컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 다중 모드 영상 기법을 사용하여 골 재생 및 신생 혈관 형성 측면에서 두개골 골 이식편의 통합을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 골 형성-혈관 형성 결합과 같은 재생 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈관 구조에 대한 고해상도 3D 결정을 제공하며, 기관 전체에 대한 연구를 가능하게 한다는 점입니다. 이 절차는 7~8주 된 BALB/c 마우스를 안락사시킨 후, 본 연구실의 박사 과정생인 doron Vic이 시연할 예정입니다.

텍스트 프로토콜에 따라, 털 성장 방향의 반대 방향으로 헤어 클리퍼를 사용하여 두개골 부위를 면도합니다. 사체의 머리 부분에 70% isopropanol을 도포하여 소독합니다. 그런 다음 11번 메스를 사용하여 두피 피부를 절개하고, 치과용 드릴과 내경 4.5 millimeter 버(tine)를 사용하여 골막을 제거합니다.

원형의 두개골 조각을 분리합니다. 멸균 식염수가 들어 있는 100 millimeter 플라스틱 접시에 뼈 조각을 옮깁니다. 이때 곡선 핀셋을 사용하여 뼈 조각에 부착된 혈액과 연조직을 관찰합니다.

뼈 파편을 한 번에 하나씩 잡고 면봉을 사용하여 철저히 닦아냅니다. 이때 뇌 조직, 연조직 및 혈액을 모두 제거합니다. 미세 가위를 사용하여 이식편에 붙어 있는 뼈 조각들을 조심스럽게 잘라내어, 이식편이 완벽한 원형이 되도록 합니다.

각 이식편을 70% ethanol이 담긴 15 milliliter 튜브에 한 번 담그고, ethanol을 씻어내기 위해 PBS가 담긴 15 milliliter 튜브에 두 번 담급니다. 냉동 튜브에 넣은 동종이식편을 -80 °C 냉동고에서 최소 1주일 동안 냉동 보관합니다. osteocalcin 프로모터의 제어 하에 luciferase를 발현하는 수용자 형질전환 마우스를 사용하여 작업할 때, 동종이식편이 투명하게 보이는지 확인하십시오.

주입형 마취제를 사용하여 7~8주령의 암컷 생쥐를 마취하고 진정 상태를 확인합니다. 털 성장 방향의 반대 방향으로 털 깎이(hair clipper)를 사용하여 두개골 부위를 깎아냅니다. 제모제를 도포하여 남은 털을 제거하고, 2분 이내에 마른 거즈로 닦아냅니다.

그 후 식염수에 적신 거즈를 사용하여 해당 부위를 닦아냅니다. 5% chlorhexidine을 피하 주사하여 두피를 소독합니다. 식염수 200 µL에 희석한 carprofen 5 mg/kg을 주사합니다.

건조증을 예방하기 위해 안연고를 도포하고, 동물은 항상 가온 패드 위에 둡니다. 그런 다음 동물을 수술용 현미경 아래에 배치합니다. 이어서 미세 가위와 핀셋을 사용하여 두피 피부에 1cm 길이의 타원형 절개를 합니다.

골막을 잡고 미세 가위로 제거한 후, 치과용 드릴과 외경 5 mm의 정밀 드릴을 사용하여 경막 천공을 방지하기 위해 람다 봉합선(lambdoid suture)에서 전방으로 2 mm 떨어진 위치에 두개골 결손 부위를 만듭니다. 뼈의 4분의 3 깊이까지 드릴링한 후, 스파출라를 사용하여 뼈 조각을 분리합니다. 프로토콜의 핵심 단계 중 하나는 결손 부위의 위치를 정확히 결정하는 것입니다.

labo 봉합 부위에 손상을 입히면 대량 출혈이 발생할 수 있습니다. 따라서 하부의 경도계와 상시상정맥이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 자가 이식물을 이식하기 위해서입니다.

10 mm 플라스틱 플레이트에 멸균 식염수 10 milliliters를 사용하여 골편을 세척합니다. 미리 해동한 동종이식물을 이식하고 시료를 상온으로 정규화하기 위해, 연조직을 제거하지 않고 혈전만을 제거합니다. 그 다음 곡선 핀셋으로 골편을 세척합니다.

골 이식재가 결손부 가장자리에 닿지 않도록 결손부에 배치합니다. 그런 다음 피브린 겔을 사용하여 이식재를 수용측 골에 접착합니다. 4-0 Vicryl 봉합사로 피부를 봉합하고 수술 절개 부위에 포비돈 요오드를 도포합니다.

마우스 귀에 표시를 하고, 마취 효과를 역전시키기 위해 kg당 0.25 mg의 anti sedan을 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 수술 후 관리를 수행하십시오.

2000 units의 sodium heparin을 정량하여 50 milliliter 튜브에 옮겨 헤파린 식염수를 준비합니다. 튜브에 20 milliliters의 멸균 식염수를 넣고 흔들어 섞습니다. 20 milliliter 루어락 시린지에 가온된 헤파린 식염수 15 milliliters를 가득 채운 후, 시린지를 23 gauge 스캘프 베인 세트에 연결합니다.

주사기를 주사기 펌프에 장착하고 펌프를 10 mL, 분당 1 mL로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기로 진정 상태를 확인하고 흡수성 표면 라이너가 감싸진 고정 보드 위에 마우스의 등을 대고 고정합니다.

다음으로, 복부에서 목까지 피부를 절개합니다. 복벽을 검상돌기까지 절개하십시오. 그런 다음 흉곽의 외측면을 따라 절개하여 심장이 완전히 노출되도록 하고, 심장과 폐가 손상되지 않도록 주의합니다.

지혈 겸자를 사용하여 흉골을 견인합니다. 나비 바늘을 좌심실에 3 mm 깊이로 삽입합니다. 그런 다음 3초 접착제를 사용하여 바늘을 심장과 흉벽에 고정합니다. 좌심실에 나비 바늘을 삽입하는 과정은 매우 정밀한 작업입니다.

우심실로 삽입하거나 좌심실 너무 깊숙이 삽입하는 것을 피하십시오. 그렇지 않으면 심장 후벽을 관통할 수 있습니다. 그 다음, 즉시 펌프를 작동시키십시오. 1분 후, 혈관 시스템의 압력을 낮추기 위해 하대정맥을 절개하십시오.

액체가 머리 반대 방향으로 흐르도록 보드를 기울입니다. 관류가 성공적으로 이루어지면 간과 혈관의 색이 맑아집니다. 이제 4% formaldehyde 10 milliliters를 관류합니다.

혈관 내로 기포가 침투하지 않도록 주의하십시오. 꼬리가 딱딱해지는 것으로 관류가 완료되었음이 확인되면, 10 milliliters의 헤파린 식염수를 사용하여 포름알데히드를 씻어내십시오. 제조사의 지침에 따라 방사선 불투과성 조영제를 준비하십시오.

플라스틱 튜브에 화합물 희석액과 경화제를 혼합한 후, 분당 1 mL의 속도로 조영제를 동물을 통해 관류시킵니다. 관류가 완료되면 관상 동맥, 장 동맥 및 간 동맥이 노란색으로 변해야 합니다. 버터플라이 바늘의 튜브를 절단하고, 용액이 두개골 부위로 누출되는 것을 방지하기 위해 사체를 종이로 감쌉니다.

다음 날 중합 반응이 일어날 수 있도록 동물을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 두개골 부위를 해부하려면 메스를 사용하여 관심 있는 두개 부위가 손상되지 않도록 최대한 외측으로 피부를 절개하십시오. 골 이식편의 위치를 확인한 후, 미세 가위를 사용하여 이식편에서 10 mm 떨어진 두개골을 절단하십시오.

micro CT 스캐너를 사용합니다. 시야(field of view)를 20.5 mm, X선 에너지를 55 kVp, 강도를 145 µA로 설정하고, 360도당 1,000회의 투영과 200 ms의 통합 시간을 설정합니다. 분리된 두개골 표본을 스캔합니다.

micro CT 소프트웨어로 생성된 2D 재구성 단면을 관찰하십시오. 관심 영역이 적절하게 스캔되었는지 확인한 후 두개골 결손 부위를 찾으십시오. 관류된 혈관이 쉽게 식별되는 경우, 이중 증류수에 희석한 6% trichloroacetic acid를 사용하십시오.

시료를 탈칼슘화하려면 앞서 설명한 것과 동일한 매개변수를 사용하여 시료를 다시 스캔하십시오. 재구성된 2D 슬라이스에서 람다봉합(lambdoid suture)의 위치를 찾습니다. 봉합선에 접하며 높이 2 mm, 직경 8 mm인 원통형 관심 영역(VOI)을 설정하십시오.

여기는 결손 부위의 해부학적 위치입니다. 다음으로 연조직에서 뼈를 분할합니다. 하한 임계값을 130으로 설정하고, 볼륨의 노이즈를 부분적으로 억제하기 위해 제한된 3D 가우시안 필터를 적용합니다.

3D 재구성을 생성합니다. IPL 소프트웨어와 DT 객체를 사용하여 VOI가 적절하게 위치했는지 확인합니다. Peram 기능을 사용하여 두께 맵을 생성합니다.

이 기능은 영상 촬영 및 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro CT)을 수행하는 각 혈관 직경별 혈관 부피를 설명합니다. 여기에 제시된 텍스트 프로토콜에 따르면, 수술 7일 후 CT 스캔 결과, 자가 이식(autograph)을 받은 생쥐는 이식 영역 전체에 영양을 공급하는 소형 및 중형 직경 혈관의 부피가 유의하게 더 높게 나타난 반면, 동종 이식(allograft)을 받은 생쥐는 혈관이 외부에서 침투하는 양상을 보였습니다. 또한, 형광 영상 촬영 결과 자가 이식 처리된 동물에서 혈류 관류가 유의하게 더 높게 나타났습니다.

14일째에 동종이식편의 혈관망은 이식편의 모든 인접 부위에 도달했습니다. 하지만 혈관 부피는 자가이식군에 비해 유의하게 낮았습니다. 이러한 차이는 직경 0.08에서 0.1 mm의 혈관을 비교했을 때 가장 두드러졌으며, 여기에서 볼 수 있듯이 수술 28일 후 혈관 부피는 수술 7일 후의 기저치 수준으로 돌아왔습니다.

자가이식 그룹은 하이드록시아파타이트 지향성 프로브를 이용한 형광 이미징 결과, 유의미하게 더 높은 골 무기질화가 나타났습니다. 이 그룹에서는 이식물 주변 전반에 걸쳐 뼈가 형성된 반면, 동종이식 그룹에서는 수술 56일 후 링 모양으로 표시된 결손부 가장자리에서만 뼈가 형성되었습니다. 동종이식을 받은 동물에 비해 자가이식을 받은 동물에서 골 부피가 유의미하게 더 높았고 이식물 두께가 유의미하게 더 두꺼웠습니다. 이 수술 기법을 숙달하면 약 25분 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차 이후에 다른 프로브를 이용한 형광 이미징을 수행하여 파골세포 활성 및 면역 반응의 관여와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 기저 혈관 신생 과정에서의 골 재생을 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.