식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

이 방법의 전반적인 목표는 단일 및 고 복제 DNA 프로브를 사용하여 C 2 혼성화 기술의 형광에 적합한 식물 염색체를 준비하는 것입니다. 이 방법은 염색체 재배열 감지, 염색체의 유전적 마커 정렬, 서로 다른 종 간의 비교 분석과 같은 세포 유전학 및 게놈 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 염색체 확산을 빠르고 쉽고 효율적으로 준비할 수 있다는 것입니다.

세포 현탁액은 영하 20도에서 최대 2개월까지 보관할 수 있으며 필요할 때 염색체 준비에 사용할 수 있습니다. 우리는 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 된 것이 가장 좋은 이유는, 적합한 염색체의 수와 질이 급격히 증가한 것이 인간의 날이며, 이틀 후 섭씨 22도에서 24도의 온도에서 이틀 동안 어두운 조건에서 페트리 접시에 두 겹의 축축한 여과지에 10-20개의 보리 씨앗을 발아시키는 것을 관찰했을 때입니다. 면도날을 사용하여 씨앗에서 1-2cm 길이의 격렬한 뿌리를 잘라냅니다.

다음으로, 차가운 수돗물이 들어있는 500ml 유리병을 으깬 얼음물에 넣어 얼음물을 준비합니다. 얼음처럼 차가운 물을 폭기하고 뿌리 끝을 20시간 동안 담궈 중기 세포의 빈도를 높입니다. 뿌리를 물에서 50 밀리리터의 에탄올 아세트산 고정액으로 옮겨 고정 후 2 일 동안 실온에서 고정합니다.

50ml 유리 스피커에 30ml의 얼음처럼 차가운 수돗물로 10-20개의 뿌리를 5분 동안 두 번 씻습니다. 집게를 사용하여 뿌리를 30ml의 구연산염 완충액으로 하나씩 옮깁니다. 유리 스피커를 5분 동안 두 번 흔들어 뿌리를 씻습니다.

그런 다음 여과지에 뿌리를 올려 현미경으로 액체를 완전히 제거합니다. 면도날을 사용하여 원하지 않는 비분열 조직을 잘라냅니다. 이 절차의 가장 중요한 단계는 종마다 다를 수 있는 적절한 소화 시간을 결정하는 것입니다.

여기서 최대 20 개의 뿌리 끝이 섭씨 37 도에서 약 50 분 동안 1 밀리리터의 효소 혼합물에 배양됩니다. 현미경으로 시계 유리의 식물 조직을 부드럽게 하려면 피펫팅으로 효소를 제거하고 뿌리 끝을 얼음 위에서 0.01 몰 시트레이트 완충액 5ml로 세척하여 잔류 효소를 대체합니다. 같은 시계 유리에 96% 에탄올 1ml를 두 번 조심스럽게 뿌리 끝을 계속 씻습니다.

그런 다음 에탄올을 뿌리 끝당 10-15마이크로리터의 갓 준비한 고정액으로 교체하십시오. 뿌리 끝을 고정제와 함께 2ml 튜브에 옮기고 해부 바늘 또는 집게로 뿌리 줄기를 분해합니다. 튜브를 20번 두드려 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 얻습니다.

그런 다음 물에 적신 티슈 페이퍼를 섭씨 50도의 핫 플레이트에 2-3겹 놓습니다. 미세한 슬라이드를 냉장고의 얼음, 차가운 수돗물에 30분 동안 담그십시오. 그런 다음 축축한 티슈 페이퍼 위에 슬라이드를 놓고 7-10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 피펫으로 얹고 20cm 거리에서 핫 플레이트에 놓인 냉각 된 슬라이드에 떨어 뜨립니다.

슬라이드의 세포 현탁액과 동일한 위치에 아세트산 에탄올 혼합물 10 마이크로 리터를 사용하고이를 따르고 슬라이드를 핫 플레이트에 보관하십시오. 2분 후 젖은 티슈 없이 슬라이드를 핫 플레이트에 놓고 1분 더 건조시킵니다. 염색체 확산의 품질을 제어하기 위해 얼굴 조영제 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인합니다.

슬라이드를 당일에 사용하거나 섭씨 영하 20도의 코플린 항아리에 96% 에탄올을 담가 보관하여 물고기보다 먼저 슬라이드를 전처리합니다. 집게를 사용하여 50 밀리리터의 두 XSSC가 들어있는 코핀 병에 슬라이드를 5 분 동안 놓습니다. 슬라이드를 50ml의 45% 아세트산이 들어 있는 코플랜 용기에 3-10분 동안 옮깁니다.

다음으로, 10분 동안 2개의 XSSC 50밀리리터가 들어 있는 코플랜 용기에 슬라이드를 옮깁니다. 그런 다음 슬라이드를 50ml의 4% 포름알데히드가 들어 있는 코플린 항아리에 옮기고 슬라이드를 10분 동안 담가 염색체를 고정합니다. 50밀리리터의 2개의 XSSC가 들어 있는 코플린 항아리에 슬라이드를 각각 4분씩 세 번 헹궈 포름알데히드를 제거합니다.

그런 다음 70%90% 및 100%에탄올 시리즈로 슬라이드를 2분 동안 탈수하고 수직 위치에서 슬라이드를 건조시킵니다. 각 슬라이드에 대해 10마이크로리터의 탈이온화 형태 아미드 5마이크로리터의 4X 혼성화 완충액, 3마이크로리터의 프로브 및 2마이크로리터의 D ns 자유수를 사용하여 20마이크로리터의 혼성화 용액을 준비합니다. 슬라이드당 20마이크로리터의 혼성화 용액을 추가하고 24 x 32mm 커버 슬립으로 덮습니다.

커버 슬립을 고무 시멘트로 밀봉한 후 열판에서 섭씨 80도에서 2분 동안 프로브가 있는 슬라이드를 동시에 밀봉한 후 슬라이드를 습한 챔버로 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 빛을 피하고 두 개의 XSSC가 있는 커플링 용기에 슬라이드를 헹궈 커버 슬립을 제거합니다. 그런 다음 섭씨 55-60도, XSSC 2개가 들어 있는 코플랜 용기에 슬라이드를 넣고 20분 동안 배양합니다.

다음으로, 실온에서 2분 동안 코플랜 용기에 두 개의 XSSC에 슬라이드를 놓습니다. 물론. 코플랜 용기에 담긴 슬라이드를 70%90%와 100%에탄올을 연속으로 2분 동안 탈수합니다. 공기. 슬라이드를 말리고 강렬한 빛을 피하고 Antifa 장착 매체에 dappy로 counterstaining하십시오.

epi 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다. 필터 선택은 필요한 경우 프로브 라벨링에 사용되는 형광 색소에 따라 다릅니다. 슬라이드는 어두운 조건에서 최대 1년까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

빠른 공기 건조 낙하 염색체 준비 방법에 의해 제조된 유사분열 중기 확산이 여기에 나와 있습니다. 물고기 분석은 반복 및 단일 복제 시퀀스를 모두 사용하여 수행되었습니다. 이미지는 해당 형광 4개의 여기를 가능하게 하는 필터 세트가 있는 에피 형광 현미경으로 획득하고 고감도 CCD 흑백 카메라로 캡처했습니다.

단일 복제 프로브와 5개의 S-R-D-N-A를 사용하여 비축물과 불가리의 유사분열 중기 염색체에 대한 물고기 실험은 독특하고 고품질의 신호를 보여주었습니다. Hordy와 BULBUS의 염색체에서 CT CTT 10 현미부수체의 혼성화는 특이하고 뚜렷한 패턴을 가져왔습니다. PSC 119 2 프로브를 사용하여 sala 시리얼의 유사분열 중기 염색체에 대한 물고기 실험은 특이적이고 고품질의 신호를 생성했습니다.

이 접근법의 명백한 이점은 잘 퍼져 있고, 손상되지 않았으며, 성공적인 어류 분석을 위한 완벽한 전제 조건으로 작용하는 수많은 중기 염색체입니다. 일단 마스터하면 이 절차를 적절하게 수행하면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청 한 후, 물고기 IDE 및 이전 버전에 대한 고품질 유사 분열 메타 얼굴 염색체 공간 촬영을 준비하는 방법에 대해 잘 이해해야하며, 이러한 절차를 수행 할 때 항상 그래프와 필름 후드를 사용하는 높이가 매우 위험 할 수 있습니다.