공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

이 방법의 전반적인 목표는 가시광선 펄스에 의한 자극에 따라 세포막 전위를 제어하는 것입니다. 광변환 과정은 빛에 민감한 공액 고분자에 의해 매개됩니다. 이 방법은 살아있는 세포 활동의 광학적 제어를 위한 광유전학 및 열 자극과 같은 기존 방법에 대한 귀중한 대안을 나타내기 때문에 기술 분야에서 새로운 도구를 제공합니다.

이 기술의 주요 장점은 모든 전기 생리학자 유형과의 신속한 통합성, 잠재적으로 높은 특수 및 시간 해상도, 침입성을 줄이는 것입니다. 또한 광유전학에서 요구하는 유전자 전달을 피할 수 있습니다. 당사의 방법은 in vitro 세포 배양의 광자극에 대해 여기에 설명되어 있습니다.

그러나 생체 내 응용 분야에 대한 흥미로운 기회도 열 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Caterina Bossio와 Susana Vaquero Morata가 각각 생물학 및 물리 화학 배경을 가진 실험실의 박사 후 연구원입니다. 시작하려면 클로로벤진에서 P3HT와 PCBM을 1 대 1 상대 농도로 혼합하여 감광성 복합 중합체 용액을 준비합니다.

용액을 자기 교반기와 섭씨 60도에서 최소 4시간 동안 혼합합니다. 다음으로, 초음파 발생기에서 탈이온수, 아세톤 및 이소프로판올을 10분 연속 수조로 세척한 인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드를 청소합니다. 질소 건으로 덮개 미끄러짐을 건조시킨 다음 플라즈마 클리너로 기판을 처리하십시오.

청소가 끝나면 ITO 코팅면이 위를 향하도록 슬라이드를 스핀코터의 척에 놓습니다. 그런 다음 150마이크로리터의 P3HT PCBM 솔루션을 슬라이드에 추가하고 샘플을 스핀코팅합니다. 스핀코터가 마무리된 후 샘플을 제거하고 아세톤에 적신 클린룸 면봉을 사용하여 기판 뒷면을 청소합니다.

광활성 기질을 덮개가 있는 내열 용기에 넣고 섭씨 120도에서 2시간 동안 가열하여 살균합니다. 그런 다음 샘플을 멸균 후드로 옮기고 식히십시오. 이 시점부터 샘플의 무균 상태를 유지하십시오.

광활성 기판을 6웰 플레이트에 놓습니다. 공액 고분자 층의 소수성을 감안할 때, polydimethylsiloxane 웰을 만들어 샘플을 고정시키고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용액을 제한합니다. 그런 다음 광활성 기질을 플레이트의 웰에 놓고 각 샘플의 전체 표면을 PBS의 피브로넥틴 리터당 2밀리그램 용액 500-750마이크로리터로 덮습니다.

샘플을 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 유리 피펫을 사용하여 피브로넥틴 용액을 제거한 다음 2ml의 PBS로 기질을 한 번 세척합니다. 첫째, 총 부피 750 대 1, 웰 당 000 마이크로 리터의 완전한 성장 매체를 추가하십시오.

다음으로, 광활성 기질의 평방 센티미터당 15, 000 AGK293 셀을 각 웰에 플레이트합니다. 그런 다음 24-48시간 동안 세포를 배양합니다. 세포는 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 적절한 접착층이 증착되는 경우 광활성 기질에서 쉽게 배양될 수 있습니다.

시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포외 및 세포 내 용액을 모두 준비합니다. 용액을 0.2 미크론 필터에 통과시켜 멸균합니다. 그런 다음 세포 외 용액을 섭씨 37도의 수조에 넣어 예열합니다.

또한 1ml 주사기에 세포 내 용액을 채우고 34게이지 바늘을 장착합니다. ATP의 분해를 방지하기 위해 세포 내 용액을 얼음과 접촉시키십시오. 다음으로, 인큐베이터에서 세포 코팅된 기질을 꺼내 PDMS 웰을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 유리 피펫으로 성장 배지를 제거하고 세포 외 용액으로 샘플을 천천히 헹구어 세포 분리를 방지합니다. 각 웰에 3ml의 세포외 용액을 첨가한 다음 플레이트를 전기생리학 스테이션의 샘플 홀더로 옮깁니다. 제자리에 고정되면 테스트할 웰에 기준 전극을 설정합니다.

다음으로, 마이크로피펫 풀러를 사용하여 패치 클램프용 새 유리 마이크로피펫을 준비합니다. 피펫의 절반을 세포 내 용액으로 채웁니다. micromanipulator를 사용하여 선택한 세포막에 근접한 패치 피펫을 배치합니다.

위치를 지정하는 동안 팁에 먼지가 달라붙는 것을 방지하기 위해 피펫에 과도한 압력을 가하십시오. 피펫이 세포에서 몇 미크론 위에 있는 상태에서 패치 제어 소프트웨어에서 피펫 저항을 조절하면서 세포막 쪽으로 피펫을 내리기 시작합니다. 피펫 저항이 약 1메가옴 증가하면 과압을 제거하고 부드러운 흡입을 가하여 피펫과 세포막 사이에 기가씰을 형성합니다.

다음으로, 피펫에 음의 40밀리볼트의 음전위를 적용하여 밀봉을 안정화합니다. 피펫 커패시턴스로 인한 정전 용량 과도 현상을 패치 증폭기 및/또는 패치 제어 소프트웨어의 상대 명령으로 보상합니다. 피펫에 짧고 강렬한 흡입 충격을 가하여 멤브레인을 파괴하고 세포 세포질에 전기적으로 접근할 수 있도록 합니다.

그런 다음 패치 증폭기를 전류 클램프 모드로 설정하여 셀에 전류가 주입되지 않도록 합니다. 전류 클램프 모드에서는 세포막 전위를 추적하고 안정화될 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 일단 안정되면, 450 - 600 나노미터 범위의 빛으로 세포 아래의 광활성막을 조명하여 원하는 조명 프로토콜을 세포에 적용합니다.

멤브레인 전위에 대한 빛의 효과를 기록합니다. 약 10-20 밀리 초의 짧은 광 펄스는 셀의 일시적인 탈분극을 초래하는 반면, 수백 밀리 초 정도의 장시간 조명이 지속되면 빛이 꺼질 때까지 쌍곡선이 관찰됩니다. 광활성 기질에 의해 매개되는 세포의 광학적 자극은 광 자극의 지속 시간에 따라 세포막에 다른 영향을 미칠 수 있습니다.

여기에 표시된 것과 같은 빠른 급증 다음에는 수십 밀리초 정도의 일시적인 탈분극이 뒤따릅니다. 빛이 꺼질 때 짧은 빛 펄스의 경우 반대 동작이 관찰됩니다. 이러한 신호는 광 흡수 후 국부 가열로 인한 멤브레인 커패시턴스의 변화에 기인합니다.

장기간 조명의 경우 초기 탈분극은 세포 과분극으로 바뀝니다. 이 현상은 다시 열적 기원을 가지지만, 이 경우 온도 증가에 의해 유도된 이온 채널의 전도성 변화로 인한 막 평형 전위의 변화와 관련이 있습니다. 이 기술은 매우 유연하며 예를 들어 인독성 폴리머, 제조 공정 또는 조명 프로토콜을 변경하여 특정 실험의 특정 요구 사항에 맞게 조정할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

그러나 프로토콜을 변경하기 전에 먼저 생체 적합성, 멸균 공정에 대한 적합성, 전기 화학적 및 시간적 안정성과 같은 활성 폴리머의 중요한 특성을 확인해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 결합 폴리머와 살아있는 세포 사이의 하이브리드 인터페이스를 구현하는 방법과 세포 활동의 광학적 제어에 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 기술이 체외 연구를 위한 신경 과학의 보완 도구가 될 뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에 대한 새로운 관점을 열 것을 약속한다고 믿습니다.

그러나 프로토콜을 개선하려면 재료 과학자와 신경 과학자, 물리학자 및 의사의 강력하고 공동 노력이 필수적입니다.