SPRI, 나노 SPRI 및 ELISA 분석 실험을 사용하여 혈청에있는 인간 성장 호르몬의 비교 분석

본 연구의 전반적인 목표는 혈청 내 바이오마커 검출에서 직접 및 증폭 표면 플라즈몬 공명 이미징(SPRi 분석)의 진단 가능성을 평가하고, 이를 시중에서 판매되는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 키트와 직접 비교하는 것입니다. 이 방법은 질병의 조기 단계 포착 및 치료 효능 모니터링 수단 제공과 같이 생의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. SPRi의 주요 장점은 센서 표면 인접 영역의 굴절률 변화를 기록함으로써 바이오분자 상호작용을 표지 없이 실시간으로 모니터링하고 시각화할 수 있다는 점입니다.

내인성 hGH는 인간의 성장과 발달에 영향을 미치는 수많은 의학적 질환과 연관되어 있으므로, 이 기술의 활용 가능성은 혈청 내 hGH 수치의 진단으로까지 확장됩니다. 바이오칩 표면 화학 처리 준비 단계는 습득하기 어렵고 작은 실수만으로도 결과에 막대한 영향을 미칠 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용액과 단백질 샘플을 준비한 후, 50 °C에서 90분 동안 초음파 세척기를 사용하여 120 milliliters의 안정화된 piranha solution으로 금 칩을 세척하십시오.

물을 사용하여 칩을 헹구고, 물 속에서 5분 동안 초음파 세척합니다. 그런 다음 에탄올로 칩을 헹구고 질소 기류를 이용하여 건조시킵니다. 오염 물질을 제거하기 위해 금 칩을 UV 오존 챔버에 30분 동안 둡니다.

다음으로, 칩을 고정할 수 있는 플라스틱 캡과 용액을 균일하게 섞기 위한 스터바가 들어 있는 시험관에 20 milliliters의 에탄올과 11-mercaptoundecanoic acid 150 milligrams를 넣습니다. 칩을 시험관에 넣고 캡을 닫습니다. 그런 다음 시험관을 50 watts, 50 degrees Celsius에서 5분 동안 마이크로웨이브로 가열합니다.

에탄올로 칩을 헹구고, 에탄올에 5분 동안 담가 둡니다. 물을 사용하여 헹굼 과정을 반복하고 5분 동안 담가 둡니다. 교반 바가 들어 있는 시험관 내의 물 20 milliliters에 1-Ethyl-3-carbodiimide 150 milligrams를 첨가합니다.

칩을 시험관으로 옮긴 다음, 방금 시연한 것과 같이 전자레인지로 가열합니다. 물을 사용하여 칩을 헹구고, 물에 5분 동안 담가 둡니다. 그런 다음 교반 바가 들어 있는 시험관에 20 milliliters의 물과 150 milligrams의 N-Hydroxysuccinimide를 첨가합니다.

칩을 시험관에 넣고 캡으로 밀봉한 후 전자레인지로 가열합니다. 이전과 동일하게 칩을 헹구고 물에 담가둔 후, 교반자가 들어 있는 시험관에 20 mL의 물에 녹인 250 µM polyethylene glycol을 첨가합니다. 칩을 넣고 전자레인지로 가열한 다음, 이전과 같이 물로 헹구고 담가둡니다.

15 µg/mL 농도의 anti-rhGH 항체 용액과 음성 대조군으로 사용할 anti-IgG를 준비하고, 384-웰 플레이트의 각각 다른 웰에 10 µL씩 분주합니다. 마이크로어레이어에서 스포팅 패턴을 설계하고, 500 µm 테플론 팁 핀을 사용하여 칩에 항체를 스포팅합니다. 스포팅된 칩을 실온, 습도 75% 조건에서 2시간 동안 배양합니다.

SPRi 실험 설정을 완료하고 텍스트 프로토콜에 따라 칩을 블로킹한 후, 10% serum과 1 mg/mL BSA가 포함된 PBS에서 다음과 같은 농도 범위의 rhGH 용액을 준비합니다. 이 단계에서 선택한 블로킹 분자의 종류를 강조하는 것이 중요합니다. 이는 비특이적 상호작용을 최소화하는 것이 목적이기 때문입니다.

0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 1 µM streptavidin 코팅 근적외선 양자점 3 µL와 6 µM biotin 표지 anti-rhGH 검출 항체 1 µL를 첨가하여 2:1 용액을 준비합니다. hGH가 첨가된 인간 혈청 용액 150 µL를 주입 루프에 주입합니다. 신호가 급격히 증가한 후, 표면에서 비특이적으로 결합된 혈청이 씻겨 나가면서 신호가 서서히 감소합니다.

신호가 안정되면 러닝 버퍼에 추가한 450 millimolar 염화나트륨 용액을 사용하여 표면을 세척하십시오. anti-rhGH 검출 항체와 퀀텀닷 용액을 러닝 버퍼로 10 nanomolar 농도로 희석하여 플로우 셀에 주입하십시오. 데이터를 데이터 분석 프로그램으로 가져오십시오.

그 다음 SPRi 신호를 시간에 따라 도식화하고, 고염 세척 후 항-rhGH 및 음성 대조군 항체 스팟 간의 차이를 결정합니다. ELISA를 수행하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 시약, 항체 코팅 웰 및 표준물을 준비한 후, 다음 농도의 10% 인간 혈청 내 rhGH 호르몬 샘플을 준비합니다. 각 표준물, 대조군 및 샘플을 50 µL씩 각 웰에 3회 반복하여 첨가합니다.

그런 다음 웰을 밀봉하고, 4°C에서 부드럽게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트를 쉐이커에서 꺼내 실온과 동일한 온도가 되도록 둡니다. anti-rhGH HRP, 접합 완충액, 세척 완충액, 발색제인 tetramethylbenzidine(TMB) 및 정지 시약을 실온으로 가온합니다.

작업 시약을 준비하려면, 접합 버퍼를 사용하여 anti-rhGH HRP를 40배 희석하십시오. 증류수를 사용하여 세척 버퍼를 200배 희석하십시오. 각 웰에 anti-rhGH HRP 접합물 50 µL를 첨가하십시오.

웰을 밀봉하고, 가볍게 흔들어주며 상온에서 30분 동안 배양합니다. 웰에서 용액을 따라내고, 플레이트를 뒤집어 흡수성 티슈 위에서 가볍게 두드려 건조합니다. 각 웰에 세척 버퍼 200 µL를 넣은 후, 다시 용액을 따라내고 가볍게 두드려 건조합니다.

세척 과정을 3회 반복합니다. 피펫에만 의존하는 것은 효과적이지 않으므로, 보조제를 제거하기 위해 96-웰 플레이트를 가볍게 두드려 주는 것이 중요합니다. 다음으로, 세척 단계 후 15분 이내에 각 웰에 100 µL의 발색제를 첨가합니다.

부드럽게 흔들어주며 상온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 무색의 용액이 파란색으로 변합니다. 각 웰에 정지 용액 100 µL를 첨가합니다.

용액의 색이 청색에서 황색으로 변합니다. 플레이트 리더를 사용하여 450 nanometers에서 각 웰의 흡광도를 즉시 측정하십시오. 마지막으로, 제공된 표준 물질에 대한 표준 곡선을 작성한 다음, 10% serum 샘플 내 rhGH의 광학 밀도를 각 샘플의 농도에 대해 도식화하십시오.

이 영상에서는 rhGH 검출을 위해 SPRi 및 nano-SPRi의 성능을 ELISA와 비교하였습니다. 이 그래프는 10% 인간 혈청에 rhGH를 첨가했을 때의 적정 곡선을 나타내며, 450 nanometers에서 측정된 OD 값에 따라 도식화되었습니다. 우수한 선형 응답이 관찰되었으며, 검출 한계는 1 nanogram per milliliter로 결정되었습니다.

본 실험에서는 SPRi를 이용하여 rhGH의 검출 능력을 평가하였습니다. 농도 구배 곡선의 각 지점은 각 농도별 세 개의 SPRi 동역학 곡선으로부터 계산된 반사율 차이의 평균값을 나타냅니다. 검출 한계(LoD)는 3.61 nanograms per milliliter로 결정되었습니다.

SPRi 바이오센서의 민감도를 높이기 위해 나노 강화제(nano-enhancers)를 센서에 순차적으로 도입하였습니다. 본 실험에서 나노 강화제는 바이오센서 응답을 최대 7.9%까지 증폭시켰으나, 대조군에서의 신호 변화는 최소한으로 나타났습니다. 나노-SPRi 바이오센서의 실용성은 30,000에서 0.25 pg/mL 범위의 rhGH를 측정하여 평가하였습니다.

검출 한계(LoD)는 9.2 picograms per milliliter로 계산되었으며, 변동 계수는 20%였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 직접 검출은 1시간, nano-SPRi는 2시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 각 단계의 조건을 최적화하는 것이 중요하며, 최적화 후에는 더 짧은 시간 내에 결과를 쉽게 재현할 수 있습니다. 이 절차에 이어, 캡처된 분자에 대한 추가적인 인사이트를 얻기 위해 SPRi 실험 후 칩에서 multi-tuff, maspeck 분석과 같은 다른 방법들을 직접 수행할 수 있습니다.

이 기술이 개발되면 의료 진단 분야의 연구자들이 암, 신경계 및 심혈관 질환과 관련된 여러 바이오마커를 동시에 검출하는 방법을 탐색하는 길을 열어줄 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 혈청 내 hGH 수치 검출을 위한 SPRi, nano-SPRi 및 ELISA 분석법을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 시약 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 장갑과 보호 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.