조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

블록 공중합체를 이용한 이 Langmuir-Schaefer 방법의 전반적인 목표는 세포 접착 및 부착 강도를 조절함으로써 온도 응답성 표면의 다양한 조건에서 세포 시트를 제작하는 것입니다. 이 방법은 생체 적합성 재료, 세포 배양 표면 및 생물학적 분리와 같은 바이오 소재 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온도 응답성 표면과 세포 간의 상호작용을 제어할 수 있으며, 세포 시트 회수를 위한 수정 조건을 최적화할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 세포와 표면 간의 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 바이오 분리 및 바이오필름과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 우선, styrene, ECT 및 ACVA를 40 milliliters의 1, 4-Dioxane에 녹입니다. 반응성 종을 제거하기 위해 진공 상태에서 액체 질소로 용액을 15분에서 20분 동안 동결시킵니다.

용액을 실온에서 서서히 해동시킨 후, 이 동결, 펌핑, 해동, 탈기 사이클을 3회 반복합니다. 오일 배스에서 70 °C로 15시간 동안 중합하여 폴리스티렌을 매크로 RAFT 제제로 얻습니다. 폴리스티렌 매크로 RAFT 제제를 800 mL의 에테르로 침전시킨 후, 진공 상태에서 건조합니다.

다음으로, IPAAm 단량체, 폴리스티렌 macro-RAFT 제제 및 ACVA를 4 mL의 1, 4-Dioxane에 녹입니다. 이전과 같이 freeze, pump, thaw 탈기 사이클을 사용하여 용액 내의 산소를 제거합니다. 탈기 후 오일 배스에서 70 °C로 15시간 동안 중합을 수행합니다.

마지막으로, polystyrene macro-RAFT agent와 동일한 방법으로 합성된 St-IPAAm 분자를 얻습니다. 유리 기판을 충분한 양의 acetone과 ethanol로 세척하고, 5분 동안 초음파 처리하여 표면 오염 물질을 제거합니다. 오븐에서 65 °C로 30분 동안 기판을 건조합니다.

그 다음, 상온에서 산소 플라즈마를 사용하여 기판의 표면을 활성화합니다. 기판을 1% hexatrimethoxysilane이 포함된 톨루엔에 넣고 상온에서 하룻밤 동안 침지하여 기판을 실란화합니다. 이후, 실란화된 기판을 톨루엔으로 세척하고 아세톤에 30분 동안 침지하여 반응하지 않은 시약을 제거합니다.

표면을 완전히 고정하기 위해 110 °C에서 2시간 동안 기판을 어닐링합니다. 마지막으로, 세포 배양 접시에 맞게 유리 절단기를 사용하여 실란화된 기판을 25 mm x 24 mm 크기로 자릅니다. 먼지 축적을 방지하기 위해 랑무이르 필름 장치를 캐비닛 안에 보관하십시오.

오염 물질을 제거하기 위해 증류수와 에탄올로 배리어(barrier)가 설치된 랑뮈어 트러프(Langmuir trough)를 세척합니다. 보풀 없는 타월로 트러프와 배리어를 닦아 건조시킵니다. 그 다음, 트러프에 약 110 milliliters의 증류수를 채우고 트러프 양쪽에 배리어를 설치합니다.

다음으로, 표면 장력을 모니터링하기 위해 백금 Wilhelmy 플레이트를 가스 버너로 플레이트가 붉게 변할 때까지 가열합니다. 그 후, 오염 물질을 제거하기 위해 플레이트를 증류수로 세척합니다. Wilhelmy 플레이트를 표면압 측정 장치에 연결된 와이어에 매달아 고정합니다.

제조사의 프로토콜에 따라 표면압 측정 장치를 영점 조절하십시오. 트로프 양측의 배리어를 이용하여 트로프 상의 공기-물 계면을 압축하여, 폴리머 방울이 없는 상태에서 계면 면적이 약 50 square centimeters가 되도록 하십시오. 표면압이 거의 0 millinewtons per meter가 될 때까지 미세 오염 물질을 흡입하여 제거하십시오.

양쪽의 배리어를 다시 배치하고, 증류수의 감소분을 보충하기 위해 증류수를 추가합니다. 다음으로, 합성된 St-IPAAm 분자 5 mg을 클로로포름 현상액 5 mL에 녹입니다. 그런 다음, 마이크로시린지 또는 마이크로피펫을 사용하여 클로로포름에 녹인 St-IPAAm 27 µL를 트로프 위에 조심스럽게 떨어뜨립니다.

클로로포름이 완전히 증발할 때까지 5분 동안 기다린 후, 두 배리어를 수평으로 이동시켜 표면의 St-IPAAm 분자를 압축합니다. 목표 면적인 50 square centimeters에 도달할 때까지 배리어의 압축 속도를 0.5 millimeters per second로 유지합니다. 압축 과정 동안 제조사의 프로토콜에 따라 표면압 측정 장치에 연결된 백금 Wilhelmy 플레이트를 사용하여 표면압 Pi-A 등온선을 측정합니다.

목표 면적 크기에 도달한 후, St-IPAAm 분자가 이완될 수 있도록 5분 동안 표면 상태를 유지합니다. 압축 직후에는 분자들이 즉시 평형 상태에 도달하지 않습니다. 그 다음, 필름을 견고하게 흡착시키기 위해 전사 장치를 사용하여 랭뮤어 필름을 소수성으로 변형된 유리 기판으로 5분 동안 전사합니다.

소수성 유리 기판을 장치 위에 평행하게 고정합니다. 장치를 정렬 스테이지에 연결하고 수직으로 이동시킵니다. 이송 장치로 기판을 수평으로 들어 올린 후, 데시케이터에서 하루 동안 건조합니다.

세포 현탁액을 준비하려면, FBS와 Penicillin이 포함된 DMEM을 사용하여 37°C, 5% CO2 및 95% 공기 조건의 조직 배양용 폴리스티렌에서 소 carotid artery 내피세포(BAECs)를 1/3 confluence까지 배양합니다. confluence에 도달하면, 37°C, 5% CO2 및 95% 공기 조건에서 0.25% trypsin EDTA 3 mL를 BAECs에 처리하여 3분간 반응시킵니다. 10% FBS가 포함된 DMEM 10 mL를 첨가하여 trypsin EDTA를 불활성화합니다.

그리고 세포 현탁액을 50-milliliter 원뿔형 튜브에 수집합니다. 120 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 10 milliliters의 DMEM에 재현탁합니다. 일회용 혈구계수로 세포 수를 측정하여, 회수된 세포를 10,000 cells/cm² 농도로 St-IPAAm 표면에 접종합니다.

37 °C, 5% CO2 및 95% air 조건의 인큐베이터가 장착된 현미경으로 표면의 세포를 관찰하십시오. 다음으로, 클린벤치에 장착된 자외선 램프로 St-IPAAm 표면을 멸균하십시오. 10배 배율의 위상차 현미경을 사용하여 37 °C에서 약 24.5시간 동안 부착된 BAEC의 타임랩스 이미지를 기록하십시오.

BAEC 부착 후, 20 °C에서 약 3.5시간 동안 St-IPAAm 표면으로부터 BAEC가 탈착되는 과정을 기록합니다. Langmuir 필름 전사 표면에서의 세포 부착 및 탈착 조건을 최적화한 후, 이전과 동일하게 BAEC를 배양하여 세포 시트를 제작합니다. St-IPAAm 표면에 제곱센티미터당 총 100,000개의 세포를 파종합니다.

그리고 37°C, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양합니다. 합류된 BAEC는 20°C에서 자발적으로 탈착되었습니다. 온도 응답성 랑뮈어 필름 전사 표면의 준비 과정이 여기에 제시되어 있습니다.

합성된 St-IPAAm 클로로포름 용액을 공기-물 계면에 천천히 떨어뜨렸습니다. 두 개의 배리어(barrier)를 사용하여 계면 위의 St-IPAAm 분자들을 압축하였으며, 목표 면적인 50 square centimeters에 도달할 때까지 진행하였습니다. 랑뮈어(Langmuir) 필름의 결함 여부를 감지하기 위해 압축 과정 동안 표면압을 측정하였습니다.

압축 후, 소수성으로 변형된 커버 글라스 기판을 정렬 스테이지를 사용하여 계면에 수평으로 배치하였습니다. 기판을 수평으로 들어 올려 하루 동안 건조시켰습니다. 이 단계를 거친 후, St-IPAAm 표면을 세포 배양 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

St-IPAAm 표면의 원자 힘 현미경 지형 이미지의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 두 St-IPAAm 표면 모두에서 나노구조가 관찰되었습니다. 나노구조의 크기와 형태는 AM 및 St-IPAAm의 조성에 크게 의존하였습니다.

여기 St-IPAAm 480과 분자당 40 square nanometers의 AM을 사용하여 전사된 Langmuir film 표면에서 회수된 세포 시트의 거시적 이미지가 제시되어 있습니다. 세포는 37 °C에서 St-IPAAm 170 및 St-IPAAm 480 표면 위에서 3일간 배양 후 컨플루언스(confluence) 상태에 도달했습니다. 그리고 온도를 37 °C에서 20 °C로 낮춘 후 세포 시트가 빠르게 회수되었습니다.

본 영상을 시청하신 후, 여러분은 폴리머의 분자 조성 설계 및 제작 방법, 랑뮈어(Langmuir) 필름의 제작 및 전사 방법, 세포 부착 및 탈착 제어, 그리고 세포 시트 회수 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 기술의 개발은 생체 재료 및 조직 공학 분야의 연구자들이 세포와 표면 간의 상호작용을 탐구하고 퇴행성 질환 치료에 사용할 세포 배양 전략을 모색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 본 기술은 환자로부터 제공받은 다양한 세포 유형의 세포 시트를 제작할 수 있는 가능성이 있으므로, 세포 이식 치료로까지 그 응용 범위가 확장될 수 있습니다.