Name: 조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 학습하세요 온도반응성 블록공중합체로 나노구조 표면을 제작하여 세포 부착과 분리를 제어하는 방법을. Langmuir-Schaefer 기법을 활용한 이 생체재료 연구는 조직공학 및 세포치료에 활용됩니다.

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본 연구는 일본 문부과학성(MEXT)의 '세포시트 조직공학센터(Cell Sheet Tissue Engineering Center, CSTEC)'의 혁신 시스템 개발 프로젝트인 '첨단 학제간 연구 프로그램을 위한 혁신 센터 조성(Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program)'의 재정 지원을 받았다.

폴리스티렌 - 블록 - 폴리 (N의 이소 프로필 아크릴 아미드) 2 단계 가역 추가-조각화 체인 전송 (RAFT) 라디칼 중합에 의해 1. 합성 <ol><li> 스티렌 (153.6 밀리몰)을 용해시키고, 4- 시아 노 -4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic 산 (ECT 0.2 mmol) 및 4,4&#39;- 아조 비스 (4- 시아 노 발레르 산) (ACVA 0.04 mmol)을 1 mL의 40에서 1,4- 디 옥산. 반응 종을 제거하고 실온에서 서서히 해동 15-20 분 동안 진공 하에서 액체 질소 용액을 동결. 이 솔루션은 완전히 해동되어 있는지 확인이 동결 펌프 - 해동 탈주기를 세 번 반복한다. </li><li> 오일 조에서 15 시간 동안 70 ° C에서 중합에 의해 매크로 RAFT 제로 : 폴리스티렌 (PST) (13,500 Mw)이옵니다. </li><li> 침전물 PSt와 매크로 RAFT 에테르 800 mL를 제하고, 진공에서 건조. </li><li> 1,4- 디 옥산 중 4 ㎖ 중의 IPAAm 단량체 (4.32 밀리몰) : PST 매크로 RAFT 에이전트 (0.022 mmol) 및 ACVA (0.004 밀리몰)을 녹인다. </li><li> 풀다동결 - 펌프 - 해동 사이클에 의해 탈기 용액 중의 산소는 단계 1.1에 나와있다. </li><li> 탈기 후, 오일 욕에서 15 시간 동안 70 ℃에서 중합 반응을 수행한다. 태평양 표준시 매크로 RAFT 에이전트와 동일한 방식으로 : 합성 세인트 IPAAm 분자 (32,800 Mw)이옵니다. </li></ol> 실란 소수성 수정 된 유리 기판 2. 준비 <ol><li> 5 분 동안 아세톤, 에탄올 및 초음파 처리 과량의 워시 유리 기판 (24mm X 50mm)의 표면 오염물을 제거한다. </li><li> 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 기판을 건조. 이어서 RT에서 기판의 표면을 활성화하기 위해 산소 플라즈마 (400 W, 3 분)를 사용한다. </li><li> 기판 silanization합니다 위해 RT에서 밤새 1 % 헥실 트리 메 톡시 실란을 함유하는 톨루엔 기판을 담가. </li><li> 톨루엔에 실란 화 기판을 세척하고 미 반응 에이전트를 제거하는 30 분 동안 아세톤에 몰입. </li><li> 110 ° C에서 2 시간 동안 어닐링 기판을 철저들 고정하기urface. </li><li> 세포 배양 접시 (: φ35 mm 접시 크기)에 맞게 25mm X 24mm에 유리 커터로 실란 화 된 기판을 잘라. </li></ol> 랭 뮤어 필름 및 필름 전송 표면 3. 준비 <ol><li> 먼지의 축적을 방지하기 위해 캐비​​넷 랭 뮤어 막 악기를 놓는다. </li><li> (: 580mm X 145mm 크기) 및 증류수와 오염 물질을 제거하기 위해 에탄올 장벽 랭 뮤어 통을 씻으십시오. </li><li> lintless 타월로 닦아 저점과 장벽을 건조시킵니다. 그런 다음 증류수 약 110 ml의에 저점을 작성하고 통의 양쪽에 장벽을 설정합니다. 증류수가 3.5-3.13 다음 단계에 유출하지 않고 추가해야합니다. </li><li> 플레이트는 적색으로 변할 때까지 가스 버너 표면 장력을 모니터링하고 오염물을 제거하기 위해 증류수로 세척 : 백금 빌헬 플레이트 (39.24 mm 경계)를 가열한다. 부착 와이어 빌헬 플레이트 일시표면 압력 측정 장비. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라, 표면 압력 측정기구를 제로. 인터페이스 중합체 물기없이 약 50 ㎠로 될 때까지 골의 양측에 장벽 홈통에 공기 - 물 계면을 압축한다. </li><li> 표면 압력까지 대기음 작은 오염 물질은 거의 0 MN / m이다. </li><li> 양쪽에 장애물의 위치를​​ 변경하고, 단계 3.6에서 증류수의 감소를 보상하기 위해 증류수를 추가합니다. </li><li> 클로로포름 현상 용액 5ml에 합성 세인트 IPAAm 분자 5 ㎎을 녹인다. 참고 : 디클로로 메탄 또는 톨루엔과 같은 용매로서 사용될 수있다. </li><li> 조심스럽게 마이크로 실린 또는 마이크로 피펫을 사용하여 통에 클로로포름에 용해 세인트 IPAAm의 27 μl를 놓습니다. </li><li> 5 분 동안 대기 한 후, 클로로포름의 완전한 증발을 허용 세인트 IPAAm의 molecu를 압축 수평으로 장벽을 이동계면 르. CM이 도달 할 때 (50)의 타겟 영역까지 0.5 mm / 초에서 장벽의 압축률을 유지한다. 주의 : 급속한 압축률 랭 뮤어 막 내의 결함을 야기한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 압축하는 동안 표면 압력 측정기구에 부착 빌헬 백금 접시 표면 압 (π) -A m 등온선을 측정한다. </li><li> 대상 지역의 크기에 도달 한 후, 세인트 IPAAm 분자 이완 할 수 있도록 5 분 동안 표면을 유지; 분자 압축 직후에 평형에 도달하지 않는다. </li><li> 견고 필름 흡착 5 분 동안 전송 장치를 이용하여 소수성 개질 된 유리 기판에 랭 뮤어 막을 옮긴다. 단말기 병렬 소수성 유리 기판을 고정한다. 정렬 단계에 장치를 연결하고 수직으로 이동합니다. </li><li> desiccato에서 1 일 동안 전송 장치 및 건조 수평 기판을 들어 올려아르 자형. </li></ol> 4. 세포를 배양하고, 랭 뮤어 필름 전송 된 표면에 세포 부착 및 박리 최적화 <ol><li> 10 % 태아를 포함하는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 조직 배양 폴리스티렌 (FPC 기판)에 CO 2 및 95 % 공기, 5 %에서 37 ° C에서 삼분의 합류점에 세포 현탁 배양 소 경동맥 내피 세포 (BAECs)을 제조 소 혈청 (FBS) 및 100 U / ㎖ 페니실린. </li><li> 합류점에 도달 한 후, CO 2 및 95 % 공기, 5 %에서 37 ° C에서 3 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 3 ㎖와 BAECs 치료. </li><li> DMEM 10 % FBS를 함유하는 10 ㎖를 첨가함으로써 트립신 EDTA를 비활성화하고, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집한다. </li><li> 5 분 120 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. DMEM 10 mL로 세포를 다시하면 일시 중지합니다. </li><li> 5 분 동안 살균 클린 벤치에 자외선 아래에있는 세인트 IPAAm 표면을 놓습니다. </li><li> 회수 된 가전을 시드세인트 IPAAm에 LLS 일회용 혈구에 의해 계수 1.0 × 104 세포 / ㎠의 농도로 표면 및 5 % CO 2 및 95 %로 37 ℃ 배양기 구비 현미경으로 표면에 세포를 관찰 공기. 참고 : 클린 벤치에 장착 된 자외선에 의해 세인트 IPAAm 표면을 소독. </li><li> 10 배 확대와 위상 현미경에 의해 37 ° C에서 약 24.5 시간 동안 부착 BAECs의 녹음 시간 경과 이미지. BAEC 부착, 약 3.5 시간 동안 20 ° C에서 세인트 IPAAm 표면에서 BAECs의 기록 분리 후. </li></ol> 랭 뮤어 필름 전송 표면 5. 세포 시트 제작 <ol><li> 동일한 방식으로 사용되는 배양 BAECs는 4 절에 설명. </li><li> 세인트 IPAAm 표면에 1.0 × 105 세포 / ㎠의 총 시드 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 일간 배양한다. 합류 BAECs는 자발적으로 20 ° C에서 분리.</li>
</ol>

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모든 저자는 원고 작성에 동등하게 기여했으며 최종 버전을 승인했습니다. 저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

온도 응답 표면은 랭 뮤어 - 쉐퍼 방법에 의해 제조하고, 세포 부착 / 분리 및 세포 시트 회수 표면 특성이 최적화되었다. 표면의 제조에 본 방법을 사용할 때, 몇 가지 단계가 중요하다. 세인트 IPAAm 분자의 분자 조성물은 세포 부착 및 박리에 표면 구조에 큰 영향 표면의 안정성, 확장자를 갖는다. 특히, 세인트 IPAAm 분자는 좁은 분자량 분포를 가져야한다. 제안 된 방법에서, 상이한 PIPAAm 쇄 길이를 갖는 두 세인트 IPAAm 분자는 분자량 및 분자량 분포를 제어 할 수 RAFT 중합에 의해 합성 하였다. 단계 나노 구조물의 결함을 방지 세인트 IPAAm 표면의 제조 동안 공기 - 물 계면의 오염을 방지하기 위해주의해야한다. 인터페이스에 폴리머 분자를 삭제, contaminan 전표면 압력은 대략 0 MN / m에 도달 할 때까지 TS를 흡입한다. 오염은 저점 빌헬 플레이트의 가장자리 주위에 축적되는 경향이있다. 빌헬 판의 표면에 약간의 오염이 있었기 때문에,...

나노 구조화 된 표면은 최근에 의한 패터닝, 세포 배양, 세정, 표면 스위칭 포함한 다양한 응용 가능성으로 상당한 주목을 받고있다. 예를 들어, 연꽃 잎과 다른 반응 표면의 나노 구조에서 영감을 초 소수성 표면은 외부 자극 1-4에 반응 할 수있다. 랭 뮤어 막은 가장 널리 연구 폴리머 코팅이다. 랭 뮤어 막은 공기 - 물 계면에 5-8 양친 성 분자를 적하함으로써 형성된다. 필름은 물리적 또는 화학적 흡착에 의해 고체 표면에 전사 할 수 있으며, 고체 표면에 분자 형태는 수직 및 수평 전송 방법 9-12를 사용하여 제어 될 수있다. 랭 뮤어 막의 밀도는 정확하게 공기 - 물 계면을 압축에 의해 조절 될 수있다. 최근,이 방법은 관련된 과학 바다 섬 structur를 제조하는 효과가 입증되었습니다양친 성 블록 공중 합체를 이용하여 에스. 나노 구조는 소수성 세그먼트의 코어 및 친수성 세그먼트 13-17의 쉘 구성 간주됩니다. 또한, 표면에 나노 구조체들의 수는 인터페이스에서 블록 공중 합체의 분자 당 면적 (m)를 제어함으로써 조절된다. 우리는 온도에 응답하여 배양 표면을 이용하여 원래의 고유 지지체없는 조직 공학 방법, 세포 시트 공학에 초점을 맞추고있다. 개발 된 기술은 다양한 기관 (18)의 회생 치료에 적용되고있다. 온도 응답하여 배양 표면은 표면 상에 19 ~ 27 폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드의) (PIPAAm), 온도 반응 분자를 그 래프팅에 의해 제조 하였다. PIPAAm 및 공중 합체 전시 32 ° C에 가까운 온도에서 수성 매질에서 낮은 임계 용액 온도 (LCST). 배양은 표면 온도 응답 교류 직류을 나타내<html> 소수성과 친수성 ​​사이에. 37 ° C에서 PIPAAm 그래프트 표면은 친수성이되고, 세포는 쉽게 부착 표면 상뿐만 아니라, 종래의 조직 배양에서 증식 된 폴리스티렌. 온도를 20 ℃로 하강 될 때, 표면은 친수성이되고, 세포는 자발적으로 표면으로부터 분리. 따라서, 표면 상에 배양 세포 융합 온도를 변화시킴으로써 본래 시트로서 수확 될 수있다. 이러한 세포 접착 및 박리 특성도. 실험실 데모 26 27 랭 뮤어 필름 코팅하여 제조면에서 표시 한 폴리스티렌 (P (성)) 및 PIPAAm (세인트 IPAAm)로 이루어지는 블록 공중 합체의 랭 뮤어 필름을 제조 하였다. 특정의 m과 랭 뮤어 막을 가로 소수성 개질 된 유리 기판에 전사 할 수있다. 또한, 온도에 응답하여 상기 제조 된 표면으로부터 세포의 부착 및 박리를 평가 하였다. _content &quot;&gt; 여기에서는 유리 기판 상에 열 응답하여 양친 성 블록 공중 합체로 이루어지는 나노 구조 랭 뮤어 필름의 제조에 대한 프로토콜을 설명한다. 우리의 방법은, 표면 과학의 다양한 분야에서, 유기 나노 필름에 효과적인 제조 방법을 제공 할 수 있고, 더 용이하게 할 수있다 에 대한 세포 부착을 효율적으로 제어하고 표면으로부터 자연 박리.

<table><tbody><tr><td>N-isopropylacrylamide</td><td>Kohjin</td><td></td><td>카탈로그 번호</td></tr><tr><td>없음 Azobis(4-cyanovaleric acid)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>스티렌</td><td>시그마-알드리치</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-트리옥산</td><td>시그마-알드리치</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-다이옥산</td><td>Wako 순수 화학</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마&nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>나카라이</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>시그마</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>일본 Bioserum</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAECs</td><td>건강 과학 Reserch 자원 은행</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Matsunami Glass Industry</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett 증착 트로프&nbsp;</td><td>KSV 인스트루먼트</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA 미듐 트로프</td></tr><tr><td>니콘 ECLIPSE TE2000-U</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

조직 공학 thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

세포 접착 및 박리를 제어하기 위한 'jove_content'>Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) 고정 표면은 Langmuir-Schaefer 방법으로 제작되었습니다. 폴리스티렌과 PIPAAm(St-IPAAms)으로 구성된 양친매성 블록 공중합체를 RAFT(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer) 라디칼 중합에 의해 합성했습니다. St-IPAAm 분자의 클로로포름 용액을 Langmuir-trough 장치에 부드럽게 떨어뜨리고 장치의 두 장벽을 수평으로 이동하여 필름을 압축하여 밀도를 조절했습니다. 그런 다음 St-IPAAm Langmuir 필름을 표면 고정 장치에 의해 소수성 변형 유리 기판에 수평으로 전사했습니다. 원자력 현미경 이미지는 표면의 나노 스케일 바다 섬 구조를 명확하게 보여주었습니다. 준비된 표면의 세포 부착 및 박리의 강도, 속도 및 품질은 PIPAAm 분자의 낮은 임계 용액 온도 범위에서 온도 변화에 의해 조절되었습니다. 또한, 최적화된 표면에서 2차원 세포 구조(세포 시트)를 성공적으로 복구했습니다. 이러한 고유한 PIPAAm 표면은 세포 접착 및 박리의 강도를 제어하는 데 유용할 수 있습니다.

폴리스티렌 특정 분자량의 폴리 (이소 프로필 아크릴 아미드의 N) (세인트 IPAAms)로 이루어지는 블록 공중 합체 RAFT 라디칼 중합에 의해 합성 하였다. Moad 외. (28)에 기재된 바와 같이 ECT는 연쇄 이동제로서 제조 하였다. 다른 PIPAAm 사슬 길이의 두 세인트 IPAAm 분자를 합성하고, 얻어진 블록 중합체 1 H 핵 자기 공명 (NMR) 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)에 의해 특징 하였다. 세인트 IPAAms의 분자량은 분자량 분포가 좁은 (1.31 및 1.50)으로 32,800 및 67,900이었다. 폴리스티렌 매크로 RAFT 에이전트와 PIPAAm의 단량체 전환은 17.4 % 이상 85.0 % 인 것으로 확인되었다. 합성 세인트 IPAAms는 각각 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480 선정됐다. <p class="jove_content" fo:...

내열반응성 블록 공중합체로 구성된 나노 스케일의 바다 섬 표면은 자발적인 세포 접착 및 분리를 제어하기 위해 Langmuir-Schaefer 방법에 의해 제조되었습니다. 표면의 준비와 표면에 있는 세포의 접착 및 분리가 모두 시각화되었습니다.

조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

블록 공중합체를 이용한 이 Langmuir-Schaefer 방법의 전반적인 목표는 세포 접착 및 부착 강도를 조절함으로써 온도 응답성 표면의 다양한 조건에서 세포 시트를 제작하는 것입니다. 이 방법은 생체 적합성 재료, 세포 배양 표면 및 생물학적 분리와 같은 바이오 소재 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온도 응답성 표면과 세포 간의 상호작용을 제어할 수 있으며, 세포 시트 회수를 위한 수정 조건을 최적화할 수 있다는 점입니다.이 방법은 세포와 표면 간의 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 바이오 분리 및 바이오필름과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우선, styrene, ECT 및 ACVA를 40 milliliters의 1, 4-Dioxane에 녹입니다. 반응성 종을 제거하기 위해 진공 상태에서 액체 질소로 용액을 15분에서 20분 동안 동결시킵니다.용액을 실온에서 서서히 해동시킨 후, 이 동결, 펌핑, 해동, 탈기 사이클을 3회 반복합니다. 오일 배스에서 70 °C로 15시간 동안 중합하여 폴리스티렌을 매크로 RAFT 제제로 얻습니다. 폴리스티렌 매크로 RAFT 제제를 800 mL의 에테르로 침전시킨 후, 진공 상태에서 건조합니다.다음으로, IPAAm 단량체, 폴리스티렌 macro-RAFT 제제 및 ACVA를 4 mL의 1, 4-Dioxane에 녹입니다. 이전과 같이 freeze, pump, thaw 탈기 사이클을 사용하여 용액 내의 산소를 제거합니다. 탈기 후 오일 배스에서 70 °C로 15시간 동안 중합을 수행합니다.마지막으로, polystyrene macro-RAFT agent와 동일한 방법으로 합성된 St-IPAAm 분자를 얻습니다. 유리 기판을 충분한 양의 acetone과 ethanol로 세척하고, 5분 동안 초음파 처리하여 표면 오염 물질을 제거합니다. 오븐에서 65 °C로 30분 동안 기판을 건조합니다.그 다음, 상온에서 산소 플라즈마를 사용하여 기판의 표면을 활성화합니다. 기판을 1% hexatrimethoxysilane이 포함된 톨루엔에 넣고 상온에서 하룻밤 동안 침지하여 기판을 실란화합니다. 이후, 실란화된 기판을 톨루엔으로 세척하고 아세톤에 30분 동안 침지하여 반응하지 않은 시약을 제거합니다.표면을 완전히 고정하기 위해 110 °C에서 2시간 동안 기판을 어닐링합니다. 마지막으로, 세포 배양 접시에 맞게 유리 절단기를 사용하여 실란화된 기판을 25 mm x 24 mm 크기로 자릅니다. 먼지 축적을 방지하기 위해 랑무이르 필름 장치를 캐비닛 안에 보관하십시오.오염 물질을 제거하기 위해 증류수와 에탄올로 배리어(barrier)가 설치된 랑뮈어 트러프(Langmuir trough)를 세척합니다. 보풀 없는 타월로 트러프와 배리어를 닦아 건조시킵니다. 그 다음, 트러프에 약 110 milliliters의 증류수를 채우고 트러프 양쪽에 배리어를 설치합니다.다음으로, 표면 장력을 모니터링하기 위해 백금 Wilhelmy 플레이트를 가스 버너로 플레이트가 붉게 변할 때까지 가열합니다. 그 후, 오염 물질을 제거하기 위해 플레이트를 증류수로 세척합니다. Wilhelmy 플레이트를 표면압 측정 장치에 연결된 와이어에 매달아 고정합니다.제조사의 프로토콜에 따라 표면압 측정 장치를 영점 조절하십시오. 트로프 양측의 배리어를 이용하여 트로프 상의 공기-물 계면을 압축하여, 폴리머 방울이 없는 상태에서 계면 면적이 약 50 square centimeters가 되도록 하십시오. 표면압이 거의 0 millinewtons per meter가 될 때까지 미세 오염 물질을 흡입하여 제거하십시오.양쪽의 배리어를 다시 배치하고, 증류수의 감소분을 보충하기 위해 증류수를 추가합니다. 다음으로, 합성된 St-IPAAm 분자 5 mg을 클로로포름 현상액 5 mL에 녹입니다. 그런 다음, 마이크로시린지 또는 마이크로피펫을 사용하여 클로로포름에 녹인 St-IPAAm 27 µL를 트로프 위에 조심스럽게 떨어뜨립니다.클로로포름이 완전히 증발할 때까지 5분 동안 기다린 후, 두 배리어를 수평으로 이동시켜 표면의 St-IPAAm 분자를 압축합니다. 목표 면적인 50 square centimeters에 도달할 때까지 배리어의 압축 속도를 0.5 millimeters per second로 유지합니다. 압축 과정 동안 제조사의 프로토콜에 따라 표면압 측정 장치에 연결된 백금 Wilhelmy 플레이트를 사용하여 표면압 Pi-A 등온선을 측정합니다.목표 면적 크기에 도달한 후, St-IPAAm 분자가 이완될 수 있도록 5분 동안 표면 상태를 유지합니다. 압축 직후에는 분자들이 즉시 평형 상태에 도달하지 않습니다. 그 다음, 필름을 견고하게 흡착시키기 위해 전사 장치를 사용하여 랭뮤어 필름을 소수성으로 변형된 유리 기판으로 5분 동안 전사합니다.소수성 유리 기판을 장치 위에 평행하게 고정합니다. 장치를 정렬 스테이지에 연결하고 수직으로 이동시킵니다. 이송 장치로 기판을 수평으로 들어 올린 후, 데시케이터에서 하루 동안 건조합니다.세포 현탁액을 준비하려면, FBS와 Penicillin이 포함된 DMEM을 사용하여 37°C, 5% CO2 및 95% 공기 조건의 조직 배양용 폴리스티렌에서 소 carotid artery 내피세포(BAECs)를 1/3 confluence까지 배양합니다. confluence에 도달하면, 37°C, 5% CO2 및 95% 공기 조건에서 0.25% trypsin EDTA 3 mL를 BAECs에 처리하여 3분간 반응시킵니다. 10% FBS가 포함된 DMEM 10 mL를 첨가하여 trypsin EDTA를 불활성화합니다.그리고 세포 현탁액을 50-milliliter 원뿔형 튜브에 수집합니다. 120 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 10 milliliters의 DMEM에 재현탁합니다. 일회용 혈구계수로 세포 수를 측정하여, 회수된 세포를 10,000 cells/cm² 농도로 St-IPAAm 표면에 접종합니다.37 °C, 5% CO2 및 95% air 조건의 인큐베이터가 장착된 현미경으로 표면의 세포를 관찰하십시오. 다음으로, 클린벤치에 장착된 자외선 램프로 St-IPAAm 표면을 멸균하십시오. 10배 배율의 위상차 현미경을 사용하여 37 °C에서 약 24.5시간 동안 부착된 BAEC의 타임랩스 이미지를 기록하십시오.BAEC 부착 후, 20 °C에서 약 3.5시간 동안 St-IPAAm 표면으로부터 BAEC가 탈착되는 과정을 기록합니다. Langmuir 필름 전사 표면에서의 세포 부착 및 탈착 조건을 최적화한 후, 이전과 동일하게 BAEC를 배양하여 세포 시트를 제작합니다. St-IPAAm 표면에 제곱센티미터당 총 100,000개의 세포를 파종합니다.그리고 37°C, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양합니다. 합류된 BAEC는 20°C에서 자발적으로 탈착되었습니다. 온도 응답성 랑뮈어 필름 전사 표면의 준비 과정이 여기에 제시되어 있습니다.합성된 St-IPAAm 클로로포름 용액을 공기-물 계면에 천천히 떨어뜨렸습니다. 두 개의 배리어(barrier)를 사용하여 계면 위의 St-IPAAm 분자들을 압축하였으며, 목표 면적인 50 square centimeters에 도달할 때까지 진행하였습니다. 랑뮈어(Langmuir) 필름의 결함 여부를 감지하기 위해 압축 과정 동안 표면압을 측정하였습니다.압축 후, 소수성으로 변형된 커버 글라스 기판을 정렬 스테이지를 사용하여 계면에 수평으로 배치하였습니다. 기판을 수평으로 들어 올려 하루 동안 건조시켰습니다. 이 단계를 거친 후, St-IPAAm 표면을 세포 배양 실험에 사용할 준비가 되었습니다.St-IPAAm 표면의 원자 힘 현미경 지형 이미지의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 두 St-IPAAm 표면 모두에서 나노구조가 관찰되었습니다. 나노구조의 크기와 형태는 AM 및 St-IPAAm의 조성에 크게 의존하였습니다.여기 St-IPAAm 480과 분자당 40 square nanometers의 AM을 사용하여 전사된 Langmuir film 표면에서 회수된 세포 시트의 거시적 이미지가 제시되어 있습니다. 세포는 37 °C에서 St-IPAAm 170 및 St-IPAAm 480 표면 위에서 3일간 배양 후 컨플루언스(confluence) 상태에 도달했습니다. 그리고 온도를 37 °C에서 20 °C로 낮춘 후 세포 시트가 빠르게 회수되었습니다.본 영상을 시청하신 후, 여러분은 폴리머의 분자 조성 설계 및 제작 방법, 랑뮈어(Langmuir) 필름의 제작 및 전사 방법, 세포 부착 및 탈착 제어, 그리고 세포 시트 회수 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 기술의 개발은 생체 재료 및 조직 공학 분야의 연구자들이 세포와 표면 간의 상호작용을 탐구하고 퇴행성 질환 치료에 사용할 세포 배양 전략을 모색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 본 기술은 환자로부터 제공받은 다양한 세포 유형의 세포 시트를 제작할 수 있는 가능성이 있으므로, 세포 이식 치료로까지 그 응용 범위가 확장될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

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조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

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