독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

이 절차의 전반적인 목표는 필터로 채집한 부유 입자 추출물의 엔도톡신 및 DNA 함량을 정확하게 분석하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 건강상의 이유를 이해하는 것과 같이 실내 및 실외 생물학적 에어로졸 연구의 주요 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 필터 채집 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Yinon Mazar이 진행하겠습니다.

대용량 시료 채취를 위해서는 석영 섬유로 제작된 필터를 사용하십시오. 또는 연구 목적에 가장 적합한 특정 유형의 필터와 필터 컷오프 크기를 선택하십시오. 유기 및 생물학적 화합물 시료 채취용 필터는 먼저 알루미늄 호일로 개별 포장하여 사전 베이킹(Prebake)하십시오.

그 다음 실험실 전기로에서 450 °C로 최소 5시간 동안 가열합니다. 이렇게 하면 기존의 모든 유기 잔류물이 제거됩니다. 가열된 필터는 샘플링에 사용할 때까지 20 °C에서 보관하십시오.

다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 것과 같은 대용량 시료 채취기를 세척하고 소독하십시오. 그런 다음, 미리 구운 필터를 필터 카세트에 넣고 제조업체의 지침에 따라 시료 채취기를 작동시켜 적절한 시료를 수집합니다. 2등급 생물안전 작업대 내에서, 깨끗한 1.12 centimeter 직경의 코르크 보러를 사용하여 깨끗하고 미리 구운 필터 재료를 22개의 원형 조각으로 절단하십시오.

이 조각들을 사용하여 대조군으로 사용할 다양한 농도의 엔도톡신 스파이크 필터를 준비하십시오. 다음으로, 수집된 샘플이 포함된 필터를 깨끗한 1.12 centimeter 직경의 코르크 보러(cork borer)를 사용하여 절단하고, 각 샘플을 개별적인 파이로젠 프리 2 milliliter 튜브에 넣으십시오. 또한, 건조된 엔도톡신 스파이크 필터도 각각 별도의 파이로젠 프리 2 milliliter 튜브로 옮기십시오.

각 튜브에 발열성 물질 제거수(pyrogen free water) 1 mL를 추가합니다. 그런 다음 실험실 쉐이커를 사용하여 실온에서 60분 동안 흔들어 줍니다. 다음으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 샘플 튜브를 375 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

그다음, 엔도톡신이 포함된 상층액을 새로운 파이로젠 프리(pyrogen free) 2 mL 튜브로 옮깁니다. 엔도톡신 테스트를 위해 뚜껑이 있는 파이로젠 프리 96-웰 평저 마이크로플레이트를 준비합니다. 먼저 샘플 위치를 배치하십시오.

다음으로, 마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 37 °C에서 5분마다 흔들어주는 kinetic 반응으로 설정합니다. 이후 405 nm에서 측정을 수행합니다. 5분 간격의 쉐이킹과 플레이트 판독을 18회 반복합니다.

필터를 스파이크하는 데 이전에 사용한 표준 엔도톡신 용액 50 µL를 A1에서 A10 및 B1에서 B10 행에 넣어 샘플을 플레이트에 로드합니다. 공시료(blank)를 A11, A12, B11 및 B12에 넣습니다. 그다음, 원심분리한 스파이크 필터 추출물과 해당 공시료의 상층액을 C 및 D 행에 추가합니다. 마지막으로, 실험 샘플과 공시료의 상층액을 필요에 따라 나머지 웰에 추가합니다.

검사를 활성화하려면, 각 웰에 50 µL의 limulus amebocyte lysate 용액을 빠르게 첨가하십시오. 플레이트를 수평으로 가볍게 흔들어 줍니다. 그 후 플레이트 리더에 넣고 실험 분석을 시작하십시오.

완료되면 플레이트 리더에서 플레이트를 꺼냅니다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 엔도톡신 수준을 결정하고, 샘플 필터에서 엔도톡신이 추출되는 효율을 계산합니다. 먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA가 첨가된 필터를 준비합니다.

각 필터 샘플에 대해, 직경 425~600 µm의 비드 0.1 g과 직경 106 µm 이하의 비드 0.3 g을 혼합하여 0.5 mL 멸균 튜브에 준비합니다. 다음으로, 소독된 직경 1.12 cm 코르크 보러를 사용하여 각 필터 샘플의 무작위 위치에서 원형 조각 3개를 절단합니다. 절단한 필터 샘플을 각각의 스크류 캡 2 mL 튜브에 넣습니다.

그다음, DNA 추출 키트에 제공된 세포 용해 버퍼 60 µL와 함께 유리 비드 혼합물을 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 닫고 샘플을 비드 비터(bead beater)에 넣습니다. 비드 비터를 사용하여 여과된 세포를 1분 동안 기계적으로 파쇄한 후, 샘플을 얼음에 1분 더 놓아 냉각시킵니다.

이 사이클을 5회 반복합니다. 키트 공급업체의 프로토콜에 따라 용해된 세포에서 DNA를 추출하십시오. 용출 후, DNA 수율을 높이기 위해 용출된 샘플을 추출 컬럼에 한 번 더 로드하십시오.

정량적 PCR 기기가 예열될 수 있도록 미리 전원을 켭니다. 기기 운용 소프트웨어의 새 프로그램 파일에 정량적 PCR 실행 세부 사항을 입력합니다. 다음으로, 표면 DNA 제오염제를 사용하여 작업대를 소독하고, 반드시 멸균된 튜브, 팁 및 시약만을 사용하십시오.

또한, 작업대 옆에 얼음 버킷을 두고 tac polemoraris 믹스를 버킷에 넣습니다. 첨부된 텍스트 프로토콜의 표 4에 기술된 대로 정량 PCR 반응 믹스를 준비합니다. 그리고 반응 믹스는 사용할 때까지 암소의 얼음 위에서 보관하십시오.

다음으로, 깨끗한 마이크로플레이트를 플레이트 홀더에 거치하여 작업 표면에 닿지 않게 하고 청결 상태를 유지합니다. 정량 PCR 마이크로플레이트의 웰에 표준 DNA, 샘플 DNA 또는 nuclease-free water를 1 µL씩 3반복으로 분주합니다. 그런 다음, 각 반응 웰에 마스터 반응 믹스를 9 µL씩 추가합니다.

완료되면 플레이트를 광학 접착 필름으로 덮고 모든 면을 단단히 밀봉합니다. 써모사이클러에 넣기 전, 플레이트 버킷이 장착된 원심분리기에서 1000 ×g로 1분간 원심분리합니다. 마지막으로, 준비된 정량 PCR 프로그램을 활성화하여 실행합니다.

내독소 추출 과정에서, 필터 샘플을 원심분리기에서 회전시켜 필터로부터 내독소를 추출합니다. 원심분리 속도에 따라 추출 효율이 달라지며, 특히 내독소 농도가 높을 때 이러한 차이가 두드러집니다.

선택한 특정 필터와 수행한 프로토콜에 대해 추출 효율의 예비 테스트를 실시해야 합니다. 깨끗한 필터에 스파이킹했을 때의 추출 효율은 샘플링된 석영 필터보다 높게 나타나며, 이 두 효율 모두 표준 용액을 직접 검출했을 때보다 낮습니다. 숙달된 이후에는 적절하게 수행할 경우 엔도톡신 분석을 3시간 30분 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 마친 후, 대기 중 생물체의 이동과 관련된 추가적인 의문점을 해결하기 위해 DNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 공기 시료 필터에서 엔도톡신과 DNA를 효율적으로 추출하고 이를 정확하게 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.