Name: COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 학습하세요 COSMIC 방법을 통해 DNA 표적 소분자의 게놈 전체 결합 프로파일을 측정하는 기술을. 이 방법은 약물-DNA 상호작용을 직접 측정하여 작용 기전을 이해하고 새로운 치료제 설계에 활용할 수 있습니다.

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도움이 되는 토론을 해주신 Ansari 연구실 구성원들과 Parameswaran Ramanathan 교수님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 CA133508 및 HL099773, H. I. Romnes 교수 펠로우십, A.Z.A. G.S.E.에 대한 WM Keck Medical Research Award의 지원을 받았으며 생화학 및 분자 생명과학 교육 보조금 NIH T32 GM07215의 Peterson Fellowship의 지원을 받았습니다. A.E.는 Morgridge Graduate Fellowship과 Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship의 지원을 받았으며, D.B.는 NSF의 NSEC 보조금의 지원을 받았습니다.

라이브 세포 1. 가교 <ol><li> ~에 웰당 2.5 7 H1 세포, 또는 다른 배양 세포로 시작합니다. 참고 : H1 셀이 숫자는 5 ~ 10 cm의 요리 (약 40 % 컨 플루)에 해당합니다. </li><li> 다 능성 줄기 세포를지지하는 표면 상에 코팅 접시에 E8 배지에서 세포를 성장 (자재 목록 참조), 및 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 그들을 부화. 수확 세포는 효소 (자료 목록 참조). 참고 : H1 세포가 90 % 컨 플루를 초과 할 수 없음; 포화 상태는 H1 세포의 자연 분화를 유도한다. 세포를 계산하려면, 셀의 추가 10-CM 접시 성장 효소 등의 섹션 1.8-1.10에 설명 된 세포를 들어 올린 혈구 그들을 계산합니다. <ol><li> Chen 등의 알에 설명 된대로 E8 문화 매체를 준비합니다. (54) </li></ol></li><li> 폴리 아미드를 추가하기 전에, 진공 트랩에 부착 된 파스퇴르 피펫으로 소비 문화의 용지를 제거합니다. 같은 신선한 매체를 추가erological 피펫과 피펫 디스펜서 (10-CM 접시 당 8 ㎖). 주 : 세포를 파괴 방지하기 위해 접시의 측에 용지를 추가한다. 이 시점에서의 조기 전방 광 - 교차하지 않도록 광으로부터 세포를 보호한다. </li><li> 직접 각 요리의 문화 미디어에 피펫 (DMSO 400 μm의 폴리 아미드의 8 μL, 400 nm의 최종 농도)와 폴리 아미드를 추가합니다. 미디어에 고르게 폴리 아미드를 분산 할 수있는 요리를 소용돌이. 주 : 농도는 변할 수 있지만 세포 독성 선택된 처리에 대해 관찰되지 않았 음을 보장 할 수있다. </li><li> 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포를 24 시간 37 ℃로 배양 한, 그들은 빛으로부터 보호되도록. 참고 : 배양 시간은 시간에 걸쳐 폴리 아미드 결합을 측정하기 위해 변화 될 수있다. </li><li> 4 ml의 PBS (1.05 mM의 인산 칼륨 일 염기성, 155.17 mM 염화나트륨, 2.97 mM의 인산 나트륨) 혈청 피펫 및 피펫 DIS를 이용하여 각각 10 cm 접시 씻어penser. 대기음 PBS 및 3 ㎖ E8 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 빛이 희미으로, 5 배양 접시의 뚜껑을 제거하고 후드의 외부 평평한 표면에 세포를 배치합니다. λ &lt;300 nm의 빛을 걸러 5 배양 접시 위에 유리 필터를 놓습니다. 필터의 상단에 UV 소스를 넣습니다. 가교 샘플을 365 nm의 자외선을 조사 (2.4 mW의 / cm 2)와 함께 30 분. 참고 : 시간을 가교는 경험적으로 결정되어야한다. </li><li> 다시 후드에 문화 요리를 전송합니다. 진공 트랩에 부착 된 파스퇴르 피펫으로 미디어를 대기음. 4 ml의 PBS로 각 10-CM 접시를 씻으십시오. PBS를 대기음. 세포를 떼어 놓다 10-CM 접시 당 세포 분리에 대한 3 ㎖ 효소 (자료 목록 참조)를 추가합니다. 37 ℃에서 5 분을 품어. 참고 :하지 마십시오 효소를 미리 따뜻하게. </li><li> 접시 당 3 ㎖ E8 매체와 효소를 끄다. 전송 한 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 분해. 참고 : 이후이 지점에서 얼음에 장소 세포. </li><li> 원심 펌프fuge 세포 5 분, 4 ° C에서 500 XG 해리. 기음 뜨는 효소와 미디어를 제거합니다. 참고 : 포인트를 일시 중지합니다. 세포는 나중에 후속 처리를 위해 -80 ℃에서 보관, 플래시 냉동 액체 질소 일 수있다. </li></ol> 염색질 2. 분리 <ol><li> 1.2 ml의 COSMIC 버퍼를 추가 (20 mM 트리스 - 염산 [pH가 8.1, 2 mM의 EDTA, 150 mM의 NaCl을, 1 % 트리톤 - X100, 0.1 % SDS)와 위아래로 피펫 여러 번 각 샘플에 대한 세포 펠렛을 재현 탁하기 1.2 ml의 COSMIC 버퍼. <ol><li> PMSF 및 펩 스타틴 벤즈 아미 딘 및 1.5 μM 1 mM의 최종 농도로 신선한 133 μL 100mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)의 각각 100 mM의 벤즈 아미 딘, 및 프로테아제 억제제 μM 펩 스타틴 (150)를 추가한다. 두 개의 황색 1.7 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 용 해물의 분할 솔루션입니다. </li></ol></li><li> 초음파기 35 분 (10 초, 10 초 끄기, 60 % 전력)와 초음파 처리 (100)를 사이에 게놈 단편ND 500 bp의. <ol><li> 저장조 내의 물 레벨 microcentrifuge 관 평행 염색질 용액의 레벨을 유지한다. 육안 검사로이 수준을 확인합니다. 참고 :. DNA를 1.5 % 아가 로스 젤 전단되었는지 확인 (55) </li><li> 경험적으로 초음파 시간을 최적화 할 수 있습니다. 샘플을 진정 저수지에 얼음의 최소 금액을 사용하고 얼음 샘플 및 컵 뿔 사이에 방해되지 않도록. </li></ol></li><li> 원심 분리기 샘플 12,000 XG 10 분. 피펫 새로운 황색 microcentrifuge 관에 전송하여 가용성 염색질이 들어있는 수용액을 저장합니다. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 시료 110 μL (10 %)을 전송하고 그것을 입력 DNA 레이블을 붙입니다. -80 ° C에서 보관하십시오. 단계 3.3에서 사용하기 위해 얼음에 염색질 샘플의 나머지 부분을 저장합니다. </li></ol> 리간드-DNA 가교 3. 캡처 <ol><li> 60 μL의 streptavi을 분배하는 피펫을 사용하여microcentrifuge 관에 자석 구슬을 DIN-코팅. 1 ml의에게 COSMIC 버퍼를 추가하고 실온에서 nutator 5 분에 섞는다. 자기 분리에 자석 구슬 구슬을 캡처하는 2 분 랙 놓습니다. 피펫 COSMIC 버퍼를 제거합니다. 참고 : 구슬이 건조하는 것을 허용하지 마십시오. 다음 단계로 바로 진행합니다. </li><li> 염색질 샘플을 추가 (1 ~ ㎖) 구슬 (60 μL)와 구슬을 재현 탁. 4 ° C에서 회전, 흔들 믹서에 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬 적어도 4 시간과 염색질을 품어. 원하는 경우 샘플 O / N을 품어. </li></ol> 선호도 정제 DNA 4. 분리 <ol><li> 비특이적 상호 작용을 제거하려면 다음 세척 버퍼로 실온에서 7 분 간격으로 구슬을 씻으십시오. 각 세척 후 구슬을 캡처하는 자기 분리 랙을 사용합니다. 세척 버퍼의 각 변경 후 구슬을 재현 탁. </li><li> 사용하기 전에 증류수 탈 이온수 및 필터 (0.2 μm의)에서 세척 버퍼를 준비합니다. 초 동안 4 ℃에서 보관 세척 버퍼 1, 2everal 개월. 매일 세척 버퍼 3 신선한를 준비합니다. 추가 피펫 샘플에서 세척 버퍼를 제거합니다. 2, 4, 세척에서 각각 1 및 3 (5 mm)를 추가한다. 샘플은 추가로 (한 번 12 시간, 4 시간 한 번) 이전에 아래의 세척에 COSMIC 버퍼 회 세척 할 수있다. <ol><li> 워시 버퍼 1 (10 mM 트리스 - CL [pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, 3 % SDS) 한 번 씻으십시오. 세척 완충제 2 (10 mM 트리스 - CL [pH를 8.0], 250 mM의의 LiCl, 1 mM의 EDTA, 0.5 % NP40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트)로 한번 세척 하였다. 세척 완충제 3 회 씻어 (4 M 우레아, 10 mM 트리스 - CL [pH를 7.5, 1 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40). 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스 - CL [pH가 8.0, 1 mM의 EDTA)로 두 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> 피펫 200 ㎕의 TE 버퍼에 재현 탁 비즈. 캡처 DNA의 샘플은 친 화성 정제 된 (AP) DNA 라 칭한다. </li><li> 10 배 크로스 링크 반전 버퍼 (100 mM 트리스 - CL [pH가 8.0, 1 M KOH, 4 mm의 입력 및 AP DNA를 보충EDTA)의 최종 농도를 1 배로. 56,57 인큐베이션을 30 분간 90 ° C에서. 주 : 254 nm의 자외선 조사는 랄렌의 가교, 58하지만 뷰틸 피리 미딘 이량이 파장에서 조사로부터 형성 될 수 리버스 DNA의 하류 처리를 방해 할 수있다. </li><li> AP DNA를 들어, 자기 분리에 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관은 피펫 2 실온에서 분 및 분리 액체 (DNA)를 랙에 배치합니다. 새로운 황색 microcentrifuge 관에 AP DNA를 (구슬에서 방출 된) 전송합니다. 주의 : 원하는 AP DNA가 액체 내에 더 이상 비드에 부착된다. </li><li> 피펫 100 μL 시료 당 약 1 μL 6 N 염산을 첨가하여 pH 7로 농축 된 염산으로 입력 및 AP DNA를 중화. . 샘플 피펫 WARNING으로 pH 종이 위에 ~ 0.5 μl를 첨가하여 중화 확인 : 진한 HCl은 강한 부식성 산이다. 교육 기관에 따라 처리(217), 적절한 개인 보호 장비의 가이드 라인. </li><li> 0.2 μg의에의 RNase (100 mg / mL)이 추가 / 입력 및 AP DNA 모두 최종 농도 μL. 37 ℃에서 1 시간을 품어. 0.2 μg의에 테 K (20 ㎎ / ㎖)를 추가 / 입력 및 AP DNA 모두 최종 농도 μL, 추가 할 수 있습니다. 55 ° C에서 1 시간을 품어. </li><li> DNA 열 정리 키트와 함께 DNA (자료 목록 참조) 정화. 55 용출 DNA를 58 μL DNA 학년 H 2 O에 -20 또는 -80 ° C에서 보관 입력 및 AP 샘플 </li><li> 궤적 특이 적 프라이머, 및 / 또는 차세대 시퀀싱에 의해 정량적으로 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) AP에 의해 DNA를 분석한다. 95 ° C 10 분의 1주기와 95 ° C 20 초 40주기, 54 ° C 또는 56 ° C 20 초, 72 ℃에서 40 초 : qPCR에 들어, 다음과 같은 매개 변수와 현장 당 2 μL AP DNA를 사용합니다. 주 : 어닐링 온도가 사용될 프라이머 쌍의 용융 온도에 따라 수정되어야한다. 어닐링 temperatu를 선택그 재없이 비특이적 증폭과 정량주기를 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 차세대 염기 서열 분석을 위해, 읽기 매핑 최소 10 만 달러 목표로하고 있습니다. 맵핑의 수는 AP의 DNA의 양을 증가시킴으로써 및 시퀀싱으로 실행 적은 샘플을 조합함으로써 증가 될 수 읽는다. 더 감도를 향상 읽는다. 칩 서열 분석을위한 표준 패키지 (예를 들면, 홈런 59 맥, 60, SPP 61) COSMIC-서열 데이터와 함께 작동합니다. 게놈 시퀀싱 및 칩 서열을 포함한 차세대 염기 서열에 의존하는 다른 방법과 마찬가지로, 반복 영역은 정렬 및 어셈블리의 모호성을 생성하고, 따라서 기술적 도전 남아 있습니다. </li></ol>

AZA는 Vista Motif, LLC 및 WINStep Forward의 단독 사업자입니다.

기존 ChIP의 주요 과제 중 하나는 적합한 항체를 식별하는 것입니다. ChIP는 항체의 품질에 크게 좌우되며 대부분의 상용 항체는 ChIP에 허용되지 않습니다. 실제로 ENCODE(Encyclopedia of DNA Elements) 컨소시엄은 상용 항체의 20%만이 ChIP 분석에 적합하다는 것을 발견했습니다. 50 COSMIC을 사용하면 항체가 스트렙타비딘으로 대체됩니다. 폴리아미드는 비오틴으로 기능화되기 때문에 스트렙타비딘은 폴리아미드-DNA 가교를 포획하기 위해 항체 대신 사용됩니다. 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호 작용은 자연계에서 알려진 가장 강력한 것 중 하나이며 항체와 리간드의 상호 작용보다 1,000배에서 100만 배 더 강합니다. 62 우리는 포획된 폴리아미드-DNA 가교를 항체를 변성시키는 가혹한 세척에 노출시킴으로써 이러한 강력한 상호 작용과 스트렙타비딘의 본질적인 안정성을 활용합니다. 이러한 세척은 COSMIC의 배경 신호를 감소시킵니다. 또한, 히스톤과 같은 비...

정보는 인간의 몸에있는 각 셀은 DNA로 인코딩하게한다. 정보의 선택적 사용은 세포의 운명을 관장. 전사 인자 (TFS)의 게놈에서 유전자의 특정 서브 세트를 표현하는 특정 DNA 서열에 결합하는 단백질이고, TF가의 오동작 발육 불량, 암, 당뇨병을 포함한 질병의 광범위한 배열의 발병에 연결되어 . 1, 우리는 선택적으로 유전자에 결합하여 유전자 조절 네트워크를 조절할 수 분자를 개발에 관심이 있었다. 폴리 아미드는 N 개의 -methylpyrrole 구성 및 N 라이벌 자연 전사 인자. 3-6이 분자가 DNA의 작은 홈에 특정 서열에 결합 특이성과 친화력을 가진 DNA를 타겟팅 할 수 있습니다 분자를 -methylimidazole 합리적으로 설계되어있다. 4,5,7 -11 폴리 아미드를 모두 억제하는데 사용될 특정 g의 발현을 활성화 된ENES. 4,12-19은 또한 흥미 20-24 항 바이러스 및 항암 12,13,25-30 특성을 갖는다. 폴리 아미드의 하나의 매력적인 기능은 (31, 32)을 메틸화와 히스톤 단백질 9,10,33 감싸되는 DNA 서열에 액세스 할 수있는 능력이다. DNA 결합 분자의 광범위한 결합 특이성을 측정하기 위해, 우리의 실험은 34-39 체외 특이성 (genomescapes)에 기초하여 결합 부위의 예측 된 발생 게놈 상에 표시 될 수있다. 동족 사이트 식별자 (CSI)에있어서 생성하기 때문에 체외에서 결합 강도가 협회 상수에 직접적으로 비례한다 (K). 34,35,37이 genomescapes는 게놈에서 폴리 아미드 점유율에 대한 통찰력을 제공하지만, 살아있는 세포에 결합 측정 폴리 아미드 도전하고있다. DNA는 단단히 결합 부위의 접근성에 영향을 미칠 수있는 핵에 포장된다.폴리 아미드 이러한 chromatinized DNA 서열의 ccessibility은 신비에 남아있다. 최근, 많은 방법이 등장 작은 분자와 핵산 사이의 상호 작용을 연구. 40-48을 화학적 친 화성 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 (화학-서열은) 하나의 기술이다. 화학 - 서열은 리간드 - 타겟 상호 작용을 캡쳐하는 관심 대상 유전자와 명소 소분자의 비오틴 유도체 작은 분자를 가교하는 포름 알데히드를 사용한다. 48,49 포름 알데히드 가교는 오탐 (false positive)을 생성 할 수 있습니다 간접적 인 상호 작용에 연결됩니다. (50) 우리는 새로운 방법, 작은 분자의 가교이 소위 &quot;팬텀&quot;피크를 제거하기 위해 photocrosslinker와 염색질 (COSMIC), (51)을 분리한다. (50)을 시작하려면를 개발, 우리는 설계 및 폴리 아미드의 관능 성 유도체를 합성. 이들 분자는 DNA 결합 POL 포함yamide, photocrosslinker (소 랄렌)과 친 화성 핸들 (비오틴, 그림 1). 관능 폴리 아미드, 우리는 공유. 365 nm의 자외선 조사, DNA 손상되거나 비 랄렌 계 가교를 유발하지 않는 파장을 갖는 폴리 DNA 상호 작용을 캡처 (51) 다음으로, 우리는 엄격한 반 하에서 캡처 DNA를 게놈 단편화 및 정제 -denaturing 조건이 아닌 공유 결합 인 DNA를 감소시킵니다. 따라서, 우리는 화학-SEQ 관련된 방법으로서 COSMIC 볼하지만 DNA의 직접적인 판독 타겟팅. 중요한 것은, 약한 (K 10 세 -10 4 M-1) DNA에 대한 소 랄렌의 친화력은하지 않습니다, 검출 충격 폴리 아미드 특이성. (51, 52) 농축 DNA 절편이 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (51) 중 하나에 의해 분석 될 수있다 (COSMIC-qPCR에) 또는 차세대 시퀀싱 (53) (COSMIC-SEQ)에 의해. 이러한 데이터는 리간드의 편견, 게놈 안내 디자인을 사용하는 것이 간자신의 원하는 게놈 궤적 행동 및 오프 - 타겟 효과를 최소화 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> 그림 1. 생리 활성 폴리 아미드 및 COSMIC 계획. (A) 폴리 아미드 머리핀 (가) 1 - 2 타겟 DNA 서열 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. 선형 폴리 아미드 3-4 목표 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. N 메틸이 미다 졸의 반지는 명확성을 위해 굵은있다. 열고 채워진 원은 각각 N 개의 -methylpyrrole 및 N의 -methylimidazole을 나타냅니다. 스퀘어 -3- 클로로 티를 나타내고, 다이아몬드 β 알라닌을 나타낸다. 소 랄렌 및 비오틴은 각각 P 및 B로 표시된다. (B) COSMIC 계획. 세포는 폴리 아미드의 관능 성 유도체로 처리됩니다. 365 nm의 자외선을 조사하여 가교 한 후, 세포는 L 아르ysed 및 게놈 DNA는 전단된다. 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬은 폴리 아미드-DNA 부가 물을 캡처하는 추가됩니다. DNA가 해제되고 정량 PCR (qPCR에) 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 분석 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>우리는 다른 DNA 컬럼 제조업체를 성공적으로 시도했습니다.</td></tr><tr><td>TruSeq ChIP 시료 준비 키트</td><td>: Illumina</td><td>IP-202-1012</td>: <td>이 키트는 차세대 염기서열분석을 위한 COSMIC DNA를 준비하는 데 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td> H1, ESCs pH 종이, 모든 소스<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>황색 마이크로 원심분리기 튜브</td>, <td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>마이크로 원심분리기 튜브를 성장시키기 위해 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다.</td><td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>파이렉스 필터</td><td>, 모든 소스</td><td></td>, <td>파이렉스 베이킹 접시, 적합,</td></tr><tr><td>qPCR, 마스터 믹스</td>, <td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>RNase</td>, <td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, HCl(6, N)</td><td>, 모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>10cm 조직 배양 접시</td>, <td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 혈청학적 피펫,</td><td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫,</td><td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 피펫 팁</td>, <td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>15-ml 원추형 튜브</td><td>, 모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 원심분리기,</td><td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>마이크로 원심분리기</td>, <td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>너트기</td><td>, 모든 소스</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>마그네틱 분리 랙</td><td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 소스</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>다른 UV 소스를 사용할 수 있지만 가교 시간을 경험적으로 최적화해야 합니다</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 with 431C1 cup horn</td><td>다른 초음파 발생기를 사용할 수 있지만 초음파 처리 조건은 경험적으로 최적화되어야 합니다</td></tr><tr><td>가습 CO2 인큐베이터</td><td>모든 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 배출구가 있는 생물학적 안전 캐비닛</td>, <td>모든 출처</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cosmic와 세포의 약물-dna 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

게놈은 가장 효과적인 화학 요법 제의 일부의 목표이지만, 이러한 약물의 대부분은 투여 량 - 제한 독성 많은 부작용을 초래 DNA 서열 특이성을 결여. 서열 - 특이 소분자와 게놈 타겟팅 증가 된 치료 지수 적은 표적 이탈 효과 분자를 가능하게 할 수있다. N의 -methylpyrrole / N -methylimidazole 아미드 합리적 절묘한 정밀도로 특정 DNA 서열을 대상으로 설계 될 수 분자이다. 그리고 가장 자연스러운 전사 인자와는 달리, 폴리 아미드는 친 화성의 손실없이 메틸화 및 chromatinized DNA에 결합 할 수 있습니다. 폴리 아미드의 서열 특이도는 광범위하게 동족 사이트 식별 (CSI)와 체외에서 전통적인 생화학 및 생물 물리학 적 방법으로 연구되어 왔지만, 세포의 게놈 대상에 결합 폴리 아미드의 연구는 애매 남아있다. 우리는 방법을보고 여기서, 작은 분자의 가교하는 졸라테 염색질 (COSMIC은), 즉 게놈에 걸쳐 폴리 아미드 결합 부위를 식별합니다. COSMIC는 염색질 면역 (칩)와 유사하지만, 두 가지 중요한 방식에서 차이 : photocrosslinker은 선택적, 시간적으로 제어되는 아미드 결합 이벤트 캡처, 및 (2) 비오틴 친화력 핸들 아미드를 정화하는 데 사용을 가능하게하는데 사용된다 (1) 반 변성 조건에서 -DNA 복합체가 아닌 공유 결합 인 DNA를 감소시킵니다. COSMIC는 폴리 아미드 및 다른 게놈 표적 항암제의 게놈 전체의 결합 이벤트를 나타 내기 위해 사용될 수있는 일반적인 전략이다.

불균일 게놈 단편화 및 다른 변수를 고려하기 위해, 정제 된 DNA는 항상 입력 DNA의 기준에 대해 표준화되어야한다. 관심의 궤적에 특이 적 프라이머를 사용할 수있다. 또한, 음성 대조군으로서, 분자가 결합 할 것으로 예상되지 않은 궤적을 분석하는데 도움이된다. 우리는 365 nm의 빛 (그림 2) 조사에 폴리 아미드 점유율에서&gt; 100 배 증가를 참조하십시오. 농축 된 DNA는 차세대 시퀀싱에 의해 분석 될 수있다. DNA 칩이 제조 될 때 DNA (예를 들면, 상업용 샘플 프렙 키트, 자재 목록 참조)과 동일한 방법으로 서열 분석을 위해 준비된다. 심지어 차세대 시퀀싱으로, 우리는 여전히 우리는 폴리 아미드 바인딩 할 것으로 예상 위치를 궤적에서 DNA를 농축을 확인하는 qPCR에 사용합니다. 일단 서열, 원시 DNA는 게놈 및 밀도 흔적이 칩 서열 데이터 (그림 3)을 분석하기위한 동일한...

게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 내 폴리아미드 및 기타 DNA 표적 소분자의 전유전체 결합 프로파일을 결정하는 것입니다. 이 방법은 유전체를 활용하여 DNA 표적 분자의 설계를 안내함으로써 약물 DNA 화학 분야의 발전에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 리간드와 DNA의 직접적인 상호작용을 측정하여 유전체에 작용하는 리간드의 작용 기전에 대한 통찰력을 제공한다는 점입니다.가장 성공적인 치료제 중 일부는 DNA에 결합하여 게놈 거래를 방해하는 소분자 물질입니다. 이 방법은 폴리아미드를 연구하기 위해 개발되었으나, 다른 종류의 DNA 표적 분자에도 적용될 수 있습니다. 이 실험에 사용되는 세포는 10 cm 디쉬에서 다능성 줄기세포를 지원하는 표면 코팅과 함께 E8 Media에서 37 °C, 5% 이산화탄소 가습 분위기 하에 배양됩니다.폴리아미드를 첨가하기 전에, 사용한 배양 배지를 제거하고 10 cm 디쉬당 8ml의 신선한 배지를 추가합니다. 이 시점부터는 조기 광가교를 방지하기 위해 세포를 빛으로부터 보호하십시오. 피펫을 사용하여 각 디쉬의 배양 배지에 폴리아미드를 직접 첨가합니다.디쉬를 흔들어 폴리아미드가 배지에 고르게 분산되도록 합니다. 세포를 5% carbon dioxide의 습윤한 분위기 속 37 degrees Celsius에서 24시간 동안 배양하며, 빛으로부터 보호되도록 합니다. 다음 날, 세롤로지컬 파이펫과 파이펫 디스펜서를 사용하여 각 10 cm 디쉬를 4 ml의 PBS로 세척합니다.PBS를 흡입하여 제거하고 E8 배양액 3 ml를 첨가합니다. 조명을 낮춘 상태에서 세포를 후드 밖의 평평한 표면에 놓고 5개의 배양 접시 뚜껑을 엽니다. 300 nm 미만의 파장 빛을 차단하기 위해 5개의 배양 접시 위에 유리 필터를 놓습니다.UV 광원을 필터 위에 배치합니다. 365 nanometers UVA 방사선으로 30분 동안 샘플을 가교 결합(cross-link)합니다. UVA 조사가 끝나면 배양 접시를 다시 후드로 옮깁니다.진공 트랩에 연결된 파스퇴르 피펫으로 배지를 흡입하고, 각 10 cm 디쉬를 4 ml의 PBS로 세척합니다. PBS를 흡입한 후, 10 cm 디쉬당 3 ml의 세포 해리용 효소를 첨가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.디쉬당 3 ml의 E8 Media를 사용하여 효소 반응을 중단시킵니다. 해리된 세포를 15 ml 원뿔형 튜브 하나로 옮깁니다. 이 시점부터 세포를 얼음 위에 둡니다.분리된 세포를 500 x g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 효소와 배지를 제거합니다. 염색질(Chromatin) 분리 절차를 시작하려면 신선한 단백질 분해 효소 억제제가 포함된 cosmic buffer를 준비합니다.100 mM PMSF, 100 mM benzamidine 및 150 µM pepstatin 단백질 분해 효소 억제제를 각각 12.1 µL씩 basal cosmic buffer에 새로 첨가합니다. cosmic buffer 1.2 ml를 세포 펠렛에 넣고 피펫으로 여러 번 섞어 재부유시킵니다. 그런 다음 세포 용액을 두 개의 1.7 ml 갈색 마이크로 원심분리 튜브에 나누어 담습니다.소니케이터를 사용하여 게놈을 100에서 500 base pairs 사이의 크기로 단편화합니다. 마이크로 원심분리 튜브 내의 크로마틴 용액 수위를 저장조의 수위와 평행하게 유지하십시오. 육안 검사를 통해 이 수위를 확인하십시오.초음파 처리 시간은 경험적으로 최적화되었으며, 60% 출력에서 10초 작동 및 10초 정지 주기로 35분간 초음파 처리합니다. 샘플을 냉각하기 위해 저수조에 최소량의 얼음을 사용하고, 얼음이 샘플과 컵 혼(cup horn) 사이를 방해하지 않도록 합니다. 초음파 처리가 완료되면, 샘플을 12 000 g에서 10분간 원심 분리합니다.수용성 크로마틴(Chromatin)이 포함된 수용액을 새로운 갈색 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 보관하십시오. 펠렛(pellet)은 버립니다. 샘플의 110 µL 또는 10%를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.'input DNA'라고 표시하고 80°C에서 보관하십시오. 크로마틴 샘플의 나머지 부분은 본 프로토콜의 다음 단계에서 사용하기 위해 얼음 위에 보관하십시오. 리간드-DNA 교차 결합을 포착하기 위해, 크로마틴 샘플의 남은 양을 스트렙타비딘이 코팅된 자성 비드에 추가하고 혼합물을 다시 현탁하십시오.크로마틴을 비드와 함께 4 °C의 회전식 ロッキング 믹서에서 최소 4시간 동안 배양합니다. 필요한 세척 버퍼는 증류 탈이온수로 조제하고 사용 전 0.2 µm 필터로 여과해야 합니다. 버퍼 1과 2는 4 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있으나, 버퍼 3은 매일 새로 조제하여 사용해야 합니다.스트렙타비딘이 코팅된 자성 비드와 크로마틴의 배양(incubation)이 완료되면, wash buffer 1로 샘플을 7분 동안 세척합니다. 샘플을 자성 분리 랙에 놓아 비드를 포집하고 wash buffer 1을 제거합니다. wash buffer 2를 첨가하고 다시 7분 동안 세척합니다.그다음 wash buffer 3로 1회당 7분씩 두 번 세척합니다. 마지막으로 TE Buffer로 두 번 세척합니다. 최종 TE Buffer 세척 후, 비즈를 200 microliters의 TE Buffer에 다시 현탁합니다.이렇게 캡처된 DNA 샘플을 친화성 정제 또는 AP DNA라고 합니다. 다음으로, input DNA와 AP DNA에 10x 가교 역전 버퍼를 첨가하여 최종 농도가 1x가 되도록 합니다. 90 °C에서 30분 동안 배양합니다.AP DNA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 상온에서 2분 동안 자성 분리 랙에 둔 다음, AP DNA가 포함된 액체를 새로운 갈색 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. Input DNA와 AP DNA를 중화시킨 후, 두 DNA 샘플 모두에 RNase A를 최종 농도가 0.2 µg/µL가 되도록 첨가합니다. 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.1시간 후, Input DNA와 AP DNA 모두에 Proteinase K를 최종 농도가 0.2 micrograms per microliter가 되도록 첨가합니다. 55 degrees Celsius에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서, Input 및 AP DNA를 DNA column clean up kit로 정제한 후 DNA grade water로 용출합니다.분석 준비가 될 때까지 DNA를 20 또는 80 °C에서 보관하십시오. Affinity Purified DNA는 항상 Input DNA 기준물질과 비교하여 표준화해야 합니다. locus 특이적 프라이머를 이용한 정량 PCR의 대표적인 결과는 365 nm 광 조사 시 폴리아미드 점유율이 100배 이상 증가함을 보여줍니다.농축된 DNA는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)을 통해 분석할 수 있습니다. 서열 분석이 완료되면, 가공되지 않은 DNA 리드(raw DNA reads)를 게놈에 정렬하고 밀도 트랙(density tracks)을 작성합니다. 이 예시는 AAG 반복 서열을 표적으로 설계된 Linear Polyamide 4의 밀도 트랙을 보여줍니다.세포 내 폴리아미드 분포 분석 결과, 광범위한 친화도를 가진 군집 결합 부위가 세포 내 점유율을 가장 잘 예측하는 것으로 나타났습니다. 인비트로(in vitro) 인지 부위 식별 데이터를 사용하여 전체 게놈의 결합 점수를 산출하는 알고리즘이 개발되었습니다. 이 바이올린 도표는 전체 게놈에 걸친 폴리아미드 2 및 폴리아미드 4 결합의 예측 점수를 보여줍니다.Polyamide 4의 대표적인 게놈스케이프(genomescapes) 또한 제시되어 있습니다. 이 스코어링 방법을 통해, 다수의 저 및 중친화성 서열을 가진 로커스(loci)가 소수의 고친화성 서열을 가진 로커스와 유사한 폴리아미드 점유율을 보인다는 점이 밝혀졌습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, DNA가 정제될 때까지 샘플을 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 결합이 유전자 발현에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 RT-PCR 및 RNase C와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 cosmic을 사용하여 폴리아미드의 게놈 전반의 결합 프로파일을 매핑하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

genome-wide-mapping-drug-dna-interactions-cells-with-cosmic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

관련된 염색체 트랩 (ACT) 분석은 장거리 DNA 상호 작용을 확인하는 소설 편견 방법입니다. 장거리 DNA 상호 작용의 특성은 우리가 정상적인 생리 모두와 질병 상태에서 유전자 발현에 핵 건축의 관계를 확인할 수 있습니다.

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

우리는 높은 처리량 시퀀싱 (DamID-SEQ)에 DNA 아데닌의 메틸화 식별 (DamID)을 결합하여 여기에 분석을 설명합니다. 이 개선 된 방법은 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 제공하며, 허용 등과 칩 서열, RNA-SEQ 같은 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와 함께 DamID-서열 데이터 분석...

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

우리는 3차원 염색질 상호 작용을 사용하여 게놈 전체 협회 연구 (GWAS)에 의해 확인된 비 코딩 이체의 기능적인 연루를 확인하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

크로마틴 구성의 전산 분석을 사용하여 알츠하이머 병 변이체를 대상 유전자에 매핑

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

당사는 네이티브 γH2A.X 염색질 면역침전(ChIP)을 통해 일반적인 취약 부위 파괴를 검출하는 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 기존 γH2A.X ChIP 분석과 관련된 시간과 노동력을 크게 줄이면서 결과의 높은 재현성과 신뢰성을 유지합니다.

네이티브 γH2A에 의한 일반적인 취약한 부위 파손 캡처. X 치프

학습하세요 COSMIC 방법을 통해 DNA 표적 소분자의 게놈 전체 결합 프로파일을 측정하는 기술을. 이 방법은 약물-DNA 상호작용을 직접 측정하여 작용 기전을 이해하고 새로운 치료제 설계에 활용할 수 있습니다.

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

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