Name: 마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 학습하세요 생균제 효모 Saccharomyces boulardii의 유전자 변형 및 마우스 위장 면역 조직에서의 부착 검증 방법을. 이 기술은 항생제 선택 없이 돌연변이 균주를 생성하여 경구 백신 및 위장 치료제 전달 연구에 활용됩니다.

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저자는 트레이시 J. 어린 양에게 수여 면역학 및 면역 주사와 NIH 새로운 혁신 상 (1DP2AI112242-01)에 대한 아동 센터를 통해 자금을 인정합니다. 저자는 또한 rad1 S.의 관대 한 기여 나탈리아 P. Degtyareva 감사합니다 cerevisiae의.

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저자는 공개 아무것도 없어.

함께, 프로토콜은 여기에 장에 이종 치료 단백질의 전달을위한 개발과 영양 요 바이오 틱 효모 균주의 시험에 필요한 필수 단계를 설명합니다. 이 조작 및 재조합 바이오 틱 효모의 테스트는 개별 실험실은 익숙하지 않을 수있는 기술과 자원을 필요로한다. 많은 선행 연구가 여러 효모와 마우스 균주에 대해 위의 프로토콜을 설명하고 있지만 따라서, 이러한 방법은 저자의 지식이 상세한, 통합 형태로 제공되지해야합니다. 또한, 본 원고는 덜 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주보다 특징 바이오 틱 효모의 유전자 조작에 대한 현재의 표준화 된 프로토콜을 적응에 특히 중점을두고 있습니다. 및 변환 (2 부) (1 부에서 설명) 모두 돌연변이 유발을위한 많은 단계는 이배체의 조작, 프로 바이오 틱 효모 ISOLAT에 최적화해야에스. 이 원고는 (은) 동물 처리 (파트 3) 소장의 파이어 판 면역 조직 (파트 4)의 해부와 관련된 잠재적 인 함정에 대해 설명합니다. 많은 산업 및 임상 적 효모 대...

프로 바이오 틱 미생물을 효​​율적이고 경제적으로 위장관에 이종 단백질을 전달하는 흥미로운 잠재적 인 수단이다. 이 생물은 아직 1 식민지화하지 않는 위장관 통과 생존 제어 투약이 가능하고 약물 표현에 노출을 제한 할 수있다. 또한, 쉽게 대규모 이종 단백질을 생산하는 이들 미생물을 설계하는 능력은 그들을 합성 전달 입자 경제적 인 대안을 렌더링한다. 최근 2 boulardii에 생균제 효모 사카의 영양 요 구성 균주를 사용하여 입증하지만, 이러한 접근법의 개발은, 효모 및 분자 생물학에서 동물 처리 기술 및 면역 학적 방법에 이르기까지 전통적으로 특정 연구에서 결합되지 실험 기법에 대한 지식을 필요로한다. 본원에 기재된 각각의 방법은 그 자체로 신규 아니다 따라서 비록실험 프로토콜이 원고의 목적은 쥐 위장관에 약물 전달 비히클로서 생균제 효모 실험 테스트에 필요한 기술을 통합 도입을 제공하는 것이다. 제공에 필수적인 프로토콜의 편집이다 : 쉽게 유 전적으로 조작 할 수있는 효모의 영양 요 구성 돌연변이 균주의 1) 생성; 효모 배양 2) 변환은 이종 단백질을 발현하는 단계; 구강 투여를 통해 장에 재조합 효모의 3) 관리; 자신의 이종 단백질 발현의 쥐 소장 및 평가에서 가능한 재조합 바이오 틱 효모의 4) 복구. 다수의 양성 및 음성 선택 방법 효모 종의 조작에 존재하지만 첫째, 이러한 영양 요 구성 마커를 사용함으로써 부정적 선택 효율 효모 형질 전환 및 선택 될 수있는 용이성을 모두 증가시킨다. 공동 항생제를 사용하여 형질 전환 체의 긍정적 인 선택,ntrast 크게 효모 조작의 비용을 증가시킨다. 또한, 항생제 함유 고체 배지에 효모의 선택은 밖으로 합성 드롭 고체 배지 (게시되지 않은 관찰)에 영양 요 효모의 선택에 대해 변형되지 않은 배경 식민지의 증가 성장을 할 수 있습니다. 영양 요 구성 효모가 필수 아미노산 또는 우라실의 합성에 중요한 효소가 결여 균주이다. 효모가 필수 대사 물질이 부족 미디어 밖으로 합성 드롭에 도금 할 때 따라서 음의 선택이 가능 누락 된 대사 또는 대사 유전자로 보충하면 효모는 증가 할 수 있습니다. 많은 일반적으로 사용되는 사카로 마이 세스 세레 비지에 실험실 균주는 이미 사실 영양 요 구성 돌연변이 3입니다. 공업, 임상, 바이오 틱 및 효모 그러나, 일반적으로 필요한 모든 영양소를 합성하는 능력 prototrophic이다. 효모를보다 효율적으로 유전자 조작을 사용하려면, 영양 요 구성 유전자를 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다항생제없이 선택 될 수있는 균주를 생성한다. 6 - 영양 요 구성 마커 유전자의 구체적인 타겟팅 CRISPR / Cas9 4 타겟으로 최근에 상동 재조합에 의존 PCR 매개 유전자 파괴를 통해 달성 될 수있다. 또한, UV 돌연변이 유발 빠르게도 7 기술적으로 어려운 여러 플라스미드와 함께하는 형질 전환 효모 균주의 영양 요 구성 돌연변이 체를 생성 할 수 있습니다. PCR 타겟팅 및 CRISPR / Cas9 광범위 다른 설명되었지만,이 원고 한 음성 선별보다는 효모 형질 전환 체의 양성 항생제 선택할 수 영양 요 구성 균주를 제작하는 UV 돌연변이 유발 접근법을 설명하는 상세한 프로토콜 부분에 제시 하였다. 이종 단백질의 경구 전달을 위해 같은 영양 요 구성 균주의 사용에 필요한 다음 단계는 플라스미드 DNA로 형질 전환 효모이다. 찬성의 첫 번째 성공적인 변환 이후1978 사카로 마이 세스 세레 비지에 (8)에 대해보고 된 spheroplasts t는 수많은 변형 효율을 증가 효모 종은 유 전적으로 변형 될 수있는 것을 특징으로 완화되었다. S.로 DNA의 성공적인 전환을위한 전기 사용 cerevisiae를 먼저 1985 9에서 설명하고, 이후지지 삼투 셀 (10)에 1 M 소르비톨 배양 첨가를 통해 개선되었다. 전기 효율은 또한 효모 종 및 균주, 세포 수와 성장 단계, 전기 체적, 전계 강도, 및 특정 버퍼 (11)에 의존하는 것으로 나타났다. 이 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에 원래 이토 외. (12)에 의해 기재된 리튬 아세테이트 (LiOAc) 변환은, 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜 사이에서 변환된다. 추가의 분석은 세포를 중간 로그 상에 수집되는 경우 LiOAc 효모 변환 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다열 성장은 42 ° C에서 12 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 DNA의 존재 하에서 충격된다. PEG와 전체 그대로 효모의 배양이 가능 세포막에 DNA의 첨부 파일을 개선을 통해뿐만 아니라 막 (13)에 다른 효과를 통해, 효율적인 변환을 위해 필수적이다. 리튬 자체도 손상 전지 (14)의 투과성을 증가시킨다. 대부분의 실험실 S. 있지만 세레 비지에 균주 쉽게 LiOAc 변형 3을 이용하여 변환 될 수 있고, 다른 효모 종은 더욱 효율적으로 다른 프로토콜을 사용하여 변환 될 수있다. 피 키아 파스 토리스, 예를 들면, 가장 효율적으로 변환 오히려 LiOAc 변환 (13)보다 전기를 통한 것이다. 이것은 중요하다, 따라서, 복수의 테스트 유 전적으로지지 않은 효모 균주를 수정을 시도 할 때와 변화의 방법은 배양 기간과 시약의 농도를 최적화 할 수 있습니다. 이 원고 따라서 LiOAc 그럴 모두 설명영양 요구 돌연변이와 야생 유형 S.의 변환을위한 기술로 ansformation 및 전기 boulardii에. 관심있는 독자는 효모 변형, 다른 프로토콜 및 행동 13, 15의 가능한 메커니즘의 추가 논의의 진화의 철저한 설명은 최근 리뷰에 관한 것이다. 플라스미드가 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 효모로 형질 전환은 적절한 발현 이종 단백질의 기능을 보장하기 위해 다운 스트림 테스트 또한 필수적이다. 무수한 다른 단백질 치료 연구의 궁극적 인 목적 및 면역, ELISA, 및 다른 기술에 의해 단백질이 검출 가능한 항체에 따라 선택 될 수있다. 이러한 기술에 대한 프로토콜은 완전히 다른 16,17 설명되었지만, 표준 곡선과 비교하여 형질 전환 효모에서 이종 단백질 생산의 수준을 결정하기 위해 사용될 수있다. 목적 데모 및 표시 할효모 생물학 매우 일반적으로 사용되는 단백질의 성공적인 제조 방법이 원고는 형광 현미경을 사용하여 연속적인 검출이 가능 플라스미드 인코딩 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형질 전환을 제공한다. 부품 셋, 넷에 설명 된대로 이종 단백질, 적절한 관리 및 위장관 조직 내에서 이러한 미생물의 검출 인 표현 바이오 틱 미생물의 생산에 똑같이 중요. 구강 투여를 통해 재조합 효모의 관리를 직접 C57BL / 6 마우스 자연스럽게 18 구토 능력이있는에서 위,에 효모의 제어 수량의 전달을 위해 수 있습니다. 그러나, 부적절한 동물 처리 및 위관은 식도 손상 및 천공, 위 천공, 기관 관리, 흡인 성 폐렴 (19, 20)로 이어질 수 있습니다. 빈약 한 기술과 경험 부족은 또한 쥐의 면역 반응 및 실험 resu의 변동성을 증가시킬 수있다구강 투여에 21,22 동물 응력에 기인 한 LTS. 적절한 기술의 연습 따라서뿐만 아니라 동물의 불편을 감쇠 할 수 있습니다뿐만 아니라, 실험 결과의 정밀도를 높일 수 있습니다. 이 원고는 설명하고 재조합 효모의 제어 용량의 관리를 위해 동물 처리 및 구강 투여를 보여줍니다. 마지막으로, 효모 및 이종 단백질의 존재를 림프 조직을 분석하여 재조합 효모의 성공적인 전달을 확인하는 것이 중요하다. 가장 용이하고 예측 효모의 존재를 검사 할 수 위장관 면역 조직 파이어 패치이다. 파이어 패치는 점막 면역 반응의 유도 (23)의 키 사이트입니다 소장을 따라 차 림프 기관입니다. 내강에서 항원 microfold 통해 transcellularly 상피 (M) 세포를 전달하고 묶 노출 시킴 따라서 파이어 패치로 출시제시 세포 D 항원 내강 내용 장내한다. 장 상피를 가로 지르는 입자 흡수도 술잔 세포에 의해 달성 될 수 있지만, 이러한 셀은 차지 입자 직경이 24 미만 0.02 ㎛ 인 것으로 나타났다. Transepithelial 수상 돌기는 CD103 + 수지상 세포 (DC)도 25 루멘 장에서 작은 입자를 차지 연장; 그러나, CD103 + DC가 세균보다 큰 입자를 가지고 있음을 보여주는보고는 현재 존재하지 않는다. 따라서, 그대로 생균제 효모 직경 3-6 μm의 평균 크기 사이의, M 세포에 의해 용해 및 파이어 패치로 전송 될 가능성이 가장 높은. 여기에 설명 된 절차가 쉽게 바이오 틱 균의 흡수를 평가하기 위해 적응 될 수 있지만, 수집 및 생존 재조합 효모 파이어 패치 선별 프로토콜이다. 요약하면, 배달 재조합 효모 생균제 평가소장에 rapeutic 단백질은 동물의 취급 및 면역학에 분자 생물학에 걸친 실험 기술의 능력을 필요로한다. 1 여기를 제시 프로토콜) 쉽게 부정적인 항생제없이 선택할 수있는 세대 및 영양 요 효모 균주의 선별, 2) 다른 프로토콜은 효모를 변환 및 이종 단백질의 발현을 활성화, 3) 적절한 동물 처리 기술과 경구 위관의 시위 재조합 효모의 위장 납품 및 파이어 판 절제술 4) 프로토콜과 가능한 재조합 효모 및 기능 이종 단백질을 스크리닝. 결합하여, 이러한 프로토콜은 생성 및 위장관에 이종 단백질 치료제를 제공 할 수있는 생균제 효모의 테스트를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 분광광도계</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>세포 농도 및 효모 배양의 O<D>sub600 측정을 위한 분광 광도계의 예</td></tr><tr><td>New Brunswick 롤러 드럼</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>효모 배양 배양용 롤러 드럼의 예</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400 Stratagene</td><td></td><td>400075-03</td><td>Stratalinker 예</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plate 스탠드는 펜에서 압력을 감지하면 콜로니 카운트를 기록합니다</td></tr>. <tr><td>Scienceware Colony Counter&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>핸드 헬드 콜로니 카운터 펜</td></tr><tr><td>복제 도금 장치</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>복제 도금 스탠드 및 패드의 예&nbsp;</td></tr><tr><td>Velveteen</td><td>사각형 Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L 모양의 멸균 세포 스프레더&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid, 연어 고환에서 단일 가닥</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>효모 LiOAc 변환을 위한 운반체 DNA</td></tr><tr><td>예시 Gavage 바늘</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>15-20g 마우스의 경우 제안된 바늘은 22게이지(1.25mm 볼), 1인치 길이의 직선 재사용 가능한 개바지 바늘입니다. 체중이 20&nbsp 이상인 마우스의 경우; g, 20 게이지 이상의 직선 또는 곡선 간주 바늘을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>1 ml 멸균 슬립 팁 일회용 투베르쿨린 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) 톱니 모양의 팁, 넓은 그립 집게 Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>해부에 필요한 둔기 집게의 예;</td></tr><tr><td>직선 및 곡선 해부 가위</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72966-02 및 72966-03</td><td>IMDM</td></tr><tr><td></td><td>Life 기술</td><td>12440053</td><td></td></tr> 해부에 필요한 가위의 예</tbody></table>

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

재조합 경구 요법의 개발은 점막 면역 체계를 보다 직접적으로 표적으로 삼고 위장 장애와 싸우는 능력을 향상시킬 것입니다. 특히 이 접근법에 프로바이오틱 효모를 적용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 이러한 균주는 다양한 복합 이종 단백질을 합성할 수 있는 잠재력을 가지고 있을 뿐만 아니라 장을 통과하는 동안 이러한 단백질이 생존하고 보호할 수 있습니다. 그러나 결정적으로 이 접근 방식은 일반적으로 함께 사용되지 않는 다양한 실험실 기술에 대한 전문 지식을 필요로 합니다. 또한, 효모 형질전환에 대한 개별 프로토콜은 일반적으로 사용되는 실험실 균주에 대해 잘 특성화되어 있지만, 여기서는 대체 접근법과 잘 특성화되지 않은 프로바이오틱스 균주에 대한 형질전환을 최적화하는 것의 중요성에 중점을 둡니다. 이러한 방법을 자세히 설명하면 경구용 약물 전달 매개체로서 프로바이오틱스 효모를 테스트하기 위한 최상의 접근 방식에 대한 논의를 촉진하는 데 도움이 될 것이며 실제로 위장 요법을 위한 이 새로운 전략의 개발을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

UV 조사 다음 생존 곡선의 생성은 별개 집락 형성 단위 (CFU)를 형성 할 수 있도록 희석하여 효모 세포의 도금을 필요로한다. 상기와 같이 수집 된 각 500 μL 샘플을 약 5 × 106 세포를 포함 그러나, 접시 당 100보다 큰 식민지를 정확하게 구별하기가 어렵다. 희석되지 않은 샘플과 조사 셀 직렬 1시 10분 희석 따라서도 1에서 설명한 바와 같이 CFU는 각각 UV 조사량에 열거 될 수 있도록 보장 도금. CFU 카운트, 희석 배수를 곱한 다음의 총 개수로 나눈 각 투여 량 %의 생존을 결정하기 위해 각각 500 ㎕의 시료에 조사하여 원래 셀.도 2는 이배체 야생형 S.의 계산 된 백분율을 나타낸다 boulardii에 세포 0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 22,500 μJ, 25,000 살아...

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

이 절차들의 전반적인 목표는 마우스의 위장관에 이종 단백질을 발현시키고 전달할 수 있도록 쉽게 형질전환이 가능한 프로바이오틱 효모 균주를 개발하는 것입니다. 이러한 기술의 주요 장점은 프로바이오틱 효모의 옥시트로픽(oxytrophic) 균주를 신속하게 생성할 수 있다는 점입니다. 이렇게 생성된 돌연변이 효모는 항생제 선택에 의존하지 않고도 유전적 조작이 가능합니다.마우스의 경구 투여와 파이엘판(Peyer's patches) 수확을 통해 변이 효모가 위장관 면역 조직에 부착되는지 확인할 수 있습니다. 이러한 방법은 경구 백신 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 되며, 위장관 치료제 전달을 위한 프로바이오틱스 테스트 실험을 용이하게 합니다. YPD 배지를 준비하고 효모를 포화 상태까지 하룻밤 동안 배양한 후, 플라스틱 큐벳에서 세포를 물로 1:10 비율로 희석하십시오.그 다음, 분광광도계를 블랭크 처리하고 오버나이트 배양액의 흡광도를 측정합니다. 멸균 증류수 20 milliliters를 사용하여 세포 농도를 10⁷ cells/milliliter로 희석합니다. 희석된 세포를 멸균 플라스틱 페트리 접시에 붓고, 뚜껑을 연 상태로 플레이트를 UV crosslinker에 넣습니다.다음으로, 세포 용액에 UV 조사를 누적 증분 용량으로 노출시키고, 각 증분 단계 후에 500 µL의 분주액을 추출하여 사멸 곡선을 작성함으로써 스크리닝을 위한 최적의 생존율을 확인합니다. 멸균수를 사용하여 세포를 1에서 10배까지 단계적으로 희석합니다. 그런 다음, 각 희석액의 세포를 최대 속도로 1분간 원심분리하여 펠렛화합니다.상층액을 흡입하여 제거하고, 효모 세포 도말에 적합한 멸균수 100 microliter 부피에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 재현탁된 세포 전량을 YPD 고체 배지가 포함된 플레이트에 피펫으로 옮기고, 멸균 스프레더를 사용하여 각 플레이트에 세포를 고르게 분산시킵니다. 생존 곡선을 작성하고, 텍스트 프로토콜에 따라 스크리닝에 사용할 UV 조사 선량을 결정합니다.스크리닝을 위해 선택한 UV 조사량에 효모를 노출시킨 후, 조사된 세포의 전체 부피를 펠렛화하고 100 µL의 멸균수를 사용하여 펠렛을 재부유합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 5-FOA가 포함된 최소 배지에 도말하여 3개의 minus oxytrophic newtons를 선택합니다. 5-FOA 플레이트 상의 단일 콜로니 일부를 멸균된 이쑤시개 끝으로 채취하여 YP

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 결장 염증이 있는 인터루킨-10 결핍 마우스의 대변 미생물군 이식 절차를 보여줍니다. 장내 집락화된 대변 미생물은 2차 대사 산물을 방출하여 항염증성 사이토카인 방출을 유도하고 대장 염증을 감소시킵니다.

인터루킨-10 결핍 마우스에서 분변 미생물군 이식의 효과 평가

이 비디오는 형질전환된 효모 세포를 마우스 모델로 경구 투여하는 방법을 보여줍니다. 형질전환된 효모 세포는 위(gavage) 기법을 사용하여 경구 투여되어 마우스의 위장에 도달합니다. 그 후, 세포는 소장으로 이동하고, 여기서 마이크로폴드 세포가 세포를 집어삼키고 Peyer's patch로의 전달을 용이하게 하고 장 면역 체계에 접근할 수 있습니다.

형질전환된 효모 세포를 마우스 장 면역 체계로 경구 전달

여기 우리가 제공 자세한 프로토콜 항생제의 구강 관리에 대 한 쥐, 배설물 샘플, DNA 추출 및 배설물 박테리아의 정량화를 정량 하 여.

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안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델

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유전 적 감수성, 점막 면역 및 장내 미세 생태 학적 환경의 상호 작용은 염증성 장 질환 (IBD)의 발병 기전에 관여합니다. 이 연구에서는 IL-10 결핍 마우스에 분변 미생물 이식을 적용하고 결장 염증 및 심장 기능에 미치는 영향을 조사했습니다.

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박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(파지)는 장내 마이크로바이옴의 필수 구성 요소입니다. 이러한 공생 생물이 박테리아 적합성과 개체군 역학을 주도하지만 장내 항상성과 질병에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델 내에서 분리된 T4 파지를 연구하며, 다른 파지-박테리아 쌍에 적응할 수 있습니다.

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

이 프로토콜은 무균 마우스를 실험용 단일 케이지 아이솔레이터(isocage)로 옮기고 수용하는 동시에 멸균 상태를 유지하기 위한 모범 사례를 설명합니다. 무균 마우스에 대변 이식 방법과 추가 적용을 위해 이러한 장내 "인간화된" 마우스에서 생존 가능한 박테리아를 수집하는 방법에 대해 논의합니다.

무균 마우스에 인간 배설물 이식을 위한 Bioexclusion IsoPositive 케이지 실험의 준비 및 유지 관리

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