컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 다중 모드 이미징 접근 방식을 사용하여 뼈 재생 및 신생혈관 형성 측면에서 두개골 이식편의 통합을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 골형성 혈관신생 커플링과 같은 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 혈관 3 개의 고화질 3D 결정을 제공하고, 절차를 입증하는 완전한 장기의 연구를 할 수 있다는 것입니다 doron Vic, 7-8 주 된 Bab sea mouse를 안락사 한 후 내 실험실의 박사 과정 학생

텍스트 프로토콜에 따라 이발기를 사용하여 모발이 자라는 방향에 대해 종골 부위를 면도합니다. 시체에 70% 이소프로판올을 바르고 소독하십시오. 그런 다음 숫자 11 메스를 사용하여 두피 피부를 자르고 치과 드릴과 4.5mm 내경 타인을 사용하여 골막을 제거합니다.

종골 뼈의 원형 조각을 분리합니다. 뼛조각을 멸균 식염수가 들어 있는 100mm 플라스틱 접시에 옮깁니다. 이 시점에서 구부러진 핀셋으로 뼈 조각에 붙어있는 혈액과 연조직을 관찰합니다.

한 번에 하나의 뼈 조각을 잡고 면봉 어플리케이터를 사용하여 철저히 닦습니다. 뇌 조직, 연조직 및 혈액을 제거합니다. 가는 가위를 사용하여 이식편에 붙어 있는 뼈 조각을 부드럽게 잘라내어 이식편이 완벽한 둥근 모양을 갖도록 합니다.

각 이식편을 70% 에탄올이 함유된 15밀리리터 튜브에 한 번, PBS가 포함된 15밀리리터 튜브에 두 번 담가 에탄올을 씻어냅니다. 동종이식편을 영하 80도의 냉동고에서 냉동 튜브에 넣어 냉동 후 최소 일주일 동안 동결합니다. 동종이식편이 투명하게 나타나도록 하고, 오스테오칼신 프로모터의 통제하에 루시페라아제를 발현하는 수용자 형질전환 마우스와 함께 작업합니다.

생후 7-8주 된 암컷 쥐를 주사용 마취제를 사용하여 마취하고 진정제를 확인한 후. 이발기를 사용하여 모발이 자라는 방향과 반대로 척골 부위를 면도합니다. 제모제를 사용하여 털 잔여물을 제거하고 마른 거즈를 사용하여 2분 이상 사용하지 마십시오.

그런 다음 식염수에 적신 거즈를 사용하여 해당 부위를 닦습니다. 클로르헥시딘 5%를 피하주사로 도포하여 두피를 소독합니다. 200마이크로리터의 식염수에 희석된 카프로펜 1kg당 5mg을 주입합니다.

건조를 방지하기 위해 안연고를 바르고 동물을 항상 열 패드에 보관하십시오. 그런 다음 작동 쌍안경 아래에 동물을 놓습니다. 그런 다음 가는 가위와 핀셋을 사용하여 핀셋으로 두피 피부를 1cm 길이의 타원형 컷으로 만듭니다.

골막을 잡고 가는 가위를 사용하여 치과 드릴과 5mm 외경으로 잘라내고, 경막의 침투를 피하기 위해 양봉선 봉합선 2mm 앞쪽의 종골 결손을 드릴로 다듬습니다. 뼈에 4분의 3을 뚫고 주걱을 사용하여 뼈 조각을 분리합니다. 프로토콜에서 중요한 단계 중 하나는 결함 위치를 종단하는 것입니다.

관절와순 봉합사에 대한 부상은 다량의 출혈로 이어질 것입니다. 따라서 기본 경도계와 상시계를 방해하지 않도록 주의해야 합니다. 자동 이식편을 이식합니다.

10mm 플라스틱 접시에 10ml의 멸균 식염수를 사용하여 뼈 조각을 씻습니다. 연조직을 제거하지 않고 혈전을 제거하여 동종이식 해동을 미리 이식하고 검체를 실온으로 정규화합니다. 그런 다음 구부러진 핀셋으로 뼈 조각을 씻습니다.

뼈 이식편을 결함 가장자리에 닿지 않도록 결함에 이식합니다. 그런 다음 피브린 젤을 사용하여 이식편을 숙주 뼈에 붙입니다. 4개의 오 Vicryl 봉합사로 피부를 봉합하고 수술 부위에 포비돈 요오드를 바릅니다.

마우스 귀를 표시하고 킬로그램 당 0.25 밀리그램을 주입합니다. 고기의 마취 효과를 역전시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 수술 후 관리를 수행하십시오.

헤파린나트륨 2000단위의 무게를 측정하고 50ml 튜브로 옮겨 헤파린 식염수를 준비합니다. 튜브에 멸균 식염수 20ml를 넣고 흔듭니다. 20ml 루어 잠금 주사기에 15ml의 따뜻한 헤파린 식염수를 채우고 주사기를 23게이지 두피 정맥 세트에 연결합니다.

주사기를 주사기 펌프에 부착하고 펌프를 분당 1밀리리터씩 10밀리리터로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후 발가락 꼬집기로 진정을 확인하고 마우스를 고정합니다. 흡수성 표면 라이너로 감싼 고정 보드로 등받

다음으로 복부에서 목까지의 피부를 자릅니다. 복벽을 xiphoid 과정까지 자릅니다. 그런 다음 흉곽의 측면을 따라 절단하여 심장이 완전히 노출되고 심장과 폐가 손상되지 않았는지 확인합니다.

지혈제를 사용하여 흉골을 수축시킵니다. 나비 바늘을 좌심실에 3mm 삽입합니다. 그런 다음 3초 접착제로 바늘을 심장과 흉벽에 붙입니다.나비 바늘을 좌심실에 삽입하는 것은 섬세한 절차입니다.

우심실에 삽입하거나 좌심실에 너무 깊숙이 삽입하는 것은 후방 심장 벽을 관통하므로 피하십시오. 그런 다음 즉시 펌프를 활성화하십시오. 잠시 후 혈관 구조를 낮추기 위해 하대정맥을 절개합니다.

액체가 머리에서 흘러나오도록 보드를 기울입니다. 성공적인 관류는 간과 혈관을 청소하는 결과를 가져옵니다. 이제 10 밀리리터의 4 % 포름 알데히드를 관류했습니다.

기포가 혈관 구조로 침투하는 것을 피합니다. 꼬리가 뻣뻣해지는 것으로 관류가 완료되면 10ml의 헤파린 식염수를 사용하여 포름알데히드를 씻어냅니다. 제조업체의 지침에 따라 무선 불투명 조영제를 준비합니다.

플라스틱 튜브에 복합 희석제와 경화제를 혼합하여 분당 1밀리리터의 속도로 조영제로 동물을 관류합니다. 관상 동맥, 장 동맥, 간 동맥은 관류가 완료되면 노랗게 변해야 합니다. 튜브를 나비 바늘로 자르고 용액이 종아리 영역으로 누출되는 것을 방지하기 위해 시체를 종이로 감쌉니다.

동물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 두어 다음 날 중합할 수 있도록 합니다. 종골 부위를 절개하려면 메스를 사용하여 관심 있는 두개골 부위가 손상되지 않도록 가능한 한 옆으로 피부를 자릅니다. 뼈 이식편을 찾은 다음 가는 가위를 사용하여 이식편에서 10mm 떨어진 두개골을 자릅니다.

마이크로 CT 스캐너를 사용합니다. 시야를 20.5mm, X-선 에너지, 55KVP 강도, 145마이크로암페어, 360도당 1,000개의 투영, 200밀리초의 통합 시간으로 설정합니다. 분리된 종골 뼈 샘플을 스캔합니다.

마이크로 CT 소프트웨어에 의해 생성된 2D 재구성 슬라이스를 관찰합니다. 관심 영역을 올바르게 스캔한 다음 calvarial 결함을 찾으십시오. 관류된 용기를 쉽게 식별할 수 있는 경우 이중 증류수에 희석된 6% 트리클로로아세트산을 사용하십시오.

샘플을 석회질화하려면 방금 설명한 것과 동일한 매개변수를 사용하여 샘플을 다시 스캔합니다. 재구성된 2D 슬라이스에서 lambdoid 봉합사를 찾습니다. 높이가 2mm이고 직경이 8mm이며 봉합사에 접하는 원통형 볼륨 또는 VOI를 정의합니다.

이것은 결함의 해부학적 부위입니다. 다음으로 연조직에서 뼈를 분할합니다. 하한 임계값을 130으로 설정하고 제한된 3D 가우스 필터를 적용하여 볼륨의 노이즈를 부분적으로 억제합니다.

3D 재구성을 생성합니다. IPL 소프트웨어와 DT 개체를 사용하여 VOI가 올바르게 배치되었는지 확인합니다. Peram 함수는 두께 맵을 생성합니다.

이 기능은 각 혈관 직경에 대한 혈관 부피를 설명하고 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, 여기에서 볼 수 있듯이 수술 후 7일 후, CT 스캔은 혈관이 외부에서 관통하는 것처럼 보이는 동종이식편을 받은 마우스와 달리 사인을 받은 마우스에서 전체 이식 부위에 영양을 공급하는 중소 직경의 혈관이 훨씬 더 많았음을 보여주었습니다. 또한, 형광 영상은 사인 치료를 받은 동물에서 유의하게 높은 혈액 관류를 보여주었습니다.

14일째가 되면 동종이식편의 혈관 나무가 모든 이식편 근접에 도달합니다. 그러나 선박 물동량은 Autographt 그룹에 비해 현저히 낮았습니다. 이러한 차이는 수술 후 28일 후에 혈관 구조량이 기준선으로 돌아온 경우와 같이 직경이 0.08 - 0.1mm인 혈관을 비교했을 때 가장 두드러졌으며, 혈관 구조 부피는 수술 후 7일 후에 기준선으로 돌아왔습니다.

자가이식 그룹은 하이드록시아파타이트 유도 프로브를 사용한 형광 이미징에서 볼 수 있듯이 훨씬 더 큰 뼈 광물화를 보여주었습니다. 이 그룹에서는 이식편 근접 부위 전체에 걸쳐 형성된 뼈가 동종이식편에서 형성된 반면, 동종이식편에서는 고리 모양으로 표시된 바와 같이 결손 가장자리에서만 형성되었으나 동종이식편에 비해 동종이식편에 비해 뼈 부피가 유의하게 높았고 이식편 두께가 유의하게 컸습니다. 이 수술 기법은 한 번 숙달되면 약 25분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 파골세포 활성 및 면역 반응 관여와 같은 추가 질문에 답하기 위해 다른 프로브를 사용하여 형광 이미징을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 기저 혈관 신생에서 뼈 재생을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.