전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

이 절차의 전반적인 목표는 열대 반응 중 굳은살 매개 플라스모데스말 게이팅에 관여하는 유전자를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 식물 발생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 알려지지 않은 유전자가 열대 반응 중 형질세포에 의한 세포 간 신호 전달을 제어하는 것과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하고 작동하며 반복된다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 전체 과정에서 아무런 손상 없이 Arabidopsis etiolated hypocotyls를 처리하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 플라스모데스널 게이팅(plasmodesmal gating)에서 포도당 합성효소(glucose synthase)인 GSL8의 규칙을 확립할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 오디오에 언급된 절차에서는 특별한 설정 및 처리가 필요하기 때문에 실행하기 어려운 중요한 단계를 설명하지 않았기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.

실험 하루 전에 Murashige와 Skoog 또는 MS 배지를 준비합니다. 오토클레이브하고 125mm 정사각형 플레이트에 플레이트당 50ml의 매체를 채웁니다. 다음날, 1.1% 차아염소산나트륨으로 살균된 씨앗을 반건조 접시에 점을 찍습니다.

1mm 마이크로피펫 팁에서 200마이크로리터의 물을 씨앗에 점을 찍습니다. 씨앗을 1.8cm 떨어진 5줄로 배열하고 씨앗은 행에서 최소 0.1cm 떨어져 있어야 합니다. 수술용 테이프로 플레이트를 덮고 밀봉하기 전에 약간의 물을 증발시키십시오.

그런 다음 접시를 호일로 싸서 상자 안에 넣으십시오. 상자를 섭씨 4도에서 3일 동안 배양합니다. 3 일간의 냉간 처리 후 씨앗 상자를 3 일 동안 섭씨 22도까지 옮깁니다.

3 일 더 후 어두운 방에서 녹색 조명 아래에서 씨앗의 발아 상태를 확인하십시오. 일반적으로 3 일 된 Col-0 etiolated 묘목은 길이가 1.6cm까지 자랍니다. 녹색 조명 아래에서 변경된 광방성 및 중력 반응을 분석합니다.

멸균 된 피크를 사용하여 직선, 수직 성장을하는 비슷한 크기의 묘목을 선택하십시오. 다른 부분을 건드리지 않고 hypocotyl의 가장 낮은 부분에서 묘목을 부드럽게 들어 올립니다. 그런 다음 선택한 묘목을 새 MS 한천 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다.

새 접시에서 같은 방식으로 묘목의 갈고리 방향을 지정합니다. 각 유전적 배경의 묘목을 20개 이상 선택하여 각 행을 만들고 모든 플레이트를 복제합니다. 각 플레이트에는 두 줄에 두 개의 유전자형이 포함되어 있습니다.

광방성 반응을 확인하려면 묘목이 수직 방향이 되도록 검은색 상자에 플레이트를 배치합니다. 상자의 한쪽 면을 접시 가장자리까지 열어 둡니다. 그런 다음 일방적인 백색광이 있는 식물 성장실에서 상자를 배양합니다.

중력 반응을 확인하려면 접시를 호일로 감싸고 묘목이 수평이 되도록 검은색 상자에 넣습니다. 일반적으로 90분에서 시작하여 12시간까지 연장되는 여러 시점에서 저조도 조건에서 플레이트를 이미지화합니다. 스캐너 세트를 사용하여 600DPI JPEG 이미지를 수집합니다.

묘목의 굽힘 각도를 측정하려면 ImageJ 소프트웨어에서 이미지를 로드합니다. 확대 도구를 사용하여 확대하고 분석할 묘목으로 스크롤합니다. 그런 다음 각도 도구를 사용하여 묘목이 구부러지는 각도를 측정합니다.

이렇게하려면 원래의 hypocotyl 성장 방향 지점 A를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 마우스를 굽힘 시작 지점 B로 드래그합니다. 그런 다음 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 첫 번째 선을 그립니다. 이제 B 지점에서 굽힘 끝, C 지점으로 마우스를 드래그하고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 두 번째 선을 그려 각도를 형성합니다. A. 실제 굽힘 각도는 각도 B이며, 이는 180도에서 각도를 뺀 각도 A와 같습니다. 이제 키보드에서 M을 눌러 각도 A를 측정하고 기록합니다. 결과 파일이 별도로 열립니다.

나머지 묘목을 측정하려면 이전 단계를 반복하고 데이터 세트 스프레드시트 파일을 사용하여 두 개의 서로 다른 배경의 평균 각도를 측정합니다. 이 분석에 필요한 HPTS 아가로스 블록의 준비는 텍스트 프로토콜에서 다룹니다. 식물 샘플을 준비하는 것으로 시작하십시오.

이 예에서는 변경된 plasmodesmata 크기 배제 한계를 가진 돌연변이를 분석합니다. 먼저 분석을 위한 플랫폼을 만듭니다. 새 MS 매체 플레이트에 현미경 커버 슬라이드를 놓습니다.

다음으로, 3 일 된 etiolated 묘목이있는 MS 플레이트에서 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 후크 바닥에서 묘목을 조심스럽게 절제하고 커버 유리로 옮깁니다. 유전적 배경당 최소 5개의 묘목을 이식합니다. 절제 위치에서 0.5cm의 hypocotyl 만 덮개 슬라이드에 남아 있고 나머지 hypocotyl이 배지에 닿도록하려면 묘목의 방향을 지정하십시오.

그런 다음 절제된 묘목 위에 HPTS 아가로스 블록을 놓아 절제된 영역이 HPTS 블록과 접촉하도록 합니다. 접촉이 이루어졌는지 확인하십시오. 블록을 5분 동안 하이포코틸에 그대로 두십시오.

그런 다음 하이포코틸을 이중 증류수가 담긴 10mm 페트리 접시에 옮기고 15분 동안 흔들어 씻습니다. 다음으로, 씻은 묘목을 슬라이드로 옮깁니다. 각 돌연변이를 컨트롤 옆에 배치하여 직접 비교합니다.

100-150 마이크로 리터의 이중 증류수로 hypocotyls를 덮고 덮개 슬라이드를 적용합니다. 이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컨포칼 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다. 이 분석을 위해 2일 미만이고 어두운 곳에 보관된 갓 준비된 염료를 사용하십시오.

de novo callose 합성을 억제하려면 염료에 1.5 밀리 몰의 2-Deoxy-D-glucose를 첨가하십시오. 열대성 반응이 있거나 없는 석회화 염색을 위해 3일 된 에티올 묘목을 선택하여 이 분석을 시작합니다. 얇은 수술 용 가위를 사용하여 갈고리 부분에서 묘목을 자릅니다.

그런 다음 이쑤시개 끝을 사용하여 2ml의 염색 완충액이 들어있는 작은 페트리 접시에 묘목을 옮깁니다. 어두운 곳에서 염색 완충액에 묘목을 30RPM으로 계속 흔들면서 2시간 동안 배양합니다. 염색 후 묘목을 이중 증류수로 2분 동안 세척하여 과도한 염색 완충액을 제거합니다.

세척이 완료되면 컨포칼 분석을 위해 각 배경에서 최소 5개의 묘목을 선택합니다. ImageJ 소프트웨어로 callose 신호 강도를 측정합니다. 이미징 소프트웨어에서 JPEG 형식으로 이미 저장된 컨포칼 현미경 파일을 엽니다.

그런 다음 사각형 선택 도구를 사용하여 그림 위로 커서를 끌어 검사할 영역을 선택합니다. 그런 다음 M을 눌러 신호 강도에 대한 숫자 값을 측정하고 기록하면 결과 파일이 별도로 열립니다. 결과 파일에서 "평균"이라는 용어는 여러 영역의 평균이 아니라 선택한 영역의 신호 강도를 나타냅니다.

각 묘목에 대해 이러한 방식으로 신호를 하나씩 분석합니다. 나머지 묘목을 측정하려면 위의 단계를 반복하고 데이터 세트 스프레드시트 파일을 사용하여 두 개의 서로 다른 배경의 평균 각도를 측정합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 AtGSL8의 덱사메타손 유도성 RNAi 라인을 분석했습니다.

DsGSL8 묘목은 분명히 광방성(phototropism)과 중력성(gravitropism)에 결함이 있었다. 그들은 어느 힘의 영향에도 굴곡을 보이지 않았습니다. symplasmic movement의 변화는 HPTSA dye movement가 두 대조군보다 dsGSL8 RNAi knockdown에서 훨씬 더 광범위함을 보여주었습니다.

Callose는 plasmodesmata 크기 배제 한계의 핵심 조절자 중 하나이며, AtGSL8은 알려진 plasmodesmata callose synthase입니다. 그래서, 칼로스 아닐린 블루 염색을 실시하였다. 대조군에서 칼로스는 노란색 화살표로 표시된 것처럼 6시간 후에 축적되었습니다.

그러나 6시간 후, 돌연변이체는 지속적으로 낮은 혈장모데마타 칼로스 수치를 보였습니다. 이러한 석회성 합성의 부재는 광방성 후 3시간 이내에 측정적으로 적었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 순전히 캘로스 조절을 통한 열대 반응으로 인한 형질변형 개폐형질(plasmodesmal gating)을 제어하는 변이에서 유전자를 신속하게 스크리닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일단 숙달되면이 기술은 애기장대 묘목의 3 일 발아 후 약 6 시간 내에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 묘목을 옮기는 동안 묘목이 손상되지 않도록 기억하는 것이 중요합니다. 또한 로딩 분석 중에 한천과 하이포코틸 사이에 적절한 접촉을 만드는 것이 중요합니다.

이 개발 이후, 이 기술은 열대 지방에서 symplasmic conductivity를 제어하는 역할을 하는 유전자, 새로운 유전자를 탐구하기 위한 발달 생물학의 길을 열었습니다