Name: 사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 반자동화된 항체 칵테일 준비 방법으로 사람 말초 혈액의 면역표현형 분석 신뢰성을 높이세요. 자동화된 액체 처리 시스템을 활용하여 시약 분주 변이성을 최소화하고 실험 재현성을 향상시킵니다.

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시스템 설계 및 구성에 도움을 주신 Hannah Puzas님과 기술적인 조언을 해 주신 Kevin Khovananth님께 감사드립니다. 이 작업을 위한 자금은 허스트 재단(Hearst Foundations)과 프로비던스 포틀랜드 의료 재단(Providence Portland Medical Foundation)에서 제공했습니다.

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<li>Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+I+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).</li>
<li>O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+validation+of+flow+cytometric+testing+during+drug+development%3A+II+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays.</a> J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).</li>
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<li>Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
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<li>Biancotto, A., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+human+immunome%3A+the+complexity+of+comprehensive+leukocyte+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).</li>
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<li>Villanova, F., Di Meglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Lyoplate+Based+Flow+Cytometry+and+Computational+Analysis+for+Standardized+Immunological+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery.</a> PloS One. 8 (7), e65485(2013).</li>
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</ol>

YK, ILG, TLM, WLM, DPH 및 KSB : 없음 경쟁 금전적 이해. ANT는 베크만 쿨터의 직원이며,이 비디오 문서의 주식 공개는 벡크 만 쿨터 후원

말초 혈액의 면역 표현형은 면역 개별 응답에 대한 통찰력을 확보하기위한 매우 중요합니다. 문제는 실험 - 투 - 실험 변동성 1,14을 제어하는 분석의 표준화에있다. 변화 중 하나는 주요 소스 샘플의 인간의 조작에있다. 따라서, 시료 처리의 부분 또는 전체 자동화 실험 간 실험 가변성 1,14 극적인 감소를 용이하게 생각할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 전체 혈액의 면역 표현형의 샘플 염색에 대한 2 차원 바코드 판독기가 장착 된 자동화 액체 핸들러를 도입하여 분석 변동성을 최소화하기 위해 성공적인 노력을보고한다. 디자인, 우리의 방법은 다양합니다 그들을 정의하는 추가 &quot;자료 칵테일&quot;을 추가하여 다른 면역 하위 집합을 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 서브 세트들은 T 헬퍼 세포, T 조절 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포 및 단핵구 (원고를 포함준비) 18. 우리는 추가 마커 1을 도입하여 컨소시엄의 추천 항체 패널을 채택. 우리가 유도 항원의 검출에 대한 이러한 채널을 예약하고 싶었다로 세포 집단은, 검출기 화려한 보라색 421 (BV421)에 최소한의 방출과 형광 색소에 접합 된 &quot;자료 칵테일&quot;, 피코 에리 트린 (PE)를 사용하여 식별 및 알로 (APC) 하였다. 이 기능은 면역 세포의 활성화 상태를 모니터링 할 수있는 가장 높은 감도를 보장뿐만 아니라,이 세 가지 형광 색소가 가장 많이 유도 마커에 대한 항체가 결합 될 때 새로운 활성화 마커를 유연하게 숙박 할 수 있습니다뿐만 아닙니다. 따라서, 우리의 방법뿐만 아니라 전체 혈액의 면역 표현형을위한 칵테일 제조에 적합뿐만 아니라 세분화 된 조직 (예를 들면, 종양)에서 발견 한 말초 혈액 단핵 세포와 세포를 포함하는 다른 샘플을 염색하는 데 유용합니다. 성공적인 소개우리의 방법의 duction 특별한 실험 실용 준비의 단계에 대한 관심, 그리고 프로그래밍 및 방법의 실행을 필요로한다. 2 차원 바코드 튜브의 제조는 사람이 읽을 수있는 라벨과 지정된 튜브에 항체의 전송과 라벨을 포함한다. 오류의 도입을 방지하기 위해, 우리는 두 사람과이 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 스프레드 시트를 변경 할 때마다, 연구자들은이 방법이 제대로 작동하는지 확인해야합니다. 프로그래밍시 적절한 피펫 팅 방법을 선택하는 것은 성공적인 액체 전송을 보장합니다. LLS는 우리가 P50 또는 P200 전도성 팁을 사용하는 항체 튜브의 바닥에서 침전 된 이물질을받지 않고 피펫 팅을 할 수 있습니다. LLS는 P1000 팁 더 민감하고 때로는 거짓 거품의 존재에 의해 트리거로 LLS는 P1000 팁에 대한 좋은 선택지가되지 않을 수 있습니다. 팁의 가장자리 사이의 공간이 충분하지 않으면 실험 실용 정의의 높이는, 예를 들면, 같은 차선의 액체 전사가 발생할 수있는 각 기기 조정되어야튜브의 바닥. 도 12에 도시 된 바와 같이 &quot;기본 칵테일&quot;및 / 또는 &quot;활성화 칵테일&quot;을 잘 볼 텍싱되지 않은 경우, 그것은 최적의 얼룩을 초래할 수있다. 우리는 시약 (19) 분배와 관련 변동성을 줄이기 위해 다른 방법으로 세포 염색을 위해 동결 건조 된 시약을 사용하는 방법에 대해 생각했다. 그러나, 브릴리언트 바이올렛 염료 고분자 접합체 서로 일으키는 비특이적 신호와 상호 작용하는 것으로 알려져있다. 이와 같이, 동결 건조 된 시약에 두 개 이상의 중합체 접합체 (예 BV421 및 BV650 등) 비 특정 시그널링이 발생할 수 첨가 (예 BV421 + 인구 BV650 배경 신호의 증가) 20. 또한, 동결 건조 된 시약은 새로운 염색 등의 유연성이 부족하다. 그들은 일반적으로 더 비싸고 대량 주문이 필요합니다. 이러한 이유로, 2 차원 바코드 튜브 장착 자동화 액체 핸들러를 사용하여 선택 하였다. 그것은 톤 있지만AKE를 시간을 설정하고 이러한 요인은 생산성 향상과 분석의 재현성에 의해 보상됩니다 장기적으로 악기를 구입하기 위해 선행 투자를 수반합니다. 사실, 몇몇 그룹은 이전에 면역 표현형 또는 유사한 애플리케이션 (21, 22)의 워크 플로우에 자동화 액체 핸들러의 성공적인 통합을보고했다. 유동 세포 계측법 분석을위한 자동화 솔루션은 상용 소스 (FACS SPA III, 자동 칵테일 제조 워크 스테이션 및 FlowStainer)에서 사용할 수 있습니다. 이것은 또한 면역 표현형에 대한 자동화 된 칵테일 준비를위한 큰 필요가 있음을 나타냅니다. 이 기술을 마스터 한 후, 우리는 완전 자동화 된 전체 혈액의 면역 표현형의 개발은 더 실험 - 투 - 실험 변동성을 줄일 수, 심지어 23을 설정 다기관 임상 시험에서 전체 혈액의 면역 표현형이 가능 할 수 있다는 구상. 우리는 이미를 Lyse이었다 사용하기 시작했다시간 조수 용해 및 세척 단계를 자동화합니다. 또한 2D 바코드 튜브 항체의 양과 시약 분배 추적 자동 판정 크게 각각 항체의 재고 및 우리의 방법을 통해 품질 관리를 향상시킬 수 있음을 상상할.

인간의 말초 혈액의 면역 표현형은 면역 세포 하위 집합 1 양적, 질적 변화를 결정한다. 이 작업 및 저항 예측 바이오 마커 에이즈 발견 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고, 복합 면역 요법의 개발을 용이하게한다. 따라서, 면역 표현형의 검증 및 표준화 학술 연구자, 임상 실험실과 산업에 상당한 관심의 영역입니다. 유세포 방법에 의해 말초 혈액의 면역 표현형 현재 혈액 학적 악성 종양 3 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 4,5, 면역 요구에 대한 말초 혈액 신뢰성 면역 표현형 그 때문에 검증 및 표준화 할 사항의 임상 관리에 사용되지만 면역 세포 하위 집합 및 활성화 / 억제 수용체 1,6-8보다 광범위한 범위를 필요로한다. Successful 면역 표현형은 장비 설치 및 세포 얼룩 절차 9,10에 관한 실험 - 투 - 실험 변동성을 최소화하기 위해주의 표준화가 필요합니다. 유동 세포 계측법에 대한 장비 설정 표준화가 잘 전 우려 9,11,12를 해결하기 위해 설립 동안, 면역 세포의 서브 세트 및 활성화 상태의 범위를 제한하지 않고 세포의 염색에 관한 변동을 최소화하는 방법을 불분명. 항원의 수가 증가를 검출 할 때, 너무도 오차 변동은 최적의 시약 분주과 교차 오염에 기인 기회를한다. 응고 전혈 phenoptypic 분석 방법 임상 화학 분석에 사용하기 위해 1980 년대 후반에 설립되었다. 이 같은 방법은 샘플 준비를위한 연구 실험실의 요구를 제공하고 있습니다. 중요한 것은, 임상 실험에 사용 된 항체 칵테일은 통상적으로 덜 복잡하다 아바ilable 사전 역가 및 제조 업체에서 미리 혼합. 미리 혼합 된 항체 칵테일의 단 하나의 전송이 필요합니다. 연구 설정에서 10-16 항체의 항체 칵테일 전형적인. 각각의 칵테일 실험실에 의해 안정성을 검증하거나 각 분석하기 전에 신선한 준비해야합니다. 샘플에 대해 여러 항체 칵테일을 준비 50-80 개별 항체의 피펫, 지루하고 오류가 발생하기 쉬운 둘 다 작업을 수반 할 수 있습니다. 칵테일 제조의 자동화는 적은 오류와 같은 수동 칵테일 준비에 비해 여러 가지 장점을 가지고, 피펫의 정확도를 증가하고, 어쩌면 시약 소모 감소했다. 여기서는 제제를 샘플링 관련 변동성을 최소화하기 위해 면역 표현형의 세포 염색 방법으로 2 차원 (2D) 바코드 리더를 구비 한 자동화 된 액체 핸들러의 성공적인 도입을보고한다.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>NXp Span-8 실험실 자동화 워크스테이션&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31839</td><td>실험실 자동화 워크스테이션&nbsp;</td></tr><tr><td>인서트, 튜브, 11 mm, 화이트, 1.5 ml 마이크로퓨지 튜브용 (25개 케이스)</td> <td>Beckman Coulter</td><td>373696</td><td>액세서리, 마이크로퓨지 튜브를 수용할 수 있는 24-Position 튜브 랙용.&nbsp;</td></tr><tr><td>LLS 키트</td><td>Beckman Coulter</td><td>719262</td><td>액체 레벨 감지를 가능하게 하는 실험실 자동화 워크스테이션의 데크 하단 부착</td></tr><tr><td>24-Position Tube Rack</td><td>Beckman Coulter</td><td>373661</td><td>항체 칵테일 또는 혈액용 마이크로퓨지 튜브를 수용하는 튜브 랙</td></tr><tr><td>BIOHAZARD 오토클레이브 백 12 x 24인치 RED</td><td>LabMart</td><td>M111416</td><td>실험실 자동화 워크스테이션</td></tr><tr><td>용 일회용 오토클레이브 백VisionMate 고속 2D 바코드 리더</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1850</td><td>2D 바코드 리더</td></tr><tr><td>8-채널 핸드헬드 스크류 캡 캐퍼/디캐퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>4105MAT</td><td>2D 바코드 튜브의 디캡핑 및 캡핑용&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-335</td> 실험실 자동화 워크스테이션 CoolRack XT CFT24 살생물 BCS-534에 <td>칵테일을 만들거나 혈액 표본을 공급하기 위해</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>샘플 튜브를 담습니다.</td></tr><tr><td>래치 랙의 1.0ml 매트릭스 스크류탑 앰버 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741AMB</td><td>형광 염료 결합 항체 저장을 위한 2D 바코드 튜브</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P1000 팁, 전도성, 장벽이 있는 사전 멸균, 1,025 &마이크로; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>실험실</td><td>자동화 워크스테이션을 위한 987925 팁&nbsp;</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P50 팁, 전도성, 장벽이 있는 사전 멸균, 50 &마이크로; l (10개의 랙 케이스)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01091</td><td>실험실 자동화 워크스테이션용 팁&nbsp;</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P250 팁, 전도성, 사전 멸균 및 배리어 (10개 랙 케이스)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>394627 팁 실험실 자동화 워크스테이션&nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACS 용해 용액 10x 농축</td>액 <td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>RBC 용해</td></tr><tr><td>Falcon 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td>샘플 튜브</td></tr><tr><td>Anti-CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td>Effector T cell panel (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0038-42</td><td>Effector T cell panel (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD4 PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341654</td><td>Effector T cell panel (base)</td></tr><tr><td>Anti-TCRgd BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564156</td><td>Effector T cell panel (base)</td></tr><tr><td>Anti-TCRab BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563825</td><td>Effector T cell panel (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>Effector T cell panel (base)</td></tr><tr><td>Anti-CCR7 PE-CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562381</td><td>이펙터 T 세포 패널(베이스)</td></tr><tr><td>Anti-CD45RA PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337167</td><td>Effector T 세포 패널(베이스)</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562804</td><td>Effector T 세포 패널(활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD278(ICOS) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557802</td><td>Effector T 세포 패널(활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD38 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340439</td><td>이펙터 T 세포 패널(활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD279(PD1) BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562516</td><td>이펙터 T 세포 패널(활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD357(GITR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5875-42</td><td>이펙터 T 세포 패널(활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD137(41BB) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550890</td><td>이펙터 T 세포 패널(활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD69 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562884</td><td>이펙터 T 세포 패널 (활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD314 (NKG2D) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557940</td><td>이펙터 T 세포 패널 (활성화)</td></tr><tr><td>Anti-CD134 (OX40) APC</td><td>BioLegend</td><td>350008</td><td>이펙터 T 셀 패널 (활성화)</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 플라스틱 혈액 채취 튜브 with Sodium Heparin: Conventional Stopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-689-6</td><td>혈액</td></tr> <tr><td>수집용알부민, 소 혈청, 분획 V, RIA 및 ELISA 등급</td><td>EMD Millipore</td><td>126593</td><td>플로우 워시 버퍼 용</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>플로우 워시 버퍼</td></tr><tr><td>용 헤파린, 나트륨 염</td><td>Affimetrix</td><td>16920</td><td>플로우 워시 버퍼</td></tr><tr><td>용 Hank' s Balanced Salt Solution(HBSS), 1x, 칼슘, 마그네슘 함유, 페놀 불포함 Red</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30588.02</td><td>플로우 워시 버퍼용</td></tr></tbody></table>

사람 말초 혈액의 immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

흐름에 의한 말초 혈액의 면역 표현형은 세포 계측법 질병과 치료 기간 동안 주변 백혈구의 주파수 및 활성화 상태의 변화를 결정한다. 그것은 치료 효과를 예측하고 새로운 치료 표적을 식별 할 수있는 가능성이있다. 전체 혈액 얼룩은 시료 준비 중에 발생할 수있는 유물을 최소화 조작되지 혈액을 사용합니다. 그러나, 전혈 염색은 샘플의 무결성을 보장하기 위해 신선하게 수집 한 혈액에서 수행되어야한다. 또한,이 탠덤 염료의 잠재적 불안정성을 방지하고 선명한 보라색 염료 시약 사이의 상호 작용을 방지하기 위해 같은 날 항체 칵테일을 제조하는 것이 가장 좋다. 따라서, 전체 혈액 얼룩은 내 간 실험적인 변화를 통제하기 위해주의 표준화가 필요합니다. 여기서는 antibod 제조 표준 과정으로 2 차원 (2D) 바코드 리더를 구비 한 자동화 된 액체 핸들러 배포 신고유동 세포 계측법에 대한 Y 칵테일. 항체는 데이터베이스에서 컴파일 된 96 웰 형식 및 내용에 배치 2D 바코드 튜브에 옮겼다. 액체 핸들러는 데이터베이스 내 항체 이름을 참조하여 소스 항체 튜브를 찾을 수있다. 우리의 방법은, 소스 항체 튜브의 위치 조정을 위해 지루하고 제거. 또한 사용자가 용이하게 분석 용 소프트웨어 방법에서, 스크립트 재 기입하지 않고 데이터베이스 수정 등 용도 항체, 부피, 및 대상으로 항체 분배 프로세스 상세의 번호를 변경할 수 있도록 융통성을 제공 하였다. 개념 실험의 증거 분석 세포 계측법 11 색, 17 항체 흐름의 복제 준비에 의해 입증 뛰어난 인터 및 인트라 분석 정밀도를 달성했다. 이 방법론은 분석 유동 세포 계측법에 대한 전체 처리량이 증가하고 상세한 pheno에 필요한 복잡한 항체 칵테일을 매일 준비를 촉진갓 수집 된 항 응고 말초 혈액의 typic 특성.

전혈 면역표현형은 인간의 면역 체계를 모니터링하는 데 필수적입니다. 그러나 필요한 시약의 수와 사전 혼합된 칵테일에서 특정 형광 색소의 불안정성으로 인해 매일 시약을 준비해야 합니다. 여기에서는 염색 항체 칵테일의 반자동 제제가 시약 분주의 변동성을 최소화하여 신뢰할 수 있는 면역 표현형 분석을 확립하는 데 도움이 된다는 것을 보여줍니다.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

이 반자동 염색 항체 칵테일 준비 프로토콜의 전반적인 목표는 시약 분주의 변동성을 최소화하기 위한 신뢰할 수 있는 면역 표현형 분석 방법을 확립하는 것입니다. 이 방법은 시약 분주로 인한 실험 내 및 실험 간 변동성을 제어하는 방법과 같은 면역 모니터링 분야의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칵테일 준비의 자동화로 파이펫팅 정확도가 높아지는 동시에 수동 칵테일 준비의 오류를 줄인다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Iliana Gonzalez입니다. 절차를 시작하기 전에 사람이 읽을 수 있는 라벨을 2D 바코드 튜브에 부착합니다. 다음으로, 기포가 생기지 않도록 주의하면서 각 항체 바이알의 전체 내용물을 해당 2D 바코드 튜브에 옮깁니다. 항체가 전달되면 2D 바코드 리더기를 사용하여 튜브를 판독합니다. 그런 다음, 항체 이름과 바코드가 읽은 값을 포함하는 스프레드시트를 만들고 스프레드시트를 쉼표로 구분된 값 파일로 저장합니다. 이제 2D 바코드 리더기를 실행한 다음 자동 액체 처리기를 실행합니다. 자동 액체 처리기의 주사기를 프라이밍하려면 Instrument(기기)에서 Home All Axes(모든 축 홈)를 선택합니다. 주사기에 보이는 기포가 없는지 확인합니다. 주사기가 프라이밍되면 자동 액체 처리기 소프트웨어에서 기본 칵테일과 활성화 칵테일을 만드는 방법을 엽니다. 다음으로, 만들 베이스 칵테일 및 활성화 칵테일의 수에 따라 기본 칵테일 및 활성화 칵테일을 위한 작은 튜브 랙 마이크로분리 튜브에 마이크로퓨지 튜브를 놓습니다. 기기 설정 회로도를 사용하여 튜브 랙을 데크에 배치하기 위한 참조로 사용합니다. 버퍼 저장소를 데크의 해당 섹션에 배치하고 8채널 나사 캡 디캐퍼를 사용하여 항체가 들어 있는 2D 바코드 튜브의 캡을 제거합니다. 교차 오염을 방지하려면 캡을 제거할 때 각 캡을 캡 고정 트레이에 넣어 캡을 적절한 순서로 유지하십시오. 그런 다음 P50 LLS 필터 팁, P200 LLS 필터 팁, P1000 팁 및 Matrix 1mL 튜브 랙을 데크의 적절한 위치에 놓습니다. 시작 아이콘을 클릭하여 방법을 시작합니다. 팝업 창이 나타나면 데크의 모든 항목이 Method의 기기 설정 회로도와 일치하는지 확인합니다. 모든 것이 제자리에 있으면 확인을 클릭합니다. 자동 액체 처리기는 저장소에서 마이크로분리 튜브로 버퍼를 이송합니다. Matrix 1mL 튜브 랙이 2D 바코드 리더기로 이동하고 바코드를 판독합니다. 모든 바코드를 읽었으면 팝업 창에서 확인을 클릭하여 항체 전달을 시작합니다. 전송이 완료되면 8채널 스크류 캡 디캡퍼를 사용하여 2D 바코드 튜브를 다시 캡핑하고 튜브를 4로 되돌립니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 서로 다른 항원과 결합된 형광 자기 구슬 또는 마이크로스피어를 사용하여 혈청 샘플에서 다양한 항체 동형을 동시에 검출하는 면역분석 기술에 대해 설명합니다. 이 분석은 감염 중 또는 백신 접종 후 혈청전환을 이해하는 데 도움이 됩니다.

Multianalyte Immunobead Assay: 인간 혈청 샘플에서 여러 항체 아형을 동시에 검출하기 위한 흐름 기반 면역분석 기법

이 동영상은 항체를 분비하는 B 세포(ASC)의 기능을 평가하기 위해 ELISpot 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. ASC에 의해 분비된 항체는 효소 접합 IgG 또는 IgM 항체에 의해 검출되는 막 결합 다클론 항체 단편과 상호 작용합니다. 각 웰에서 생성된 착색된 반점은 특정 항체의 동형이 존재함을 나타내며, 이는 B 세포의 분비 활동과 관련이 있습니다.

ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.

인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

배우세요 반자동화된 항체 칵테일 준비 방법으로 사람 말초 혈액의 면역표현형 분석 신뢰성을 높이세요. 자동화된 액체 처리 시스템을 활용하여 시약 분주 변이성을 최소화하고 실험 재현성을 향상시킵니다.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

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