Name: 전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana에서 callose 매개 plasmodesmal 게이팅을 이용한 유전자 스크리닝 방법을. 이 기술은 식물 발달 생물학에서 세포 간 신호 전달을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 한국 연구 재단 (NRF-2015R1A2A1A10053576)에서 지원하고, 차세대 BioGreen 21 프로그램에서 연구비 (SSAC는 PJ01137901을 부여), 농촌 진흥청, 대한민국. RK, WS, ABB와 DK는 두뇌 한국 21 플러스 프로그램 (BK21 +)에 의해 지원되었다.

변경된 Phototropic 및 Gravitropic 응답과 돌연변이 1. 심사 <ol><li> 실험 전에 0.8 % 한천 한 주에 1 배 무라 시게 및 스쿡 (MS) 중간, pH가 5.7을 준비합니다. <ol><li> 2 L 삼각 플라스크에 증류수 800 ml에 추가하고 자기 바 저어. </li><li> 원추형 플라스크에 MS 염 4.4 g을 추가합니다. </li><li> 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 (MES) 0.5 g을 추가하고 염 모두가 완전히 용해 될 때까지 교반한다. </li><li> 1 M KOH와 5.7 매체의 pH를 조정합니다. </li><li> 매스 실린더에 매체를 전송하고 DDH 2 O.과 1 L로 최종 부피를 가지고 </li><li> 2 L 삼각 플라스크에 매체를 다시 붓​​고 식물 한천 8g을 추가합니다. </li><li> 알루미늄 호일로 단단히 삼각 플라스크의 입구를 랩. </li><li> 121 ° C, 15 psi에서 15 분 동안 MS 매체와 DDH 2 O를 압력솥 ​​및 고압 증기 멸균 한 후, 60 ° C 배양기 및 RT의 DDH 2 O의 매체를 유지. </li><li> 60 ° C로 냉각 한 후, 층류 벤치에 125 X 125 X 20mm 3 정사각형 판에 매체 (각 접시에 50 ml)에 붓는다. </li><li> 한천이 부분적으로 개방 판을 유지하여 약 1 시간 동안 실온에서 응고 할 수 있습니다. 플레이트를 즉시 사용하지 않는 경우, 냉장고에 4 ° C에서 플라스틱 랩 저장소를 사용하여이를 밀봉. </li></ol></li><li> 1.1 %의 차아 염소산 나트륨과 씨앗을 표면 소독 및 섹션 1.1 제조 하였다 1X MS 한천 접시에 씨앗을 점. 참고 :. 여기에서, 애기 장대 {골-0 씨앗, dsGSL8 (골-0)} 15 트로픽 응답, callose 염색 및 HPTS로드 애기 장대 {골-0 및 dsGSL8 (골-0) EMS 돌연변이} 씨앗 (사용된다 ) 게시되지 않은 그림 2에서 열대 응답에 사용됩니다. <ol><li> 병에 DDH 2 O의 300 ml의 압력솥. </li><li> 각 배경에 대해 약 백 씨앗을 추가, 즉,돌연변이 / 과발현 라인과 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 야생형 (골-0) 씨. </li><li> 4 ° C 형 냉장고에서 1 배 MS 한천 플레이트를 꺼내 부분적으로 개방 위치에 층류 벤치에 그들을 건조. </li><li> 0.2X 표백제 용액 (1.1 % 차아 염소산 나트륨) 1 ㎖를 첨가하여 종자를 표면 - 멸균하고 5 분 동안 250 rpm에서 진탕 기에서 마이크로 원심 튜브를 유지한다. </li><li> 씨앗은 중력에 의해 바닥에 정착 한 후 마이크로 피펫으로 표백제 용액을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 씨앗에 신선한 DDH (멸균) 2 O 1 ㎖를 추가하고 microcentrifuge 관을 여러 번 반전 잘 섞는다. 씨앗이 다시 정착 한 후 물을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.6 5-6 번. </li><li> 최종 세척 후 남아 있던 씨의 볼륨에 물 두 배를 추가합니다. </li><li> 도트 씨의 200 μl를 함유하는 1 ml의 마이크로 피펫 팁을 사용하는 반 건조 1X MS 한천 플레이트에 소독 종자 (투입CLUDING 물). <ol><li> 이 씨와이 씨의 행 사이에 1.8 cm의 최소 사이에 약 0.1 cm의 거리를 유지. 사각 접시 (125 X 125 X 20mm 3)에 5 수평 행에 씨앗을 점. 물이 접시에 뚜껑을 배치하기 전에 약간 건조하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 수술 테이프로 밀봉 판을 수직 플레이트의 모든 스택 및 알루미늄 호일로 래핑. </li><li> (빛없이 액세스) 어두운 상자에 포장 판을 전송합니다. 그런 다음 3 일 동안 4 °의 C 룸 / 냉장고에 어두운 상자를 유지합니다. </li><li> 이 단계에서 시작, 변경되지 않은 판의 방향을 유지합니다. 감기 치료 3 일 후, 다음 3 일 동안 22 ° C에서 식물 배양 방에 어두운 상자를 유지합니다. 삼일 후, 어두운 방에 녹색 빛 아래 씨앗의 발아 상태를 확인합니다. 참고 : 일반적으로 삼일짜리 골-0 etiolated 모종의 길이가 1.6 cm까지 증가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 변경된 phototropic 분석특정 유전자의 라인 돌연변이 또는 과발현 차 gravitropic 응답. 어두운 방에 녹색 빛 아래에서만 비슷한 크기와 수직 성장 직선 모종을 선택합니다. 멸균 이쑤시개의 끝을 사용하여 신선한 1X MS 한천 플레이트에 선택 모종을 전송합니다. <ol><li> 조심스럽게 다른 부분을 건드리지 않고 자신의 배축의 가장 낮은 부분에서 모종을 선택합니다. 묘목이 모두 같은 자엽 / 후크 방향이 있는지 확인하고 전송 한 후, 종묘 후크의 방향은 동일하게 유지있다. 각 행의 각 배경 및 추가 분석을 위해 각 시점 두 판의 최소 20 모종의 최소 사용합니다. 참고 : 네 개의 서로 다른 배경은 각 플레이트 (4 행)에 비교 될 수있다. 덱사메타손 (dexamethasone)을 (덱스) -inducible의 RNAi / 과발현 라인을 사용하는 동안, 1 배 MS에 위의 모종을 전송 (1 배 MS를 포함 플레이트, 0.8 % 한천 배지 20 μM의 덱스 보충) 수 fo + 덱스 MS 판과 함께 판 : 선택R 3 시간 어두운 상자에 수직으로 판을 유지한다. </li><li> phototropic 응답을 확인하려면, 열 하나의면이 블랙 박스에 수직으로 위의 접시를 전송합니다. 일방적 백색광 식물 성장 챔버로 플레이트를 포함하는 블랙 박스로 이동. 일방적 광을 보장하기 위해, 광원 (아닌 전방 측)을 향해 판의 가장자리를 놓는다. 그림 1에서 설치를 참조하십시오. </li><li> 마찬가지로, 상기 gravitropic 응답을 확인 수직 전송 모종으로 판을 유지하고 알루미늄 호일로 커버한다. 다음으로, 90 ° 수직 플레이트 방향을 변경하고 모든면에서 적용되는 블랙 박스 안에 보관하십시오. 그림 1에서 설치를 참조하십시오. </li><li> 주어진 시점 후 (일반적으로 1.5 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간)는 스캐너와 함께 접시를 검색하고, JPEG 형식으로 사진을 저장합니다. </li><li> (그림 ImageJ에 소프트웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/index.html)를 사용하여 모종의 굽힘 각도를 측정URE 2). <ol><li> 더블 클릭 (그림 2A)에 의해 ImageJ에 프로그램을 시작합니다. 주 : 각도 측정에 사용 된 주요 도구는도 2b에 도시되어있다. </li><li> 서브 옵션을 &quot;열기&quot;를 ImageJ에 도구 모음 및 열대 굽힘 각도 (그림 2C)을 측정하기 위해 JPEG 파일 형식으로 저장 열려있는 사진 뒤에 &quot;파일&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> 왼쪽 또는 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하면, 각각으로도 2b에 도시로 사진을 확대 또는 축소 할 수있는 돋보기 도구를 클릭합니다. </li><li> 사진 (그림 2D) 다음 내용을 드래그하여 위치로 스크롤 도구를 클릭합니다 (그림 2E)를 굽힘 각도를 측정하는 각도 도구를 클릭합니다. <ol><li> 원래 배축 성장 방향 점 &#39;A&#39;, 굽힘 개시 포인트 (b) &#39;(그림 2 층)에 마우스를 드래그하여 왼쪽 엉덩이 클릭에 두 번 왼쪽 버튼을 클릭합니다에 첫 번째 줄 (그림 2G)를 그립니다. </li><li> 굴곡 종점 &#39;C&#39;로 B 지점에서 마우스를 드래그하고 두 번째 줄 (그림 2H)를 그릴 왼쪽 버튼을 클릭하고 고정을 형성 <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. 참고 진정한 굽힘 각도는 <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> 180과 동일하다 B, - <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. (그림 2 층). </li><li> 측정 및 기록 <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> 키보드의 &#39;M&#39;을 눌러. 도 2I에 도시 된 바와 같이, 결과 파일은 별도 열리고. 측정 한에 의해 모종의 일을 모두 기록한다. 예를 들어, 첫 번째 돌연변이 라인에 대한 다음 골-0에서 배축의 모든 굽힘 각도를 측정합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 는 AV를 만들기 위해 스프레드 시트 파일에 ImageJ에에서 데이터 집합을 전송각 배경의 각도를 굽힘 erage. </li><li> 정량 분석을위한 표준 오차 막대와 확률값 (도 2 참조)를 포함하여 통계적 시험 결과와 막대 그래프도를 만든다. <ol><li> 진정한 굽힘 계산 <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B, 그리고 즉, 스프레드 시트를 이용하여 수식을 설계 <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> B = 180 ° - <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A. 참고 : <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> A는 ImageJ에 분석에서 파생 된 값입니다. </li><li> 평균 굽힘 각도를 측정 <img alt="각도" src="/files/ftp_upload/53513/angle.jpg" /> 각 배경 사용하여 스프레드 시트 도구 (그림 2J)에 대한 B. </li><li> 스프레드 시트의 &quot;공식&quot;도구 (그림 2J)를 사용하여 각 측정에 대한 복제 사이의 표준 편차를 분석합니다. </li><li> SIG는 테스트평균 굽힘 각도와 전술 한 바와 같이 계산 된 표준 편차 값들에 t 검정을 적용하여 결과 nificance. </li><li> 그래픽 스프레드 시트 &#39;삽입&#39;도구 (그림 2K)를 사용하여 두 개의 서로 다른 배경 사이의 굽힘 각도의 양적 차이를 나타 내기 위해 위의 값을 사용하여 막대 그림을 그립니다. 참고 : 강력한 후보 유전자의 돌연변이 / 과발현 라인은 빠른 구부리거나 느린 굽힘, 같은 더 굽힘 등의 야생 유형에 대한 명확한 차이를 보여 것입니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 변경된 PD Callose 수준으로 인해 PD SEL의 변화에​​ 결함 트로픽 응답 2. 화면 공장 라인 <ol><li> HPTS 아가로 오스 블록과 모종의 상위 8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonic 산 (HPTS) 염료로드하여 배축로드 분석을 수행하고 돌연변이 사이에 염료의 운동을 비교 / 이상 표현 라인과 골-0. <ol><li> HPTS의 아가를 준비배축 로딩 분석을위한 자체 블록. <ol><li> 50㎖의 삼각 플라스크에 DDH 2 O 10 mL를 취하여 1 % 아가 로스 겔을 제조 아가 0.1 g을 추가한다. 간헐적 흔들림 1-2 분 동안 전자 레인지에 아가로 오스를 삶아하고, 5 분 동안 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖에 HPTS 50 mg을 추가하고, 용액이 녹색으로 바뀔 때까지 잘 섞는다. </li><li> 10mm 페트리 접시에 상기 혼합물을 붓고, 그리고 15 분 동안 응고 할 수 있습니다. </li><li> 작은 아가로 오스 블록 (0.5 × 2cm 2)를 만들기 위해 날카로운 해부 블레이드와 아가로 오스 응고 HPTS을 잘라. </li></ol></li><li> HPTS 염료 로딩 분석을위한 식물 샘플을 준비합니다. <ol><li> HPTS 염료 로딩 분석을위한 플랫폼을 설정; 도 3a에 도시 된 바와 같이, 새로운 MS 배지 ​​플레이트에 현미경 커버 슬라이드 (24 × 50 ㎜ × 2)를 배치했다. </li><li> 날카로운 외과 가위를 사용하여 후크의 기지에서 소비세 삼일 된 etiolated 모종. </li><li> 바로적출 위치로부터 배축의 0.5 cm 커버 슬라이드에 남아 있어야하는 방식으로 현미경 커버 글라스의 표면에 상기 모종 (각각 배경 5 모종 최소)로 전송하고, 배축 나머지 닿아 야 도 3b에 도시 된 바와 같이 매체. </li><li> 적출 된 영역이 HPTS 아가로 오스 블록을 터치하는 방식으로 5 분 동안 (AN 절제 후크)를 배축의 상단에 HPTS 아가로 오스 블록을 배치합니다. </li><li> 로드의 5 분 후, DDH 2 O가 포함 된 10mm 페트리 접시에 배축을 전송하고 지속적으로 흔들림과 함께 15 분 동안 DDH 2 O의 배축을 씻어의 배축면에서 아가로 오스 블록을 제거합니다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경에 대한 샘플을 준비합니다. <ol><li> 공 초점 레이저 주사 현미경으로 관찰 각 배경에서 5 모종의 최소를 선택합니다. </li><li> 레이저 채널 특정 EXC 488 nm의 파장을 설정itation 밴드 패스 발광 500 내지 550nm. </li><li> DDH 2 O.로 세척 한 후 새로운 현미경 슬라이드에 2 세트에 전송 모종 (한 골-0 + 하나의 돌연변이) 슬라이드에 두 번 증류수 100 ~ 150 μl를 추가하고, 커버 슬라이드 커버. 공 초점 현미경의 무대에 슬라이드를 이동. </li><li> 밝은 필드 (백색광) 조명을 사용하여 (20 배 또는 40 배 대물 렌즈 포함) 배축 영역을 초점을 맞 춥니 다. 그런 다음, 형광의 슬라이드를 스캔합니다. </li><li> 10 세트의 최소 화상을 찍어 로딩 지점에서 염료 운동의 정도를 검사함으로써 두 배경을 비교한다. 참고 : 변경된 symplasmic 운동에 돌연변이 / 과발현 라인은 야생형 골-0에 비해 염료 로딩의 다른 패턴을 보여줍니다. </li></ol></li></ol></li><li> 돌연변이의 Callose 수준을 분석 / 고유 HPTS 염료 운동 비교 예를 변경된 Phototropic 및 Gravitropic 응답 표시 및 표시 오버 식 선에드는 COL-0입니다. <ol><li> 아닐린 블루 callose 염색 염료를 준비합니다. <ol><li> 멸균 DDH 2 O.에서 1 M 글리신, pH를 9.5 및 0.1 % (W / V) 아닐린 블루 확인 </li><li> 3 볼륨 비율 : 0.1 % 아닐린 블루 2 1 M 글리신을 혼합하여 염색 버퍼를 확인합니다. 예를 들어, 염색 완충액 50ml를 들면 블루 20 0.1 % 아닐린 ㎖의 1 M 글리신 30 mL를 취하여. 주 : 염색 사용할 어두운에 저장되기 전에 48 시간의 최소 버퍼합니다. </li></ol></li><li> 얼룩은 굽거나 callose 특정 아닐린 블루 염료와 모종 비 굽. <ol><li> 염색 공정 동안 callose 드 노보 합성을 억제하는 것으로, 염색 완충액 50ml로 1.5 mM의 2- 데 옥시 -D- 글루코스 (DDG)의 최종 부피를 추가한다. </li><li> (또는 열대 응답 없음) callose 염색 3 일 된 etiolated 모종을 가져 가라. </li><li> 얇은 수술 용 가위를 사용하여 후크 지역에서 모종을 잘라. </li><li> 포함 작은 배양 접시에 모종 이동이쑤시개의 팁을 사용하여 염색 완충액 2 ㎖를 보내고. </li><li> 30 rpm에서 연속 흔들림 2 시간 동안 어둠 속에서 염색 버퍼와 모종을 품어. </li><li> 염색 후 과잉 염색 버퍼를 제거하기 위해 2 분 동안 DDH 2 O와 모종을 씻는다. </li><li> 공 초점 레이저 주사 현미경으로 관찰 각 공장 배경 5 모종의 최소를 선택합니다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경 샘플을 준비 : <ol><li> 현미경을 청소 세트에서 모종을 전송 (한 골-0 + 하나의 돌연변이는) DDH 2 O.로 세척 한 후 슬라이드 </li><li> DDH 2 O의 100 ~ 150 μl를 추가하고 커버 슬라이드 커버. 공 초점 현미경의 무대에 슬라이드를 이동. </li><li> 레이저 채널에서 특정 자극에 대한 405 nm의 아닐린 블루 형광 이미징을위한 500 550 nm의 방출에 파장을 설정합니다. </li><li> 10X 늦은 먼저, 초점에 배축 영역을 가져와밝은 필드 (백색광) 조명을 사용하여 20 배 또는 40 배 대물 렌즈와 연구. </li><li> 그런 다음, 필터링 된 빛에 전환 형광의 슬라이드를 스캔하고 이미지를 저장합니다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/index.html)와 callose 신호 강도를 측정한다 (도 4 참조). <ol><li> JPEG 파일 형식으로 올림푸스 이미지 바이너리 형식 (* .oib)에서 공 초점 현미경 사진의 형식을 변경합니다. 참고 : JPEG 포맷 ImageJ에 소프트웨어가 지원된다. </li><li> 더블 클릭 (그림 4A)에 의해 ImageJ에 프로그램을 시작합니다. 주 : 화살표는 callose 강도 측정 (도 4b)에 사용되는 직사각형 도구를 나타낸다. </li><li> callose 강도 (그림 4C)을 측정하기 위해 JPEG 파일 형식으로 저장된 상기 ImageJ에 도구 모음에서 &quot;열기&quot;서브 옵션, 오픈 현미경 사진 뒤에 &quot;파일&quot;옵션을 클릭합니다. </li><li> 이마에 직사각형 아이콘을 클릭합니다geJ 도구 모음 (그림 4D). </li><li> 상기 신호 세기를 분석하여 화면에 커서를 드래그하여 영역을 선택 검사한다 (도 4E) </li><li> 측정 및 키보드 (그림 4E)의 &#39;M&#39;을 눌러 신호 강도의 수치를 기록한다. 참고 : 결과 파일은 별도로 (그림 4 층) 열립니다. </li><li> 측정하고 강도가 각 공장 배경에서 모종의 모든 하나 하나 값을 기록한다. 참고 ImageJ에있어서, 그 결과 파일은 &quot;평균&quot;선택 &quot;영역&quot;의 신호 강도를 나타낸다. </li></ol></li><li> ImageJ에 결과 파일의 평균 값을 복사 및 정량 분석​​을 위해 스프레드 시트 파일에 붙여 넣습니다. </li><li> 정량 분석을 위해, 표준 오차 막대 확률 값 (그림 4)을 포함하여 통계 테스트와 막대 그래프도합니다. <ol><li> 평균 신호 세기를 측정스프레드 시트의 &quot;공식&quot;도구 (그림 4 세대)를 사용하여 각각의 배경 (ImageJ에에서 의미). </li><li> 스프레드 시트의 &quot;공식&quot;도구 (그림 4 세대)를 사용하여 각 측정에 대한 복제 사이의 표준 편차를 분석합니다. </li><li> thespreadsheet &quot;수식&quot;도구를 사용하여 표준 오차 (SE)를 계산합니다. (S)는 모집단의 표준 편차이고, (n)은 샘플의 크기 (관측 횟수)이고, SE의가 S / N √ 참고. </li><li> 평균 신호 강도와, 상술 한 바와 같이 계산 된 표준 오차 값에 t 테스트를 적용하여 결과의​​ 중요성을 테스트한다. </li><li> 그래픽 스프레드 시트 &#39;삽입&#39;도구 (그림 4H)를 사용하여 두 개의 서로 다른 배경의 callose 수준의 양적 차이를 나타 내기 위해 위의 값을 사용하여 막대 그래프 그림을 그립니다. 참고 : 강력한 후보의 돌연변이 / 과발현 줄 것들어떻게 다른 예를 더 callose, 작은 callose 또는 하이퍼 PD의 callose 축적으로 야생형에 비해 callose의 수준. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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이 원고에서 전략으로 인해 따라서, PD SEL이 자세히 설명되어 변경된 PD의 callose과에 phototropic 및 gravitropic 응답에 결함이 돌연변이 / 과발현 라인을 화면합니다. PD callose의 합성 및 분해는 주로 callose 신타 제와 β-1,3- Glucanases함으로써 달성되지만, 이들 효소의 조절은 여러 요인에 의해 상향 조절된다. 이러한 상류 요인 또는 직접 PD 조절에 관여하는 후보를 검색하려면, 우리는 선별이 방법을 설정했습니다. 이 설정 PD의 callose 생합성 (gsl8)을 조절하는 몇 가지 주요 효소의 돌연변이가 15 치명적이며,이 설정에 의해 제한 될 것 같은 돌연변이를 분류하는 일부 제한 사항이 있습니다. 후보 유전자가 빠르거나 개폐 PD 함께 트로픽 느린 응답 보여 주지만 callose 레벨을 그대로 유지하는 경우에도, 그 다음의 상세한 분석은 또한 그러한 후보를 특성화하는데 필요하다. 중요한 요인 및 문제 해결 proce을각 단계에서...

식물, 정착 생물체와 같은 다양한 환​​경 자극을 해결하는 세포 간 신호의 매우 정교한 네트워크를 개발 하였다. 트로픽 응답은 식물이 환경 자극에 반응하는 현상 중 하나입니다. 식물은 두 가지 열대 응답, 굴광성과 굴지성을 보여줍니다. 광합성 식물은 최대 에너지를 수확 굴광성에 의해 광원으로 구부리십시오. 마찬가지로, 굴지성는 무게 중심을 향해 성장하는 식물을합니다. 같은 열대 응답을 유도하는 근본적인 메커니즘은 phytohormone 옥신 1의 비대칭 경사 형성을 포함한다. 로컬 옥신 그라데이션 형성 법은 잘 특징으로한다; 이 메커니즘에 관여하는 유전자는 호르몬 작용 2-8에 대한 로드맵을 제공합니다. 옥신 등 PIN 형성 (PIN)와 같은 유출 담체, 및 p- 당 단백질의 특정 위치는 공여 세포 9,10의 세포벽을 세포질에서 옥신의 이동을 실행한다. 에프urthermore, 이러한 AUX1 / LAX 가족 단백질과 같은 옥신 유입 캐리어의 활성 H + / IAA의 symport 활동에 의해, 옥신은 마지막으로 인접 수신기 세포 2,11,12에 전달된다. 옥신이 방향 운동은 극성 옥신 수송 (PAT)로 알려져있다. PAT는 다양한 개발 단계에서 서로 다른 환경 적 자극 (13, 14)에 응답하는 차동 옥신 분포로 이끈다. 또한, 이러한 옥신 유입 또는 유출 사업자의 국산화 또는 식의 중단 발달 결함으로지도하는 옥신 그라데이션의 지장을 PAT에 심각한 변화로 이어집니다. 최근, 한 등. plasmodesmal 규제는 옥신 구배 (15)를 유지하는 것도 필요하다는 것을 밝혔다. 현재까지 30 개 이상의 plasmodesmal 단백질은 16 발견되었습니다. 이 단백질 중 AtGSL8는 plasmodesmata를 (PD)에 callose 합성의 핵심 효소로보고 따라서 MAINT에서 중요한 역할을하고있다는 PD 크기 배제 제한 (SEL)을 aining. 억압 AtGSL8 발현은 야생형 모종 15 대비에는 트로픽 응답 선도 왜곡 옥신 그라데이션 패턴 결과. 이 논문에서, 방법이 제공된다 PD 조절에 관여하는 새로운 후보 유전자를 탐색합니다. 이 callose 생합성 PD에 기여 주요 효소이기 때문에 AtGSL8 이러한 방법을 테스트하기 위해 모델 단백질로 사용 하였다. 때문에 녹 - 아웃 gsl8 돌연변이 체 (17)의 종묘 - 치사로, 덱사메타손 (덱스) -inducible RNAi의 라인은 이전에 게시 된 보고서 (15)에 따라 사용되었다. 여기서 제공 전략은 PD SEL 제어 배축 트로픽 응답에 관련되는 유전자를 선별하도록 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)</td> <td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>symplasmic tracer로서의 형광 염료</td></tr><tr><td>LE</td><td>Agarose Dongin-Genomic</td><td>GEL001-500G</td><td>HPTS agarose 블록</td></tr><tr><td>전자 레인지</td>에 사용 <td>LG-Goldstar</td><td></td><td>끓는 아가로 젤</td></tr><tr><td>100ml 유리 원뿔형 플라스크</td><td>Dong Kwang</td><td>A0205</td><td>HPTS 아가 로스를 끓이는 데 사용 젤</td></tr><tr><td>페트리 접시 (35 mm x 10 mm)</td><td>SPL 생명 과학</td><td>SPL10035</td><td>HPTS 아가로스 블록을 만들고 식물 샘플을 세척하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 커버 슬라이드 및 유리 슬라이드 (24mm x 50mm)</td> <td>Marienfeld Laboratory 유리 제품</td><td>101222</td><td>HPTS agarose 블록 및 현미경 샘플 준비에 사용</td></tr><tr><td>MS 매체 플레이트 125 mm x 125 mm x 20 mm</td><td>SPL 생명 과학</td><td>SPL11125</td><td>MS 한천 매체 가위를 만들기 위한 플레이트</td></tr><tr><td></td><td>독일 스테인리스</td><td>HSB 942-11</td><td>식물 샘플</td></tr><tr><td>의 후크 영역을 절제하는 데 사용됩니다.Murashige and Skoog (MS) 기초 염 혼합물</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS 배지 (비타민 포함).</td></tr><tr><td>(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>MS 매체를 만들기 위해.</td></tr><tr><td>식물 한천</td><td>Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>MS 배지를 응고시킵니다.</td></tr><tr><td>오토 클레이브</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>셰이커</td><td>와이즈 믹스</td><td>SHO-1D</td><td>아닐린 블루 염색 완충액과 HPTS 염료를 차분하게 씻어 냅니다.</td></tr><tr><td>1ml 블루 팁</td><td>Sorenson</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>1ml 피펫</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>MIcropore</td><td>1530-0</td><td>MS 플레이트를 밀봉하기 위해</td></tr><tr><td>아닐린 블루(메틸 블루)</td><td>Sigma</td><td>M5528-25G</td><td>아닐린 블루 염색 완충액을 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>글리신</td><td>바이오샵</td><td>GLN001</td><td>아닐린 블루 염색 완충액을 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DDG</td><td>시그마</td><td>D8375-1G</td><td>칼로스 합성효소의 억제에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>아닐린 블루 염색 및 HPTS 염료 로딩 결과를 확인합니다.</td></tr><tr><td>교반기&nbsp;</td><td>나는 연구실&nbsp;</td><td>K400</td><td>미디어 솔루션을 혼합합니다.</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>SW 쿠킹 포일</td><td></td><td>어두운 상태의 접시를 포장합니다.</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>삼진산업</td><td></td><td>표면 살균된 종자에</td></tr></tbody></table>

전략은 트로픽 응답에 callose 매개 plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

식물 호르몬 옥신 빛과 중력 트로픽 응답을 포함하여 많은 성장과 발달 과정에서 중요한 역할을한다. 옥신 구배의 설립은 굴광성과 굴지성을 선도하는 키 이벤트입니다. 이전에는 극성 옥신 수송 (PAT)는 식물의 다른 세포 도메인에 옥신 그라데이션을 설정 줬습니다. 그러나 한은 외. 최근 적합한 옥신 구배 형성에, 인접 셀 사이 plasmodesmal callose 매개 symplasmic 연결도 중요한 인자임을 보여 주었다. 이 논문에서, 전략 plasmodesmal callose 합성 변조 통해 symplasmic 연결을 변경함으로써 굴광성 및 굴지성에 영향을 미칠 수있는 특정 유전자의 역할을 규명하기 위해 논의된다. 첫 번째 단계는 야생형과 함께 또는 돌연변이 유전자의 과발현 라인 3 일된 etiolated 모종으로부터 벗어난 트로픽 응답들을 선별한다. 이 심사PAT의 기능 또는 symplasmic 연결을 제어하는​​ 유전자의 범위의 식별로 이어질 수 있습니다. 두 번째 심사는 symplasmic 연결에 영향을 미치는 의해 변경 열대 반응을 보여 후보자의 정렬을 포함한다. 이러한 후보를 해결하기 위해, symplasmic 트레이서의 움직임 plasmodesmal callose의 증착을 조사 하였다. 이 전략은 열대 반응과 다른 발달 과정에서 직접 또는 간접적으로 symplasmic 연결을 통제 할 수있는 새로운 후보 유전자를 탐색하는 것이 유용 할 것이다.

동형 접합 gsl8 T-DNA 삽입 돌연변이가 치명적인 18 모종대로 현재 설정에서 AtGSL8의 덱사메타손 (덱스) -inducible RNAi의 라인을 사용 하였다 [(+ 덱스 / -dex)가 dsGSL8을 이하]. dsGSL8 및 ±의 덱스 야생 유형 모종의 3 일 된 etiolated 모종은 phototropic 및 gravitropic 자극에 노출되었다. 우리는 dsGSL8 (+ 덱스) 모종 굴광성과 굴지성 (15)에 결함이있는 것으로 나타났다.도 5를 명확하게 dsGSL8이 (+ 덱스) 더 굴광성과 굴지성 모두의 영향을 받아 굽힘 전시 없다는 것을 보여줍니다. 또한, dsGSL8 (+ 덱스) 및 dsGSL8 (-dex) 또는 골 - 0 sympla...

이 문서에서는 열대 응답 중 plasmodesmal 투과성 때문에 옥신 기울기를 제어하는​​ 유전자를 선별하기위한 방법을 설명합니다. 이것은 배축 트로픽 반응의 정도의 측정을 포함 애기 장대와 8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonic 산 (HPTS)로드 그리고 마지막으로 callose 수준의 평가에 의해 plasmodesmal 투과성을 체크.

전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 굴성 반응 중 칼로스 매개 원형질연락사 게이팅에 관여하는 유전자들을 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 굴성 반응 동안 어떤 미지의 유전자들이 원형질연락사를 통한 세포 간 신호 전달을 조절하는지와 같이 식물 발달 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하며, 효과적이고, 반복 가능하다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 전체 과정 동안 Arabidopsis 황백화된 하배축에 손상을 주지 않고 다루는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 플라스모데스마 게이팅에서 포도당 합성효소인 GSL8의 역할을 규명하던 중 처음으로 이 방법을 고안하게 되었습니다. 오디오에서 언급된 절차만으로는 특별한 설정과 취급이 필요하여 수행하기 까다로운 핵심 단계들을 모두 설명하지 못하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.실험 하루 전 Murashige and Skoog 배지(MS 배지)를 준비합니다. 이를 오토클레이브로 멸균한 후, 125mm 사각 플레이트에 플레이트당 50mL의 배지를 채웁니다. 다음 날, 1.1% sodium hypochlorite로 멸균한 종자를 반건조된 플레이트에 점적하여 배치합니다.1mm 마이크로피펫 팁을 사용하여 종자에 200µL의 물을 점적합니다. 종자를 1.8cm 간격으로 다섯 줄로 배치하며, 각 줄 내의 종자 간격은 최소 0.1cm가 되도록 합니다. 물이 어느 정도 증발하도록 둔 후, 플레이트를 덮고 수술용 테이프로 밀봉합니다.그런 다음 플레이트를 호일로 감싸 상자 안에 넣습니다. 상자를 4 °C에서 3일 동안 배양합니다. 3일간의 저온 처리 후, 종자가 든 상자를 22 °C로 옮겨 3일 동안 둡니다.암실에서 3일을 더 경과시킨 후, 녹색광 하에서 종자의 발아 상태를 확인합니다. 일반적으로 3일 된 Col-0 황백화 묘는 길이가 최대 1.6 centimeters까지 성장합니다. 녹색광 하에서 변화된 굴광성 및 굴중성 반응을 분석합니다.멸균된 픽을 사용하여 곧고 수직으로 성장한 크기가 비슷한 묘목들을 선택합니다. 다른 부분에 닿지 않도록 하이포코틸(hypocotyl)의 가장 낮은 부분에서 묘목을 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음, 선택한 묘목들을 새로운 MS agar 플레이트로 주의 깊게 옮깁니다.새 플레이트에서 유묘의 굽은 부분이 모두 같은 방향을 향하도록 배치하십시오. 각 행을 구성하기 위해 각 유전적 배경당 최소 20개의 유묘를 선택하고, 모든 플레이트를 이중으로 준비하십시오. 각 플레이트에는 두 개의 유전자형이 두 개의 행으로 포함됩니다.굴광성 반응을 확인하려면 묘목이 수직으로 향하도록 플레이트를 검은색 상자에 배치합니다. 상자의 한쪽 면을 플레이트 가장자리까지 개방합니다. 그 후, 단방향 백색광이 조사되는 식물 성장 챔버 내에서 상자를 배양합니다.굴광성 반응을 확인하기 위해, 배양 접시를 호일로 감싼 후 검은색 상자에 넣어 유묘가 수평이 되도록 배치합니다. 보통 90분부터 시작하여 12시간까지 여러 시간 간격으로, 저조도 조건에서 배양 접시를 촬영합니다. 600 DPI JPEG 이미지로 수집하도록 설정된 스캐너를 사용하십시오.유묘의 굴곡각을 측정하려면 ImageJ 소프트웨어에 유묘 이미지를 불러옵니다. 확대 도구를 사용하여 확대하고, 분석할 유묘로 스크롤합니다. 그런 다음 각도 도구를 사용하여 유묘가 굽은 각도를 측정합니다.이를 위해, 원래의 하배축 성장 방향 지점 A를 마우스 왼쪽 버튼으로 더블 클릭한 다음, 굴곡 시작 지점 B까지 마우스를 드래그하십시오. 그다지 왼쪽 클릭을 사용하여 첫 번째 선을 그립니다. 이제 지점 B에서 굴곡 종료 지점인 지점 C까지 마우스를 드래그하고, 왼쪽 클릭을 사용하여 두 번째 선을 그려 각도 A를 형성합니다. 실제 굴곡 각도는 각도 B이며, 이는 180도에서 각도 A를 뺀 값과 같습니다. 이제 키보드의 M을 눌러 각도 A를 측정하고 기록하십시오. 결과 파일이 별도로 열립니다.나머지 묘목들을 측정하기 위해 이전 단계를 반복하고, 데이터 세트 스프레드시트 파일을 사용하여 두 가지 서로 다른 배경의 평균 각도를 측정합니다. 이 분석에 필요한 HPTS 아가로스 블록의 준비 과정은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 식물 샘플 준비부터 시작하십시오.본 예시에서는 원형질연락사(plasmodesmata)의 크기 배제 한계가 변형된 돌연변이체를 분석합니다. 먼저, 분석을 위한 플랫폼을 제작합니다. 새로운 MS 배지 플레이트 위에 현미경 커버 글라스를 놓으십시오.다음으로, 3일 된 황백화 유묘가 있는 MS 플레이트에서 날카로운 수술용 가위를 사용하여 굴곡부 기저면부터 유묘를 조심스럽게 절단하여 커버 글라스로 옮깁니다. 유전적 배경당 최소 5개 이상의 유묘를 옮깁니다. 절단 위치로부터 하배축의 0.5 centimeters만 커버 슬라이드 위에 남고 나머지 하배축은 배지에 닿도록 유묘의 방향을 잡습니다.그런 다음, 절단된 유묘 위에 HPTS 아가로스 블록을 올려 절단된 부위가 HPTS 블록과 접촉하도록 합니다. 접촉이 확실히 되었는지 확인하십시오. 블록을 하배축 위에 5분 동안 그대로 둡니다.그 후, 하위자엽축을 2중 증류수가 담긴 10mm 페트리 접시로 옮기고 15분 동안 흔들어 세척합니다. 다음으로, 세척된 묘목을 슬라이드로 옮깁니다. 직접 비교가 가능하도록 각 돌연변이체를 대조군 옆에 배치하십시오.하배축을 100~150 µL의 이중 증류수로 덮고 커버 슬라이드를 덮습니다. 이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 분석합니다. 이 분석에는 준비한 지 2일이 지나지 않았으며 암소에 보관된 신선한 염료를 사용하십시오.신생 칼로스 합성을 억제하려면 염료에 1.5 millimolar의 2-Deoxy-D-glucose를 첨가하십시오. 굴성 반응 여부에 관계없이 칼로스 염색을 위해 3일 된 황백화 유묘를 선택하여 이 분석을 시작합니다. 얇은 수술용 가위를 사용하여 유묘의 굴곡 부위를 절단하십시오.그런 다음, 이쑤시개 끝을 사용하여 2 mL의 염색 완충액이 담긴 작은 페트리 접시로 묘목을 옮깁니다. 묘목을 염색 완충액에 넣고 30 RPM으로 계속 흔들어주며 암실에서 2시간 동안 배양합니다. 염색 후, 묘목을 2중 증류수로 2분 동안 세척하여 과잉 염색 완충액을 제거합니다.세척 후, 공초점 분석을 위해 각 배경별로 최소 5개 이상의 유묘를 선택합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 칼로스(callose) 신호 강도를 측정합니다. 이미지 소프트웨어에서 이미 JPEG 형식으로 저장된 공초점 현미경 파일을 엽니다.다음으로, 사각형 선택 도구를 사용하여 커서를 이미지 위로 드래그하여 분석할 영역을 선택합니다. 그런 다음 M 키를 눌러 신호 강도의 수치를 측정하고 기록합니다. 결과 파일이 별도로 열립니다. 결과 파일에서 "Mean"이라는 용어는 여러 영역의 평균이 아니라 선택한 영역의 신호 강도를 나타냅니다.이러한 방식으로 각 유묘의 신호를 하나씩 분석합니다. 나머지 유묘들을 측정하기 위해 위의 단계를 반복하고, 데이터 세트 스프레드시트 파일을 사용하여 두 가지 서로 다른 배경의 평균 각도를 측정합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 AtGSL8의 dexamethasone 유도성 RNAi 라인을 분석하였습니다.DsGSL8 유묘는 굴광성과 굴지성에서 뚜렷한 결함을 보였습니다. 이들은 두 가지 힘의 영향 하에서도 굽어짐이 나타나지 않았습니다. 세포질 연통을 통한 이동의 변화를 살펴본 결과, HPTSA 염료의 이동이 대조군보다 dsGSL8 RNAi 넉다운 유묘에서 훨씬 더 광범위하게 일어남을 확인하였습니다.칼로스(Callose)는 원형질연락사 크기 배제 한계의 핵심 조절 인자 중 하나이며, AtGSL8은 알려진 원형질연락사 칼로스 합성효소입니다. 이에 따라, 아닐린 블루를 이용한 칼로스 염색을 수행하였습니다. 대조군에서는 노란색 화살표로 표시된 바와 같이 6시간 후에 칼로스가 축적되었습니다.하지만 6시간 후에도 돌연변이체들은 지속적으로 낮은 원형질연락사 캘로스 수준을 보였습니다. 이러한 캘로스 합성의 부재는 굴광성 반응 후 3시간 만에 측정 가능할 정도로 낮게 나타났습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 순수하게 캘로스를 조절함으로써 굴성 반응에 따른 원형질연락사 게이팅을 제어하는 변이체 내 유전자들을 신속하게 스크리닝하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 Arabidopsis 유묘를 3일간 발아시킨 후 약 6시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 유묘를 옮기는 과정에서 손상을 주지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 로딩 분석 중에 한천(agar)과 하배축(hypocotyl) 사이에 적절한 접촉이 이루어지도록 하는 것이 중요합니다.이러한 발전 이후, 이 기술은 굴성 동안 세포질 연락사를 통한 전도성을 조절하는 데 역할을 하는 유전자, 즉 새로운 유전자들을 탐구할 수 있도록 발달 생물학의 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

이 프로토콜의 목표는 포함 하는 설탕 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 애기 thaliana 묘 cotyledons 클러스터 stomata를 유도 하는 방법 및 엽록체와 같은 세포내 구조를 관찰 하는 방법 그리고 confocal를 사용 하 여 클러스터 된 가드 셀에 microtubules 레이저 현미경 검사 법.

클러스터 Stomata 애기 thaliana 묘에 설탕 솔루션 집중 치료에 의해 위한 유도 시스템

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

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Plasmodiophora brassicae에 대한 유전자 발현 및 생리적 반응의 변화를 시각화하기 위해 투명화와 형광 현미경을 결합

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이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

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배우세요 Arabidopsis thaliana에서 callose 매개 plasmodesmal 게이팅을 이용한 유전자 스크리닝 방법을. 이 기술은 식물 발달 생물학에서 세포 간 신호 전달을 연구하는 데 활용됩니다.

전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

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