살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

이 이미징 방법의 전반적인 목표는 in vivo에서 척추동물의 세포 내 소기관을 연구하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아의 역학 또는 생체 내 맥락의 중심체와 같은 신경 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 수술 절차 없이 온전한 척추동물에서 전체 실험을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 생리학적 조건에서 세포 내 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 알츠하이머병과 같은 논문 모델 연구에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미세 주입으로 일시적 발현 배아를 생성하거나 안정적인 형질전환 계통에서 배아를 얻은 후, 첫째 날이 끝날 때 죽거나 수정되지 않은 난자를 스크리닝합니다. 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 생존 가능한 배아를 1x PTU를 함유한 Danieau's solution으로 옮겨 색소 형성을 방지하고, 전이유전자 발현을 스크리닝할 때까지 1x PTU를 함유한 Danieau's solution에 배아를 유지합니다.

이미징 실험 당일에는 형광 해부 현미경을 사용하여 마취된 배아의 형질전환 유전자 발현을 스크리닝합니다. 그런 다음 선택한 배아를 1x PTU 및 1x 트리카인이 있는 Danieau's buffer가 들어 있는 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 배아가 마취되면 1x PTU와 1x 트리카인이 함유된 저융점 아가로스에 몇 개를 부드럽게 피펫으로 주입하고 아가로스가 희석되지 않도록 가능한 한 적은 액체를 옮깁니다.

소량의 아가로스가 함유된 배아를 유리 바닥의 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 비교적 빠르게 작업하면서 집게를 사용하여 이미지화할 구조에 따라 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 예를 들어, 배아는 망막이나 로혼-비어드(Rohon-Beard) 뉴런을 이미징하기 위해 옆면이 평평하게 배치되어야 합니다.

정확한 방향은 최상의 이미징 품질을 보장하고 획득 속도를 최적화합니다. 아가로스가 최소 15분 동안 응고되도록 기다린 후, 배아를 덮기 위해 1x PTU와 1x 트리카인이 있는 Danieau's buffer를 추가합니다. 광시야 현미경 검사를 수행하려면 섭씨 28.5도의 가열 챔버에서 장착된 물고기 접시를 평형을 이루고 광시야 현미경의 무대에서 관심 영역을 선택한 후 현미경 소프트웨어를 엽니다.

Illumination(조명)에서 Configuration settings(구성 설정)를 클릭하여 관심 파장에 대한 올바른 필터 세트를 정의합니다. Camera settings(카메라 설정)에서 적합한 이미지를 획득하는 데 필요한 노출 시간을 입력합니다. 그런 다음 40x에서 100x 배율에 이르는 긴 작동 거리 water dipping cone objective를 선택하며, 이는 개구수가 가장 높고 색채가 보정됩니다.

Live(라이브)를 클릭하여 시야를 선택합니다. R-B 뉴런의 경우, 세포체 또는 주변 아버에서 발산하는 줄기 축삭에서 미토콘드리아 수송을 이미지화합니다. 그런 다음 ImageJ 메뉴에서 직사각형 선택 버튼을 클릭하고 관심 영역 또는 ROI를 정의합니다.

그리고 마이크로매니저 창에서 ROI를 클릭합니다. 이미징을 위한 ROI를 선택한 후 Stop and Save를 클릭하여 YFP 채널에 뉴런 형태를 기록합니다. 미토콘드리아 수송을 이미지화하려면 Multi-D Acquisition을 클릭합니다.

그런 다음 Multi-dimensional Acquisition이라는 창에서 시간 지점의 수와 시간 지점 사이의 간격을 선택합니다. Multi-dimensional Acquisition 창에서 Channels를 클릭하고 이미징을 위한 파장과 노출 시간을 추가하고 정의합니다. 이미지 저장을 클릭하면 디렉토리 경로에 설명된 특정 폴더에 파일이 자동으로 저장됩니다.

이제 오른쪽 상단 모서리에 있는 Acquire를 클릭하여 타임랩스 이미징을 시작합니다. 컨포칼 현미경 검사의 경우, 장착된 배아를 컨포칼 스테이지에서 섭씨 28.5도의 가열실에 배치한 후 현미경 소프트웨어를 열고 Trans Lamp 또는 Epi Lamp를 클릭합니다. 그런 다음 현미경의 접안렌즈를 통해 투과광 또는 형광을 각각 사용하여 관심 영역을 식별합니다.

획득 설정 창에서 이미징을 위해 선택한 목표가 사용 가능한 목표의 드롭다운 메뉴에 나타나는 목표와 일치하는지 확인합니다. 그런 다음 Image Acquisition Control 창에서 염료 목록 버튼을 클릭하고 적절한 형광단을 선택합니다. 또는 Light Path and Dyes 버튼을 클릭하여 매개변수를 수동으로 설정합니다.

Acquisition Setting 창에서 스캔된 이미지의 확대/축소 비율과 크기 종횡비를 조정하여 이미지화되는 구조를 가장 잘 해결하는 데 필요한 픽셀 크기를 얻습니다. 픽셀 크기를 대물렌즈의 이론적 해상도의 약 절반으로 설정하여 Nyquist의 샘플링 기준을 따릅니다. 획득한 이미지의 픽셀 크기를 확인하려면 Image Acquisition Control 창에서 I 버튼을 클릭합니다.

그런 다음 스캔 속도를 가능한 가장 빠르게 설정합니다. 그런 다음 Image Acquisition Control 창에서 Kalman line averaging을 클릭하고 계수를 2 또는 3으로 설정하여 노이즈를 줄입니다. 스펙트럼이 겹치는 형광단을 이미징하기 위한 순차 스캐닝 모드를 선택하려면 Sequential 및 Line을 클릭합니다.

그런 다음 해당 레이저 라인의 전력 출력을 조정합니다. 각 채널의 검출기 설정을 조정하면서 선택한 영역을 계속 스캔하려면 XY 반복 또는 초점 x2 또는 초점 x4를 클릭합니다. 그런 다음 각 채널의 HV, 게인 및 오프셋을 조정하여 회색 값의 가장 높은 다이나믹 레인지를 가진 이미지를 획득합니다.

이제 Control과 H를 눌러 채도가 낮은 픽셀을 파란색으로, 과포화 픽셀을 빨간색으로 식별하는 룩업 테이블을 통해 획득한 이미지를 시각화하며, 둘 다 피해야 합니다. 관련 레이저 라인의 전력 출력과 검출기 설정을 재평가합니다. 이미징할 볼륨의 상한과 하한을 정의하려면 Acquisition Setting에서 상한에 있는 End Set 버튼을 클릭한 다음 하한선에 초점을 맞추고 Start Set을 누릅니다.

대물렌즈의 Z 해상도를 확인하려면 Image Acquisition Control에서 I 기호를 클릭합니다. 그런 다음 주어진 목표에 대한 Z 해상도의 절반인 단계 크기를 선택합니다. TimeScan 하위 창에서 Z-스택을 획득해야 하는 빈도와 이미지를 획득해야 하는 횟수를 입력하여 이미징할 하위 세포 구조의 역학에 적합한 시계열을 설정합니다.

Depth 및 Time 버튼을 클릭하여 Z 스택 및 시계열이 획득되는지 확인합니다. 마지막으로 XY Zt 버튼을 클릭하여 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 이미지 획득 후 소프트웨어 인터페이스에서 Series Done을 클릭합니다.

그리고 이미지를 OIB 형식으로 저장하여 이미지 및 관련 메타데이터를 기록합니다. 이 그림은 넓은 시야와 컨포칼 현미경을 사용하여 배아 표면에 위치한 소기관과 R-B 뉴런을 보여줍니다. 여기서, 광시야 현미경의 타임 랩스 이미징을 사용하여 R-B 뉴런의 주변 아버에 있는 개별 미토콘드리움의 움직임을 추적했습니다.

컨포칼 이미징은 속도가 현저히 느리고 특정 세포 내 이벤트의 역학을 과소평가할 수 있습니다. 광시야 현미경 검사로 획득한 망막 세포의 이미지는 많은 양의 조직에서 나오는 형광 신호가 초점면의 세부 사항을 가리기 때문에 대비가 좋지 않습니다. 여기서 컨포칼 현미경의 광학 절편 기능은 대비를 눈에 띄게 향상시킵니다.

삽입물은 내부 핵층 영역의 세부 사항을 보여주며, 세포막과 미토콘드리아의 라벨링이 있습니다. 감각 뉴런의 특정 Gau-4 동인에 의해 구동되는 UAS-mito-CFP 및 UAS MAY-FP 주입의 모자이크 발현은 수정 후 2-3일에 이 R-B 감각 뉴런에서 볼 수 있듯이 며칠 동안 개별 세포를 추적할 수 있습니다. 미토콘드리아 외에도 중심체(centrosomes)와 같은 다른 세포 내 소기관(subcellular organelle)은 형광 표지될 수 있습니다.

이 예에서는 단일 연속 구조체에 있는 두 개의 UAS 카세트가 망막 세포에서 중심체 표적 YFP 및 막 표적 세룰리안의 발현을 유도했습니다. 삽입은 M기의 셀을 보여줍니다. 이 전체 절차는 짝짓기, 난자 채취, 주사, 수정 후 3-4일 후에 최종적으로 영상 촬영까지 며칠이 소요됩니다.

현미경에 대한 실제 이미징 실험은 몇 분에서 하루 종일 걸릴 수 있습니다. 이 절차에 따라 미세소관 또는 과산화소체와 같은 다른 소기관을 라벨링하고 이미지화하여 생체 내 역학을 이해할 수 있습니다. PTU는 발암성이므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.