Name: 살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 살아있는 제브라피시 배아에서 미토콘드리아와 센트로솜 같은 세포 이하 소기관을 이미징하는 비침습적 방법을. 이 기술은 생리학적 조건과 알츠하이머병 같은 질병 모델에서 소기관 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P.E.는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 및 Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS)의 지원을 받습니다. G.P.는 TUM-GS의 지원을 받았습니다. L.T.는 EMBO 펠로우십(EMBO ALTF 108-2013)의 지원을 받습니다. 제브라피쉬에 대한 D.P.의 연구는 Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration"(SFB 596)을 통해 DFG의 지원을 받았습니다. 통합 단백질 과학 센터(뮌헨) 및 유럽 공동체의 7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013)은 보조금 계약 번호 200611(MEMOSAD)에 따릅니다. 그는 현재 New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow이며 독일 과학 아카데미 Leopoldina의 펠로우십의 지원을 받았습니다. L.G.는 SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11을 통해 DFG의 자금 지원을 받습니다. 
우리의 어류 시설을 유지해 준 Kristina Wullimann, 기술 지원을 해준 Yvonne Hufnagel, 원고에 대한 의견을 제시해 준 Thomas Misgeld에게 감사드립니다. Centrin-YFP를 복제한 M1 Medusa 벡터(pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP)를 제공해 준 R. Köster(Technische Universität Braunschweig)와 CentrinFish를 만들기 위한 리포터 구조를 생성하는 데 사용한 14xUAS:MA-cerulean 카세트를 제공한 S.C. Suzuki와 T. Yoshimatsu(University of Washington)에게 감사드립니다. 또한 Otx2:Gal4 형질전환 라인에 대해 S.C. Suzuki와 T. Yoshimatsu(워싱턴 대학교), Sensory:Gal4-VP16 구조체(UCLA)에 대해 A. Sagasti, pCold Heart Tol2 벡터에 대해 M. Nonet(세인트루이스 워싱턴 대학교)에 감사드립니다. MitoFish의 개발에 기여한 Bettina Schmid, Alexander Hruscha 및 Christian Haass (독일 뮌헨 신경퇴행성 질환 센터 - DZNE)에게 감사드립니다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기, 우리는 찬란 태그 미토콘드리아, 중심체와 제브라 피쉬 배아에서 생체 내에서 특정 세포 유형의 세포막에 GAL4-UAS 발현 시스템의 다양성을 보여줍니다. 다른 세포 내 소기관 또는 구조 라벨 많은 형광 융합 단백질은 공개 된 문헌에서 발견 될 수 있고, 각각의 실험실 상업적 소스 또는 비상업적 플라스미드 기탁 (예 Addgene)로부터 얻을 수있다. 새로운 형광 융합 단백질을 디자인하는 몇몇 파라미터 FP 사용되는 관심있는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 FP 융합 여부를 포함하여 고려 될 필요가있다. 형광 융합 단백질을 생성에 대한보다 철저한 설명은 독자가 주제 49-51에 대한 심층적 인 기사라고합니다. 우리는 UAS 기반의 유전자를 사용하여 융합 단백질의 공동 발현을 달성하기위한 세 가지 전략을 강조 표시합니다. 여러 해부E UAS 리포터 작 제물은 다른 기존 리포터 조합 있도록 추가적인 클로닝 필요없이 구...

생체 내 이미징에서 가장 생리 학적 맥락에서 세포 행동의 직접 시각화를 제공합니다. 제브라 피쉬 배아, 자신의 신속하고 외부 개발 및 형광 라벨을 허용 유전 도구의 풍부한 배열의 투명성은 모든 주요 발달 이벤트의 역학을 규명하기 위해 생체 현미경의 사용 증가에 기여했다. 제브라 피쉬의 신경 시스템 개발의 이미징 연구는 예를 들어 크게 신경 전구 세포의 행동과 그 이후의 이동, 분화 및 회로 통합 1-8 포함한 자손의 운명에 대한 우리의 지식을 확장합니다. 스테이지는 이제 이러한 셀룰러 동작을 기초 세포 내 역학 조사를하도록 설정된다. 사실, 제브라 피쉬는 이미 생체 내 세포 생물학위한 도구로 악용되고있다. 골지 (15), 미토콘드리아 9-11을 시각화 할 수있게되었습니다 2,8,12-14 중심체, 미세 소관 (4)과 액틴 세포 골격 (16)은 17 엔도 좀과 생체 내에서 제브라 피쉬 배아에서 다른 세포 내 구조 중, 1,18 혀끝 멤브레인의 구성 요소가 복잡한. 지금까지 이러한 세포 소기관의 기능에 대해 알려진 내용의 대부분은 배양 된 세포에 자신의 행동을 연구에서 비롯됩니다. 시험 관내 연구는 세포 생물학에 엄청난 통찰력을 산출하고 있지만, 문화의 세포는 완전히 생체 내 상황의 복잡성을 대변하지 않습니다 때문에 반드시 기능과 생체 내에서 세포 내 소기관의 역 동성을 반영하지 않습니다. 제브라 피쉬 배아는 세포 내 역학 조사에 생체 대안의 생존을 제공합니다. 척추 동물로서, 제브라 피쉬는 포유류에서 발견되는 상동 많은 기관계 (예, 신경 망막)을 갖는다. 또한, 피쉬 배아 점점 인간 질환 (19, 20)을 모델링하는데 사용되는 </s위로&gt;, centrosomal 기능 (예를 들어, 소두증 (21)과 Leber 씨의 선천성 흑암 22)와에 미토콘드리아 기능 (예, 파킨슨 병 23, 10, 24 및 바르트 증후군 25 퇴행성 신경)과 관련이있는 책임을 포함. 세포와 세포 내 수준에서 생체 내 이미징 이러한 경우 이러한 병리 적 상태의 기초가되는 세포 생물학의 더 나은 이해를 허용 할 것이다. 여기에 설명 된 방법의 전체 목표는 생체 광학 현미경에 사용 제브라 피쉬 배아 세포 내 소기관 및 기타 구조를 조사하기 위해 포괄적 인 가이드를 제공하는 것이다. 생체 내에서 세포 내 구조를 시각화 및 추적에 관련된 전체 작업 흐름을 설명한다 - 유전자 표지 접근 방식에서 일시적으로 발생 표현하고 안정적인 형질 전환 어류, 그리고 마지막으로 넓은 필드와 공 초점 현미경을 사용하여 영상화하기에. 이러한 시저의 각 동안edures이 많은 제브라 피쉬 실험실에서 사용되는 설명 프로토콜 최적화 및 세포 내 구조의 역학을 조사하기위한 간소화된다. 여기에 설명 된 일의 두 가지 특정 양태 언급 보증 먼저, 특정 세포 타입에서 유전자 라벨 소기관 여러 구성에서 GAL4-UAS 발현 시스템의 용도. 둘째, 생체 내에서 이미지 세포 내 구조에 넓은 필드와 공 초점 현미경의 직접적인 비교. 제브라 피쉬의 유전 라벨 세포 기관 및 기타 세포 내 구조에 대한 현재 전략 중 하나를 만들 프로모터 요소를 직접 융합 단백질 9,14,15. 시험 관내 전사 출장 RNA 결과의 발현을 유도 출장 mRNA의 -1,4,8- 또는 DNA 기반 구조의 사용 신속하고 폭 넓은 표현, 즉 그러나 조직 특이하지 않다. 캡핑 RNA 희석 또는 열화로 또한 발현 수준은 시간이 지남에 따라 감소. RNA의 따라서 사용을 기반으로(포스트 수정을 일반적으로 최대 3 일) 개발의 나중 단계에서 세포 기관의 역학 제한을 검토 구성한다. 이러한 제한은 표현의 공간 및 시간 제어가 특이 적 프로모터 요소에 의해 결정되는 DNA 작 제물을 사용하여 극복 될 수있다. DNA 기반 구조는 유전자 발현 수준에 GAL4-UAS 시스템에 상당한 개선의 맥락에서 사용되는 경우 (26, 27)을 관찰한다. 리포터 유전자는 GAL4 결합 상류 활성화 서열 (UAS)의 하류에 클로닝하는 동안이 분형 발현 시스템에서, 세포 유형 특이 적 프로모터 요소는 GAL4 전사 활성의 발현을 구동한다. 적절한 GAL4 드라이버와 UAS 리포터 조합하여, 발현은 다른 프로모터 뒤에 특이 적 발현 패턴이 요구 될 때마다 리포터 유전자를 복제 할 필요를 회피, 특정 세포 유형에 한정된다. 또한, 다수의 UAS 리포터 유전자의 발현 할 수있다하나의 GAL4 활성화에 의해 구동. GAL4-UAS 시스템은 따라서 세포 내 라벨에 대한 다양하고 유연한 유전 적 접근 방식을 제공합니다. 넓은 필드와 공 초점 현미경은 대부분 실험실의 일꾼입니다. 와이드 필드 시스템은 일반적으로 광원으로서 아크 램프를 사용하여 광 통로의 단부에 배치 된 카메라로 민감한 발광을 검출한다. 아웃 오브 포커스 빛이 두꺼운 샘플에 초점 정보를 가린다로이 영상 양상은 일반적으로 얇은 샘플로 제한됩니다. 공 초점 현미경은 초점 (즉, &quot;광학 절편&quot;) (28)에서 발생한 것들 위에 초점면에서 발생한 신호를 선호하는 내장되어 있다는 점에서 넓은 필드 시스템 다르다. 광학 절편을 달성하기 위해 핀홀은 점 광원에 대​​한 공액 위치에 배출 경로에 배치된다. 레이저가 광원으로 사용되며, 신호는 광전자 증 배관 튜브 (PMT가)로 검출된다. 실제로, 레이저빔을 시료 위에 포인트 별 각 스폿 (화소)에서의 형광 방출 PMT를 검출되어 와이프된다. 여기 이미지 모두 현미경 양식의 직접적인 비교를 제공하는 넓은 필드와 공 초점 현미경을 모두 사용하여 제브라 피쉬 배아 생활에 매우 동일한 세포 내 구조. 이러한 비교를 제공하는 기본 목적은 손의 특정 질문에 가장 적합한 현미경 기술 선택을위한 가이드 라인을 제공하는 것입니다. 우리는 미토콘드리아와 중심체의 GAL4-UAS 기반 유전 라벨을 보여 여기에 설명 된 방법을 사용. 이러한 소기관 각 영상 기법의 적합성을 입증 넓은 필드와 공 촛점 현미경을 사용하여 신경계와 근육 세포가 다른 세포 유형에 이미징된다. 여기에 설명 된 방법을 용이하게 살아있는 배아 제브라 다른 세포 내 소기관 및 구조를 조사하도록 구성 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>아가로스 (2-하이드록시에틸라가로스)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>저겔화 온도 VII</td></tr><tr><td>타입 블록 히터</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compact</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 칼슘 나이트레이트 수화물, 99.996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>30x Danieau의</td></tr><tr><td>CCD 카메라를</td> 준비하기 위해 <td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>세라믹 코팅 Dumont #5 집게</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5 집게</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Culture 식기 히터</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>가열 링</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설페이트 염</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>트리카인(마취제)</td></tr><tr><td>형광 해부 현미경</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean 키트</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>35mm 페트리 접시, 14mm 마이크로웰, No. 0 커버 글라스</td></tr><tr><td>유리 바늘</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>마이크로주입용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>30배 Danieau의</td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Dow Corning을 준비하기 위해&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>실리콘 이산화물 그리스</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>30x Danieau의</td></tr> MgSO를 준비하기 위해<tr><td>4.7H2O &nbsp; &nbsp; 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 98+% A.C.S 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>30x Danieau의</td></tr><tr><td>마이크로인젝터를 준비하기 위해&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>Microloader 팁</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 홀더</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>PCS-Transposase 전사</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DNA/RNA 농도를 측정하기 위한</td>30x Danieau의<td>나노광도계</td><td></td><td></td>를 준비하기 위해</tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>수침콘 목표</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea 등급 I, 약 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (색소 침착 방지)</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>플라스틱 금형&nbsp;</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>미세 주입용</td></tr><tr><td>Plexiglas 덮개-구멍 포함</td><td>주문 제작</td><td></td><td>Plexiglas 덮개의 구멍은 물을 담그는 원뿔 대물</td></tr>렌즈 <tr><td>차 여과기(플라스틱)</td><td></td><td></td>의 직경보다 3mm 커야 합니다. 제<td>브라피쉬 알을 수집하려면</td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>이중 자동 온도 컨트롤러</td></tr><tr><td>이송 피펫</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>3.5mL 플라스틱 전송 피펫</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Water-dipping-cone objective</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>수침 콘 대물</td></tr>렌즈 <tr><td>광시야 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td> <td>76 mg PTU를 50 ml 증류수에 용해시키세요 실온에서 격렬하게 젓습니다&nbsp; -20 oC에서 1 ml 분취 표본에 보관 1x 작업 용액</td></tr><tr><td>트리카인 (20x 재고)</td><td></td><td></td><td>에서 사용 200 mg 트리카인을 48 ml 증류수에 용해 2 ml 1M 트리스 염기(pH9) 추가 pH 7로 조정&nbsp; -20 oC에서 1 ml 분량< 보관> 1x 작업 솔루션에서</td></tr><tr><td>사용 Danieau's Solution (30x 재고)</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&nbsp; 나클&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; HEPES 버퍼&nbsp; 증류수 최대 1 L&nbsp; 4 oC&nbsp; 0.3x 작업 솔루션에서 사용</td></tr></tbody></table>

살아있는 zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

생체 내 이미징은 자연스러운 맥락에서 세포 및 세포 내 구조의 동적 거동에 대한 전례 없는 액세스를 제공합니다. 포유류와 같은 고등 척추 동물에서 이러한 이미징 실험을 수행하려면 일반적으로 연구 중인 시스템에 대한 외과적 접근이 필요합니다. 배아 및 유충 제브라피쉬의 광학적 접근성은 이러한 침입 절차를 우회하고 온전한 유기체에서 이미징을 가능하게 합니다. 실제로, 제브라피시는 이제 증식에서 이동 및 분화에 이르는 광범위한 발달 맥락에서 생체 내 현미경을 사용하여 동적 세포 행동을 시각화할 수 있는 잘 정립된 모델입니다. 보다 최근의 발전은 미토콘드리아 이동 및 중심솜 역학을 포함한 세포 내 이벤트를 연구하기 위해 제브라피시의 사용이 증가하고 있다는 것입니다. 이러한 세포 내 구조를 형광 단백질로 유전적으로 표지할 수 있는 상대적 용이성과 이를 이미지화하기 위한 광학 현미경 기술의 사용은 제브라피시를 세포 생물학의 생체 내 모델로 변형시키고 있습니다. 여기에서는 소기관을 형광으로 표지하는 유전자 구조를 생성하는 방법을 설명하며, 구체적인 예로 미토콘드리아와 중심체를 강조합니다. 당사는 여러 구성에서 bipartite Gal4-UAS 시스템을 사용하여 특정 세포 유형에 대한 발현을 제한하고 일시적으로 발현되고 안정적인 형질전환 어류를 생성하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 마지막으로, 세포 내 역학을 이미징하는 데 가장 적합한 광학 현미경 검사 방법을 선택하기 위한 지침을 제공합니다.

여기에 넓은 필드와 이미지 미토콘드리아와 제브라 피쉬 배아 생활의 중심체에 공 초점 현미경의 사용을 직접 비교하고 대조된다. 피검 소기관 동성이있는 셀들의 위치 및 특정 세포 내 사건의 고유 주파수에 따라 일반적으로 넓은 필드 또는 공 초점 현미경 하나가 더 좋은 선택이다. 우리는 배아의 표면 상에 위치 RB 뉴런 깊은 위치 망막 세포 소기관을 묘화. 자신의 두 차원 형상과 함께 RB 신경 세포의 표면 위치는 넓은 필드와 공 초점 현미경 (그림 2) 모두에 의해 촬영되고 그들에게 좋은 후보를합니다. 공 초점 현미경을 사용하여 획득 이미지는하지만 상당히 느리다 특정 세포 내 이벤트 (미토콘드리아의 예를 들면, 운동, 그림 2C, D의 역학의 과소 평가로 이어질 수 </strong&gt;). 조직에 대량의 형광 신호는 초점면에 상세히 가...

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

이 이미징 방법의 전반적인 목표는 척추동물의 생체 내(in vivo)에서 세포 소기관을 연구하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 환경에서의 미토콘드리아나 중심체 역학과 같이 신경 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 외과적 수술 절차 없이 온전한 척추동물 상태에서 전체 실험을 수행할 수 있다는 점입니다.이 방법은 생리적 조건 하에서의 세포 내 역동성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 알츠하이머병과 같은 질병 모델 연구에도 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미세주입을 통해 일시적으로 발현되는 배아를 생성하거나 안정적 형질전환 라인으로부터 배아를 확보한 후, 1일 차 종료 시점에 사멸했거나 수정되지 않은 알을 선별하십시오. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 생존 가능한 배아를 색소 형성을 방지하기 위해 1x PTU가 포함된 Danieau 용액으로 옮기고, 형질전환 유전자 발현을 선별할 때까지 배아를 1x PTU가 포함된 Danieau 용액에서 유지하십시오.이미징 실험 당일, 형광 해부 현미경을 사용하여 마취된 배아의 트랜스진 발현 여부를 스크리닝합니다. 그 다음, 선택된 배아를 1x PTU와 1x tricaine이 포함된 Danieau's buffer가 담긴 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 배아가 마취되면, 1x PTU와 1x tricaine이 포함된 저융점 아가로스에 배아 몇 마리를 조심스럽게 피펫으로 옮기되, 아가로스가 희석되는 것을 방지하기 위해 액체 전이량을 최소화합니다.소량의 아가로스와 함께 배아를 바닥이 유리로 된 페트리 접시에 옮깁니다. 그다음, 비교적 빠르게 핀셋을 사용하여 이미징하려는 구조에 따라 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 예를 들어, 망막이나 Rohon-Beard 뉴런을 이미징하려면 배아를 측면으로 평평하게 배치하는 등 적절하게 방향을 설정해야 합니다.정확한 방향 설정은 최상의 이미징 품질을 보장하고 획득 속도를 최적화합니다. 아가로스가 최소 15분 동안 응고되도록 기다린 후, 1x PTU와 1x tricaine이 포함된 Danieau's buffer를 첨가하여 배아를 덮습니다. 광시야 현미경 관찰을 수행하려면, 마운팅된 물고기가 담긴 디쉬를 28.5 °C의 가열 챔버와 광시야 현미경 스테이지 위에서 평형 상태가 되도록 둔 다음, 관심 영역을 선택하고 현미경 소프트웨어를 실행하십시오.Illumination 항목에서 Configuration settings를 클릭하여 관심 파장에 맞는 올바른 필터 세트를 정의하십시오. Camera settings 항목에서 적절한 이미지를 얻는 데 필요한 노출 시간을 입력하십시오. 그다지 40x에서 100x 배율 범위 내에서 수치 구경이 가장 높고 색수차가 보정된 장작동거리 수침 콘 대물렌즈(long working distance water dipping cone objective)를 선택하십시오.Live를 클릭하여 시야를 선택합니다. R-B 뉴런의 경우, 세포체에서 뻗어 나오는 축삭 기부 또는 말단 수지상 돌기에서 미토콘드리아 수송을 촬영합니다. 그런 다음, ImageJ 메뉴에서 직사각형 선택 버튼을 클릭하고 관심 영역(ROI)을 설정합니다.그리고 micromanager 창에서 ROI를 클릭하십시오. 이미징을 위한 ROI를 선택한 후, Stop and Save를 클릭하여 YFP 채널에서 뉴런의 형태를 기록하십시오. 미토콘드리아 수송을 이미징하려면 Multi-D Acquisition을 클릭하십시오.그다음, 다차원 획득(Multi-dimensional Acquisition) 창에서 타임포인트 수와 타임포인트 간 간격을 선택합니다. 다차원 획득 창에서 채널(Channels)을 클릭하고, 이미징을 위한 파장과 노출 시간을 추가 및 정의합니다. 이미지 저장(Save images)을 클릭하면 디렉토리 경로에 지정된 특정 폴더에 파일이 자동으로 저장됩니다.이제 우측 상단의 Acquire를 클릭하여 타임랩스 이미징을 시작합니다. 공초점 현미경의 경우, 마운팅된 배아를 공초점 스테이지 위 28.5 °C의 가열 챔버에 넣은 후, 현미경 소프트웨어를 열고 Trans Lamp 또는 Epi Lamp를 클릭합니다. 그 다음, 현미경의 접안렌즈를 통해 투과광 또는 형광광을 각각 사용하여 관심 영역을 확인합니다.Acquisition 설정 창에서 이미징을 위해 선택한 대물렌즈가 사용 가능한 대물렌즈 드롭다운 메뉴에 표시된 대물렌즈와 일치하는지 확인하십시오. 그런 다음, Image Acquisition Control 창에서 염료 목록 버튼을 클릭하고 적절한 형광체를 선택하십시오. 또는, Light Path and Dyes 버튼을 클릭하여 매개변수를 수동으로 설정하십시오.Acquisition Setting 창에서 스캔된 이미지의 줌 배율과 크기 종횡비를 조정하여, 이미징 대상 구조를 가장 잘 분해하는 데 필요한 픽셀 크기를 확보하십시오. 나이퀴스트(Nyquist) 샘플링 기준에 따라 픽셀 크기를 대물렌즈 이론 분해능의 약 절반으로 설정하십시오. 획득한 이미지의 픽셀 크기를 확인하려면 Image Acquisition Control 창에서 I 버튼을 클릭하십시오.다음으로, 스캔 속도를 가능한 가장 빠르게 설정하십시오. 그런 다음, 이미지 획득 제어(Image Acquisition Control) 창에서 Kalman 라인 평균화(Kalman line averaging)를 클릭하고, 노이즈를 줄이기 위해 계수를 2 또는 3으로 설정하십시오. 스펙트럼이 겹치는 형광체를 이미징하기 위해 순차 스캔 모드를 선택하려면, 순차 및 라인(Sequential and Line)을 클릭하십시오.그런 다음, 해당 레이저 라인의 출력 전력을 조정합니다. 각 채널의 검출기 설정을 조정하는 동안 선택한 영역을 연속적으로 스캔하려면 XY Repeat 또는 Focus x2 또는 Focus x4를 클릭하십시오. 그런 다음, 회색조 값의 다이내믹 레인지가 가장 높은 이미지를 얻을 수 있도록 각 채널의 HV, Gain 및 Offset을 조정합니다.이제 Control + H를 눌러 룩업 테이블(lookup table)을 통해 획득한 이미지를 시각화하십시오. 이때 불포화 픽셀은 파란색으로, 과포화 픽셀은 빨간색으로 표시되며, 두 경우 모두 피해야 합니다. 관련 레이저 라인의 출력과 검출기 설정을 다시 평가하십시오. 이미징할 볼륨의 상한 및 하한 범위를 정의하려면, Acquisition Setting에서 상한 지점에 위치시킨 후 End Set 버튼을 클릭하고, 하한 지점으로 초점을 맞춘 다음 Start Set을 누르십시오.대물렌즈의 Z 분해능을 확인하려면 Image Acquisition Control에서 I 기호를 클릭하십시오. 그런 다음 해당 대물렌즈의 Z 분해능의 절반에 해당하는 스텝 크기를 선택하십시오. TimeScan 하위 창에서 Z-stack을 획득할 빈도와 이미지 획득 횟수를 입력하여, 이미징하려는 세포 내 구조의 역동성에 적합한 시계열을 설정하십시오.Depth 및 Time 버튼을 클릭하여 Z-stack 및 시계열 이미지가 획득될 것인지 확인하십시오. 마지막으로 XY Zt 버튼을 클릭하여 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 이미지 획득 후 소프트웨어 인터페이스에서 Series Done을 클릭하십시오.그리고 이미지와 관련 메타데이터를 기록하기 위해 이미지를 OIB 형식으로 저장하십시오. 이 그림은 광시야 및 공초점 현미경을 사용하여 배아 표면에 위치한 세포 소기관과 R-B 뉴런을 보여줍니다. 여기서는 광시야 현미경의 타임랩스 이미징을 사용하여 R-B 뉴런의 주변 수지상 돌기 내 개별 미토콘드리아의 이동을 추적하였습니다.공초점 이미징은 속도가 현저히 느리며 특정 세포 내 소기관 이벤트의 역동성을 과소평가하게 만들 수 있습니다. 광시야 현미경으로 획득한 망막 세포 이미지는 넓은 조직 부피에서 발생하는 형광 신호가 초점 평면의 세부 사항을 가리기 때문에 대비가 낮다는 단점이 있습니다. 여기서 공초점 현미경의 광학적 단면화 기능은 대비를 눈에 띄게 개선합니다.삽입도는 세포막과 미토콘드리아의 라벨링이 포함된 내핵층 일부 영역의 세부 사항을 보여줍니다. 감각 뉴런의 특정 Gau-4 드라이버에 의해, UAS-mito-CFP 및 UAS MAY-FP 주입을 통한 모자이크 발현은 수정 후 2일 및 3일째의 이 R-B 감각 뉴런에서 볼 수 있듯이 며칠 동안 개별 세포를 추적할 수 있게 합니다. 미토콘드리아 외에도 중심체와 같은 다른 세포 소기관들을 형광 라벨링할 수 있습니다.본 예시에서는, 단일 연속 컨스트럭트 상의 두 UAS 카세트가 망막 세포에서 중심체 표적 YFP 및 막 표적 cerulean의 발현을 유도하였습니다. 삽입도는 M기 상태의 세포를 보여줍니다. 이 전체 과정은 교배, 난자 수집, 주입, 그리고 최종적으로 수정 후 3~4일째의 이미징까지 수일이 소요됩니다.현미경을 이용한 실제 이미징 실험은 수 분에서 최대 하루 전체가 소요될 수 있습니다. 이 절차에 따라 미세소관이나 퍼옥시좀과 같은 다른 세포소기관을 표지하고 이미징함으로써 이들의 생체 내 역동성을 이해할 수 있습니다. PTU는 발암성 물질이므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

imaging-subcellular-structures-in-the-living-zebrafish-embryo

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 살아있는 제브라피시 배아에서 미토콘드리아와 센트로솜 같은 세포 이하 소기관을 이미징하는 비침습적 방법을. 이 기술은 생리학적 조건과 알츠하이머병 같은 질병 모델에서 소기관 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

더 많은 동영상 탐색