Name: 공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 공액 고분자를 이용한 가시광선 자극으로 세포 막 전위를 제어하는 비침습적 광학 기법을. 이 방법은 유전자 전달 없이 높은 공간·시간 해상도로 신경과학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA 프로젝트를 통해 EU의 지원을 받았습니다. 
Telethon - 이탈리아 (GGP12033 및 GGP14022 부여), Fondazione Cariplo (보조금 ID 2013-0738).

광활성 기판 1. 준비 <ol><li> P3HT 준비 : PCBM 솔루션 : 클로로 벤젠 (1 W / W 1) 20g / L의 P3HT 농도. 60 ℃에서 적어도 4 시간 동안 자석 교반기와 용액을 혼합한다. 각각의 기판이 제조 될 때까지 용액을 150 μL의 부피를 고려한다. </li><li> 청소 ITO 코팅 유리 슬라이드 초음파기에 탈 물, 아세톤 및 이소프로판올의 연속 욕조 (R S = 10 Ω / 평방, 18 × 18 mm 2, 두께 170 μm의) (각 단계에 대한 10 분). 질소 총을 커버 슬립을 건조. 10 분 동안 100 W의 전력으로 플라즈마 클리너의 샘플을 넣습니다. </li><li> 스핀 코팅을 통해 기판에 세정 활성층의 박막을 증착. <ol><li> 다이아몬드 팁, ITO 코팅 된 기판의 동일한 측 방향 치수 현미경 유리 슬라이드 (≈ 두께 1mm)를 자른다. 핫 플레이트에서 PCBM 솔루션을하고 주위 온도로 냉각 보자 P3HT를 제거합니다. </li><li> 두 번째 설정EPS 스핀 코터 프로그램 : I) 800 rpm에서 30 초; ⅱ) 1,600 rpm에서 30 초. 스핀 코터의 척에 슬라이드를 삽입하고 그것을 해결하기 위해 진공을 시작합니다. ITO 코팅 된면이 위쪽을 향하게하여 슬라이드에 아세톤 드롭 한 후 청소 기판을 넣습니다. 과량의 아세톤을 제거하는 스핀 코터의 회전을 시작합니다. </li><li> 기판 상 PCBM 용액을 다시 스핀 코터 (1.3.2에 설명 된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여) 시작 : P3HT 150 μL 넣어. </li><li> 스핀 코터를 완료 한 후, 샘플을주의 깊게 제거하고 유리 슬라이드에서 코팅 된 기판을 분리. 아세톤에 담근 클린 룸 면봉 기판의 뒷면을 청소합니다. 주 : 사용까지 광활성 기판은 어두운 박스에서 몇 일 동안 저장 될 수있다. 오랜 기간 동안, 불활성 가스와 글러브 박스에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 세포 배양 매체 및 전기 생리학 솔루션 2. 준비 <ol><li> 전체 성장 매체 (CGM)에 대한 준비HEK-293 세포 : 둘 베코 이글의 중간 열 불 활성화되지 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의가 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 (DMEM)을 수정. 4 ℃에서 0.2 ㎛의 여과 시스템 및 저장 매체와 살균. </li><li> (135)의 NaCl, 5.4의 KCl, 5 HEPES, 10 포도당, 1.8 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2 : 초순수 (MM의 농도)의 세포 외 솔루션을 준비합니다. NaOH로 7.4으로 산도를 조정합니다. 4 ° C에서 0.2 μm의 여과 시스템 및 저장소와 솔루션을 소독. </li><li> (MM의 농도) 세포 내 초순수 용액 준비 : (12)의 KCl, 125 K 글루코 네이트를, 1의 MgCl 2, 0.1 염화칼슘 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-나 2. ATP-나 2 열 구분합니다 마지막에 추가합니다. NaOH로 7.4으로 산도를 조정합니다. -20 ℃에서 0.2 ㎛의 여과 시스템을 가진 용액, 1 mL의 분취 액 튜브 저장 살균. </li></ol> 3. 도금 HEK-293 세포활성 기판에 <ol><li> 유리 비커 알루미늄 또는 밀폐 된 배양 접시로 덮고 멸균 2 시간 동안 120 ℃의 오븐에 넣어의 광활성 기판을 놓습니다. 이후이 순간부터, 멸균 조건에서 모든 작업을 수행 할 수 있습니다. 멸균 후드에 샘플을 넣고 그들이 진정하자. </li><li> 코트 접착층과 광활성 기판 표면의 소수성을 감소 및 세포 부착을 촉진하기 위해. <ol><li> P35 페트리 접시에서 활성 기판 또는 6 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 공액 고분자 층의 소수성을 감안할 때, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 잘 샘플을 수정하고 솔루션을 제한 할 수 있습니다. <ol><li> 점성 슬러리를 얻었다 유리막 1 비율 : 10 PDMS와 촉매를 혼합한다. </li><li> 각 웰의 절반을 커버하기에 충분한 양의 분배, 멀티 웰 플레이트 (6)에 슬러리를 붓는다. </li><li> 실온에서 PDMS 중합 기다립니다. </li><li> obta에 대한 중간에 경화 된 PDMS를 잘라중합체 샘플의 동일한 크기의 사각형 모양 ining. </li><li> 적어도 30 분 동안 70 %의 에탄올 - 물 혼합물에 침지하여 PDMS 웰 멸균. </li></ol></li><li> 잘 PDMS를 사용하는 경우, 웰 세포 배양 한 후 PDMS를 제거 할 때, 전체 층의 박리를 방지하기 위해, 뾰족한 핀셋 웰의 전체 국경 광활성 층을 긁어. </li><li> 피브로넥틴 용액 (PBS에 2 ㎎ / ℓ)을 각각의 샘플의 전체 표면을 커버. PDMS 잘 (:의 15x15 mm 2 잘 명확면)을 사용하는 경우 샘플 당 500-750 μL 사이의 볼륨은 충분합니다. 잘 PDMS없이 피브로넥틴 용액을 약 2 ㎖의 샘플을 완전히 젖어 필요한; 솔루션을 추가하는 동안 기판이 부유하지 않음을주의하십시오. 적어도 1 시간 동안 37 ℃에서 샘플을 배양한다. </li><li> 유리 피펫 피브로넥틴 용액을 제거하고 PBS 용액으로 2 회 세척 하였다. </li></ol></li><li> 경기 수15,000 세포 / 완전 성장 배지에서 2 cm의 밀도 피브로넥틴 처리 된 샘플들에 HEK-293 세포를 먹었다. 사용 잘 PDMS, 그렇지 않으면 2 ~ 3 ml의 CGM의 필요, 각 샘플에 대해 CGM의 750-1,000 μL의 볼륨을 사용합니다. 24-48 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다 5 %. </li></ol> 4. 광 자극 프로토콜 및 전기 생리 측정 <ol><li> thermalize 37 ℃의 물을 욕조에 세포 외 용액을 넣어; 세포 내 솔루션을 해동 34 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 넣어와 ATP의 저하를 방지하기 위해 얼음과 접촉을 유지. </li><li> 조심스럽게 PDMS를 제거 잘 존재하는 경우, 인큐베이터에서 세포 코팅 된 기판을 가져 가라. 유리 피펫으로 성장 배지를 제거하고 세포 외 용액과 샘플을 헹군다. 세포 분리를 피하기 위해 천천히 진행. </li><li> 세포 외 solutio와 전기 생리학 단말기의 샘플 홀더에 넣어 장치n 및 기준 전극. 풀러와 패치 클램프 신선한 유리 마이크로 피펫을 준비합니다 (이상적인 저항하는 범위 2-4 MΩ이다). 세포 내 용액을 피펫의 절반을 작성하고이를 미세 조작기에 탑재합니다. </li><li> 장치에 패치를 건강한 세포를 찾습니다. 광활성 기판의 불필요한 자극을 피하기 위해, 현미경 일루미네이터 앞에 장파장 통과 필터 (예를 들어, 절단 파장 λ = 750 nm의 가시광 흡수 중합체를 사용할 수있다)를 배치하는, 이미징 IR 조명을 사용한다. </li><li> 선택된 셀을 패치 현미경 (도 1)의 형광의 여기 경로를 통해 샘플에 빛을 제공하여 광 자극에 대한 바람직한 프로토콜을 적용한다. 패치 - 클램프 프로토콜의 상세한 설명은 레퍼런스 20에서 찾을 수있다. <ol><li> 마이크로 미터 매니퓰레이터와 세포막에 근접 패치 피펫을 위치. 위치 동안 overpressur 적용순서대로 피펫에 E는 팁에 먼지 부착을 방지 할 수 있습니다. 피펫은 셀 위의 몇 미크론해야한다. </li><li> 패치 제어 소프트웨어에 피펫 저항을 제어하면서 세포막 피펫을 향해 하강 시작. 피펫 저항은 대략 1 MΩ 증가되면 피펫 및 세포막 사이에 기가 시일을 형성하기 위해, 부드러운 흡입을인가하면서, 피펫에서 과압을 제거 (즉, 측정 된 저항이 1 GΩ보다 큰 값으로 증가한다) . </li><li> 봉인을 안정화하기 위해 전위 (HEK293 -40의 잠재력을 셀 MV를 사용할 수 있습니다) 휴식 예상 세포에 가까운 피펫에 부정적인 잠재력을 적용합니다. 인해 패치 증폭기 및 / 또는 패치 제어 소프트웨어에 대하여 명령 피펫 커패시턴스 용량 과도를 보상한다. </li><li> 짧고 강렬한 흡입 펄스를인가함으로써 세포질에 전기적 접속을 허용하는 멤브레인을 깰피펫에. 세포막 전위를 추적 (세포 내로 주입없이 전류, 즉 I = 0) 전류 클램프 모드 패치 증폭기를 설정한다. 셀 가능성이 안정되어 있는지 확인하기 위해 몇 분 정도 기다립니다. </li><li> 셀에 원하는 조명 프로토콜을 적용하고, 막 전위에 대한 영향을 기록한다. 주 : 조명 현미경 구조에 따라, 하부 또는 상부로부터 하나의 샘플로 전달 될 수있다. <ol><li> 물론 활성 물질에 의해 흡수되어 여기 파장을 선택; P3HT의 경우 : PCBM 블렌드 4백50에서 6백까지 nm의 범위에서 파장이 사용될 수있다. 적합한 광 여기 밀도는 10 ~ 100 mW의 범위 / mm 2이다. 참고 : 결과 (10 ~ 20 밀리 초 이하) 빛의 짧은 펄스를 셀의 일시적인 탈분극에 장시간 조명하면서 빛이 꺼질 때까지 지속 과분극이 관찰된다 (밀리 초 이상 펄스 수백). </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

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셀의 광 자극이 주로 감광성 중합체의 선택, 열 살균 파라미터, 광 강도와 자극 시간 염려 체외 대한보고 프로토콜의 중요한 단계. P3HT : 그것은 좋은 시간과 전기 화학적 안정성을 보장하기 때문에 PCBM 박막, 여기에 선정되었다. 그러나, 하나는 모든 감광성 중합체는 조명에보다 구체적으로, (22)를 아날로그 성능을 제공 할 수 있음을 주목해야한다. 또한,이 때의 파라미터는 중합체 광전자 상당한 기능 저하로 연결되지 않는 열 살균을 선택; 그러나주의 경우 살균 법 또는 열처리 매개 변수 변경, 즉, 중합체 특성에 대한 가능한 효과를주의 깊게 평가되어야한다. 또, 공지 된 예를 들면, UV 노광이 빠르게 인해 접합 손실 비가역 중합체 표백 열화로 연결된다. 또한, 다른 어닐링온도 및 시간은, 전하 수송 특성에 부정적인 영향으로, 중합체 표면의 서로 다른 형태 적 순서로 이어질 수있다. 광 여기 프로토콜의 매개 변수는주의 깊게뿐만 아니라 평가되어야한다 : 100 mW의 /</sup...

정확한 공간 및 시간 해상도를 갖는 세포 활성을 조작 할 가능성이 신경 과학 연구 및 신경 및 정신 장애의 치료에있어서 중요한 방법을 나타낸다. (1) 전통적인 방법은 근접 또는 접촉 위치 된 전극을 이용하여 세포의 전기 자극에 기초 (생체 내 뇌 조직, 단일 셀, 셀룰러 네트워크, 뇌 조각) 다른 복잡성이 될 수있는 대상 시스템, 2. 과거 세기 동안에는, 패치 클램프, 금속 기판 전극 일체형의 사용은 생리학 및 단일 뉴런 및 신경 네트워크의 작동 메커니즘의 병태 생리의 상세한 그림을 제공했다. 그러나, 전기 자극은 중요한 제한에서 겪고있다. 첫번째 인해 쉽게 적응 될 수없는 고정 된 전극 및 그들의 형상의 물리적 치수에 일반적으로 열악한 공간 분해능에 관한 것이다생체 조직 같은 복잡한 조직 시스템. 또한, 전극 임피던스 자극 및 기록 시스템 사이의 크로스 토크 (cross-talk)의 관련 문제는 측정의 최종 신호 대 잡음비를 저하 할 수있다. (3) 한편, 자극 광의 사용은 많은 한계를 극복하는 데 도움이 될 전기 접근. 우선, 그것이 가능한 특정 세포 유형 또는 서브 셀 구획을 대상으로 만들고, 전례없는 공간 (&lt;1 ㎛) 및 시간 해상도 (&lt;1 밀리 초)를 제공한다. 그것은 관심의 조직과 물리적 접촉을 방지하고 녹화에서 자극을 disentangles 때문에 또한 그것은 매우 비 침습적이다. 또한, 광 강도와 파장 모두 정확하게 조절 될 수 있고, 따라서 다양한 자극 프로토콜을 적용 할 수있다. 3,4 그러나 동물 세포의 대부분은 광에 특정 감도를 제시하지 않는다. 광학 stimulatio을위한 몇 가지 전략N 따라서, 어느 근처 또는 셀들 내에 감광 분자 매개체를 이용하거나, 상기 셀에 가까운 외부에 배치 된 광활성 소자를 이용하는 제안되어있다. 전 카테고리가 표시 또는 적외선 (IR​​) 등을 통해 자극뿐만 아니라, 광분해 / 광 이성화 화합물 또는 감광성 고분자 액추에이터 (optogenetics)의 유전 적 표현 중 하나를 사용하는 등의 내생 적 메커니즘을 의미한다. 후자의 클래스는 무기 나노 / 마이크로 입자 또는 감광 실리콘 기판의 사용에 의해 달성 외인성 자극하기위한 기술을 포함한다. 5 역시, 이러한 모든 시스템들은 밝은 측면과 단점이있다. 특히, 가시 범위에서 세포의 내인성 흡수 약하고을 안정적이며, 반응성 산소 종의 발생을 수반하는 세포에 유해 할 수있다. 일반적으로, IR은 흡습에 의한 로컬 열 유도 가열을 위해 사용되지만, 물 흡광 계수는 따라서 성을 필요로하는 작고표준 현미경 광학을 통해 제공 할 및 생체 응용 프로그램에 대한 안전 문제를 일으킬 수 어렵다 (수십에서 W / mm 2의 수백) 룽 적외선. 한편, 광 스위칭 caging 화합물은 시간 제한 동작을 종종 인해 제한된 조직 침투를 제공하기 어렵다 UV 광을 필요로한다. 또한 그들은 조명 영역 외부 광분해에 따라 활성화 된 화합물의 확산 문제를 겪고 있습니다. 마지막으로, optogenetic 도구는 특정 세포 모집단 및 하위 구획을 대상으로 과학자를 허용하고 신속하게 신경 과학적 연구의 핵심 기술 중 하나로 부상하고있다. 그러나, 바이러스 성 벡터를 통해 외래 DNA 세그먼트를 삽입하는 것은 특히 인간 환자에 채택의 관점에서, 중요한 안전 문제를 제기한다. 이러한 이유로 5, 6, 세포 광학 조작 할 수있는 새로운 재료와 장치에 대한 연구는 매우 뜨거운 주제입니다. 최근, 새로운효율적으로 세포의 전기적 활성도 조절에 광 자극 형질 도입 할 감광 공액 폴리머의 사용에 기초한 접근법이 제안되었다. 7 그들은, 생체 적합성 부드럽고 컨 포멀하고 기계적 유연성은 조직과 친밀한 인터페이스를 할 수 있습니다, 그들은 가시 광선 영역에서 빛을 본질적으로 구분 : 폴리머 광 여기에 의한 세포 자극 (CSPP는) 기술은 전형적인 유기 반도체의 많은 주요-수 있도록 기능을 이용 시험관 내 및 생체 8-10 둘. 그 외에도, 그들은 쉽게 더 나은 프로빙과 능력을 감지, 특정 여기 수 있도록 살아있는 세포와 인터페이스에 적응하고 작용 될 수있다. (11, 12)는 또한, 그들은 조합에 이상적, 이온 수송뿐만 아니라 전자 지원 전자 광고 생물학. 흥미롭게 13,14, 이들은 외부 바이어스 F를 적용 할 필요가 없도록, 광전지 모드에서 작업 할또는 효율적인 세포 광 자극. (15) CSPP 기술의 신뢰도는 이전 차 뉴런 15,16 아스트로 17 이차 전지 라인 (18) 및 이식 된 망막 조직을 포함하여, 몇몇 시스템에서 입증되었다.이 연구에서 16 필요한 단계는 감광 바이오 폴리머를 제조하는데 시험관 시스템의 광 자극에 대한 인터페이스 (19)가 상세하게 설명된다. 역할을 전자 공여체로서 기능 연구의 경우, 지역과 일반 폴리 (3- 헥 실티 오펜)의 전형적인 유기 PV 블렌드 (RR-P3HT), 및 페닐 C61 - 뷰티 산 메틸 에스테르 (PCBM)뿐만 전자 수용체가 사용된다. 생물학적 시스템으로, 인간 배아 신장 (HEK-293) 세포를 사용한다. 전기 생리 학적 측정을 통해 세포 활동의 상대적으로 기록 photostimulation 프로토콜의 예를 제공한다. 기술 플랫폼그러나 일반적으로 유효하며, 용이하게 적절히 세포 배양 프로토콜 변경 요청 절차와 시간을 도금함으로써, 서로 다른 세포 유형 ((제대로 용액 제조 방법 및 증착 변수를 조정함으로써) 다른 공액 중합체의 용도로 확장 될 수있다 세포 파종 및 확산) 및 다른 자극 프로토콜 (빛의 파장, 자극 빈도 및 기간, 광 여기 밀도)를 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>시그마 알드리치</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO 코팅 기판</td><td>나노-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>클로로벤젠</td><td>시그마 알드리치</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>나노-C</td><td>나노-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>아세톤&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>시그마 알드리치</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK 세포</td><td>LGC 표준 srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 알드리치</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC 표준 srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E8008-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>LGC 표준 srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

유기 반도체와 생체 조직 간의 하이브리드 인터페이스는 in-vitro 및 in-vivo 응용 프로그램을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 특히, 공액 고분자는 우수한 생체 적합성, 우수한 기계적 특성, 저렴하고 쉬운 가공 기술, 가볍고 얇고 유연한 기판에 증착 가능성과 같은 생물학적 시스템의 기판으로서 몇 가지 최적의 특성을 나타냅니다. 이러한 재료는 신경 프로브, 신경 활동의 여기 및 기록을 위한 트랜지스터, 약물 방출을 위한 바이오센서 및 액추에이터와 같은 세포 인터페이스에 사용되었습니다. 최근의 실험은 또한 세포의 전기적 활동의 전광학적 변조를 위해 공액 폴리머를 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 1차 신경 세포, 성상 세포 및 2차 라인 세포를 포함한 여러 체외 연구 사례가 보고되었습니다. 또한, 유기 고분자에 의해 매개되는 신호 광전달은 퇴화된 망막에서 광 민감도를 회복시키는 것으로 나타났으며, 이는 이러한 장치가 향후 인공 망막 보철물에 사용될 수 있음을 시사합니다. 대체로 빛에 민감한 복합 고분자는 세포 활동의 광학 변조를 위한 새로운 접근 방식을 나타냅니다.
이 작업에서는 살아있는 세포의 광 여기를 위한 생체 고분자 계면을 제작하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 활성 계면의 기능은 빛 자극을 세포막 전위의 조절로 변환하는 것입니다. 체외 연구에 유용한 연구 사례로, 폴리티오펜 박막을 기능성 흡수층으로 사용하고, 인간 배아 신장(HEK-293) 세포를 계면의 생물학적 구성 요소로 사용합니다. 서로 다른 지속 시간의 광 펄스로 자극할 때 세포막 전위를 성공적으로 제어하는 실제 사례가 제공됩니다. 특히, 세포막에 대한 탈분극 및 과분극 효과는 모두 광 자극의 지속 시간에 따라 달성될 수 있음을 보여줍니다. 보고된 프로토콜은 일반적으로 유효하며 다른 생물학적 제제로 간단하게 확장될 수 있습니다.

세포는 P3HT에 쉽게 배양 할 수 있습니다 : PCBM 기판 (설명 프로토콜의 단계 3.2에서 사용되는 피브로넥틴 같은) 적절한 접착 층이 증착되는 것을 제공했다. P3HT : 가시 스펙트럼의 녹색 부분 PCBM 광 흡수 피크; 그러나 다른 감광 공액 중합체는 바람직한 photostimulation 파장 범위 (도 2)에 따라, 선택 될 수있다. . PCBM 막이 도시되어 이들 기판의 생체 적합성은 단지 세포주 뉴런 (15) 및 성상 세포의 일차 배양 물과 같은 HEK-293과 같은 18,21하지만 17 P3HT 배양 건강 HEK-293 세포의 전형적인 현미경으로 입증되었다 도 3. 광활성 기판에 의해 매개되는 세포의 광 자극은 빛 자극 지속 기간에 따라 세포막에 다른 효과가 발생할 수있다. (18)를 광 펄스의 개시시에,(3 M...

유기 반도체 폴리머의 사용을 기반으로 가시광선으로 체외 세포 배양 전기 활성을 자극하는 방법이 설명됩니다.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

이 방법의 전반적인 목표는 가시광선 펄스 자극을 통해 세포막 전위를 제어하는 것입니다. 광전환 과정은 빛에 민감한 공액 폴리머에 의해 매개됩니다. 이 방법은 살아있는 세포의 활성을 광학적으로 제어하기 위한 광유전학 및 열 자극과 같은 기존 방법의 가치 있는 대안이 된다는 점에서 기술 분야에 새로운 도구를 제공합니다.이 기술의 주요 장점은 모든 유형의 전기생리학적 장치와 신속하게 통합할 수 있다는 점, 잠재적으로 높은 공간 및 시간 분해능을 가진다는 점, 그리고 침습성을 줄일 수 있다는 점입니다. 또한, 광유전학에서 필수적인 유전자 전달 과정을 생략할 수 있습니다. 본 논문에서는 인비트로(in vitro) 세포 배양의 광자극을 위한 당사의 방법을 설명합니다.하지만 이는 인 비보(in vivo) 응용을 위한 흥미로운 기회를 제공할 수도 있습니다. 실험 절차 시연은 각각 생물학 및 물리화학 배경을 가진 저희 연구실의 포스트닥터인 Caterina Bossio와 Susana Vaquero Morata가 진행하겠습니다. 우선, P3HT와 PCBM을 클로로벤젠에 1:1 상대 농도로 혼합하여 광민감성 공액 고분자 용액을 준비하십시오.자성 교반기를 사용하여 60 °C에서 최소 4시간 동안 용액을 혼합합니다. 다음으로, 초음파 세척기 내에서 탈이온수, 아세톤, 이소프로판올 순으로 각각 10분씩 침지하여 인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리 슬라이드를 세척합니다. 질소 건으로 커버슬립을 건조한 후, 플라즈마 세척기로 기판을 처리합니다.세척이 완료되면 슬라이드를 스핀코터 척 위에 ITO 코팅면이 위로 향하게 놓습니다. 다음으로, P3HT PCBM 용액 150 µL를 슬라이드에 떨어뜨리고 샘플을 스핀코팅합니다. 스핀코팅이 끝나면 샘플을 꺼내고, 아세톤에 적신 클린룸 스왑을 사용하여 기판 뒷면을 세척합니다.광활성 기질을 덮개가 있는 내열 용기에 넣고 120 °C에서 2시간 동안 가열하여 멸균합니다. 그런 다음 샘플을 멸균 후드로 옮겨 냉각시킵니다. 이 시점부터 샘플의 멸균 상태를 유지하십시오.광활성 기판을 6-웰 플레이트에 넣습니다. 접합 고분자 층의 소수성을 고려하여, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 고정하고 용액을 가두기 위해 폴리디메틸실록산 웰을 만듭니다. 그런 다음, 광활성 기판을 플레이트의 웰에 넣고, 각 샘플의 전체 표면을 PBS에 녹인 2 mg/L 피브로넥틴 용액 500 내지 750 µL로 덮습니다.샘플을 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 유리 피펫을 사용하여 피브로넥틴 용액을 제거하고, 2mL의 PBS로 기질을 한 번 세척합니다. 먼저, 웰당 750~1,000µL의 완전 성장 배지를 총 부피로 첨가합니다.다음으로, 각 웰의 광활성 기질 제곱센티미터당 15,000개의 AGK293 세포를 도말합니다. 그 후, 세포를 24~48시간 동안 배양합니다. 피브로넥틴과 같은 적절한 접착층이 증착되어 있다면 광활성 기질 위에서 세포를 쉽게 배양할 수 있습니다.먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포외액과 세포내액을 모두 준비합니다. 0.2 micron 필터로 여과하여 용액을 멸균합니다. 그런 다음, 세포외액을 37 °C의 항온 수조에 넣어 예열합니다.또한, 1 mL 주사기에 세포 내 용액을 채우고 34게이지 바늘을 장착합니다. ATP의 분해를 방지하기 위해 세포 내 용액을 얼음에 닿게 유지하십시오. 다음으로, 인큐베이터에서 세포가 코팅된 기판을 꺼내고 PDMS 웰을 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 유리 피펫으로 배양액을 제거하고, 세포가 떨어지지 않도록 세포외액으로 샘플을 천천히 헹굽니다. 각 웰에 3 mL의 세포외액을 추가한 후, 플레이트를 전기생리학 장치의 샘플 홀더로 옮깁니다. 위치가 잡히면 테스트할 웰에 기준 전극을 설치합니다.다음으로, 마이크로피펫 풀러(micropipette puller)를 사용하여 패치 클램프용 새 유리 마이크로피펫을 준비합니다. 피펫의 절반을 세포 내액으로 채웁니다. 마이크로매니퓰레이터(micromanipulator)를 사용하여 패치 피펫을 선택한 세포막에 가깝게 위치시킵니다.포지셔닝 중에 피펫 팁에 이물질이 붙는 것을 방지하기 위해 피펫에 과압을 가합니다. 피펫이 세포 위로 몇 마이크론 거리에 위치했을 때, 패치 컨트롤 소프트웨어에서 피펫 저항을 확인하며 피펫을 세포막 쪽으로 내리기 시작합니다. 피펫 저항이 약 1 megaohm 정도 증가하면 과압을 제거하고 가벼운 흡입력을 가하여 피펫과 세포막 사이에 기가실(gigaseal)을 형성합니다.다음으로, 씰(seal)을 안정화하기 위해 피펫에 -40 mV의 부전위(negative potential)를 인가합니다. 패치 앰플리파이어 및/또는 패치 제어 소프트웨어의 상대 명령어를 사용하여 피펫 커패시턴스로 인한 정전 용량성 과도 현상(capacitive transience)을 보정합니다. 피펫에 짧고 강한 흡입 펄스를 가하여 세포막을 파괴하고 세포질에 전기적으로 접근할 수 있도록 합니다.그 다음, 세포에 전류가 주입되지 않도록 패치 앰플리파이어를 전류 클램프 모드로 설정하십시오. 전류 클램프 모드에서 세포막 전위를 추적하고, 전위가 안정될 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 안정화되면 세포 아래의 광활성 막에 450에서 600 nanometers 범위의 빛을 조사하여 원하는 조명 프로토콜을 세포에 적용하십시오.빛이 막 전위에 미치는 영향을 기록하십시오. 10에서 20밀리초 정도의 짧은 빛 펄스는 세포의 일시적인 탈분극을 유도하는 반면, 수백 밀리초 수준의 지속적인 조명을 조사하면 빛이 꺼질 때까지 지속적인 과분극이 관찰됩니다. 광활성 기질에 의해 매개되는 세포의 광자극은 빛 자극의 지속 시간에 따라 세포막에 서로 다른 영향을 미칠 수 있습니다.여기에 표시된 것과 같은 빠른 스파이크 이후에는 수십 밀리초 정도의 일시적인 탈분극이 뒤따릅니다. 빛을 껐을 때와 같은 짧은 광 펄스의 경우, 이와 반대되는 거동이 관찰됩니다. 이러한 신호들은 빛 흡수 이후의 국소적 가열로 인한 막 정전용량의 변화에 기인하는 것으로 보고되었습니다.장시간 조사를 하면, 초기 탈분극은 세포 과분극으로 전환됩니다. 이 현상 또한 열적 기원에 의한 것이지만, 이 경우에는 온도 상승으로 인해 유도된 이온 채널 전도도의 변화로 인한 막 평형 전위의 변동과 관련이 있습니다. 이 기술은 상당히 유연하며, 예를 들어 광독성 폴리머, 제작 공정 또는 조사 프로토콜을 변경함으로써 특정 실험의 특수한 요구 사항에 맞게 조정될 수 있다는 점이 중요합니다.하지만 프로토콜을 변경하기 전에, 생체 적합성, 멸균 공정 적합성, 전기화학적 및 시간적 안정성과 같은 활성 폴리머의 중요한 특성들을 먼저 검증해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 전도성 폴리머와 살아있는 세포 사이의 하이브리드 인터페이스를 구현하는 방법과 이를 이용해 세포 활동을 광학적으로 제어하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 기술이 신경과학 분야의 in vitro 연구를 위한 보완적인 도구가 될 뿐만 아니라, in vivo 응용 분야에서도 새로운 관점을 제시할 것으로 기대합니다.하지만 프로토콜을 개선하기 위해서는 재료 과학자, 신경 과학자, 물리학자 및 의사들의 강력하고 공동적인 노력이 필수적입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 금 나노막대의 광학 흡수와 관련된 일시적인 가열을 사용하여 신경 세포의 분화 및 세포 내 칼슘 활성을 자극하는 방법을 설명합니다. 이러한 결과는 잠재적으로 신경 보철물 및 신경 과학의 기초 연구에 대한 새로운 응용 분야를 열 수 있습니다.

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

여기에서는 배양 또는 생체 내에서 뉴런에서 발현되는 표적 뉴런 단백질에 광반응성 비천연 아미노산을 유전적으로 암호화하여 짧은 광 펄스로 뉴런 단백질을 선택적으로 활성화하는 절차를 제시합니다.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

광전자에서 형성 하는 젤의 분석을 위한 프로토콜 활용 된 폴리머 poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) 작은 사용 하 고 매우 작은 각 중성자 산란 존재 및 조명의 부재에 선물 된다.

중성자 산란을 사용 하 여 활용 된 중합체 젤의 구조에 조명 효과 모니터링

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

여기에서는 광 전달을위한 광섬유와 신경 기록을위한 전극 어레이가있는 옵트로드 시스템의 제조 방법을 제시합니다. 채널로돕신-2를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용한 생체내 실험은 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록을 동시에 위한 시스템의 실현가능성을 보여준다.

동시 광유전학적 변조 및 전기 신경 기록을 위한 광섬유 어레이

이 프로토콜은 cAMP 센서와 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 transfection하여 세포 분포와 광 자극에 대한 반응을 정확하게 추적합니다. 포인트 스캐닝 시스템을 사용하여 cAMP 응답 맵을 만드는 혁신적인 접근 방식은 다양한 분야에서 광유전 단백질에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑

이 프로토콜은 단백질 활성의 가역적 시공간 제어를 위해 엔지니어링된 청색광 활성화 알로스테릭 스위치(LightR) 도메인의 적용을 설명합니다. 이 연구는 Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 광 조절 Src(LightR-Src)를 개발하고 특성화하기 위한 정교한 프로토콜을 제공합니다. 이는 효소 종류 전반에 걸쳐 이 접근법의 다양성을 보여줍니다.

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

배우세요 공액 고분자를 이용한 가시광선 자극으로 세포 막 전위를 제어하는 비침습적 광학 기법을. 이 방법은 유전자 전달 없이 높은 공간·시간 해상도로 신경과학 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

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