개발되었지만 다른 유기체의 eDNA에도 적용할 수 있습니다.

여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 건강 위험을 식별 하기 위해 산업 보건 연구에 활용 방법입니다. 이 프로토콜 설명 증폭 및 곰 팡이 지역의 시퀀싱에 대 한 직업 공기 샘플에서 DNA를 추출을 합니다. 이 이렇게 많은 곰 팡이 종 전통적인 평가 방법에 의해 간과 수 있습니다 감지 합니다.

수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출

우리는 인간 전혈 샘플의 내독소 활성을 침대 옆에서 측정하는 프로토콜을 제시한다. 내독소 활성 분석실험은 수행하기 위한 간단한 검사이며 패혈증을 가진 중증 환자에서 유용한 바이오마커일 수 있다.

중증 환자에서 전혈 내독소 혈증 검출을 위한 내독소 활성 분석

환경 미 립 자 물질의 생물 학적 구성을 이해 하는 것은 인간의 건강과 질병 확산에 중요 한 영향의 연구에 대 한 중요 하다입니다. 여기, 우리 사용 bioaerosol 샘플링 방법의 세 가지 유형 및 공 수 미생물의 생물 학적 분석 더 나은 다른 환경 조건 하에서 공 수 미생물 지역 사회를 탐구.

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조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

신뢰할 수 있고 정확한 현장 배치 가능한 DNA 분석은 많은 산업에서 매우 중요합니다. 본 논문은 현장에서 환경 미생물 분석을 위한 두 가지 방법을 제시합니다: 1) 생물학적 추출 필드 키트를 이용한 환경 샘플에서 미생물 DNA를 분리하는 방법, 2) 현장 qPCR 유닛을 통한 DNA 분석.

생물학적 추출 필드 키트와 현장 qPCR 유닛을 이용한 현장 내 미생물 DNA 분석

학습하세요 공기 샘플링 필터에서 독소와 DNA를 추출하고 정량 분석하는 방법을. 석영 섬유 필터를 사용하여 실내외 생물 에어로졸 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 분석 기법을 제공합니다.

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

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