Name: 고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T14:00:01.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 HPLC와 흐름 섬광을 결합한 방사성 표지법으로 세포 내 phosphoinositide를 정량화하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 세포생물학 연구에서 정확한 지질 측정에 활용됩니다.

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C.Y.H.는 온타리오 주 정부의 온타리오 대학원 장학금의 지원을 받았습니다. 이 기사는 R.J.B.가 Natural Sciences and Engineering Research Council, Canada Research Chairs Program 및 Ryerson University의 자금 지원을 받아 작성되었습니다.

주 : 텍스트가 아래에서 상세히 효모 PtdInsPs을 측정하는 방법을 설명한다. 이 라벨 효모 3 H-의 미오의 -inositol와 세포 추출 및 deacylating 지질과 분별과 탈아 실화 PtdInsPs을 정량화 할 수있는 HPLC-용출 프로토콜에 대한 실험 세부 정보를 제공합니다. 최적화 및 이상 HPLC-용출 프로파일을 요구하는 포유 동물 세포에서 PtdInsPs의 라벨, 탈아 실화, 해상도 및 정량을 유의하시기 바랍니다. 우리가 토론에서 측면의 일부를 설명하지만이 정보는 다른 곳에서 찾아 볼 수있다. 전반적으로, 방법은 지질, deacylate를 추출 효모가 주어진 그림 1에 도시에서 수용성 촉진제-InsPs를 추출합니다. 효모의 레이블과을 분석 PtdInsPs 1. 프로토콜 <ol><li> 세포 배양 및 방사성 표지 <ol><li> 상수가 완료 합성에서 진탕하면서 30 ℃에서 효모 균주 SEY6210 20 ㎖의 배양액을 성장미드 로그 상 또는 약 600 nm의 0.6-0.7 (OD 600)에서의 광학 밀도 매체. 참고 :이 3 H-미오 -inositol 통합에 영향을 미칠 수 있으므로 YPD 매체를 사용하지 마십시오. 이 배양은 2-3 크기 HPLC 실행을위한 충분한 재료를 제공한다. </li><li> 효모 세포의 10-14 OD 총 펠렛 (12) 용액에 5 분 둥근 바닥 튜브 800 XG에서 원심 분리하여 (OD 600 = 1 1 ml의 문화 ~ 1 × 7 세포가 포함되어 있습니다). 이노시톨없는 배지 (IFM) 2 ㎖로 재현 탁 (IFM 조성물은 표 1 참조). </li><li> 원심 분리를 반복하고 미디어를 대기음. IFM 440 μL와 펠렛을 재현 탁하고, 15 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 각 샘플에 3 H- 미오 -inositol (1 μL = 1 μCi를) 60 μl를 추가하고 일정한 흔들림과 1 시간 3 30 ° C의 성장 온도에서 품어. 주의 : 3 H-의 미오의 -inositol는 방사성 친구입니다적절한 훈련 후 처리해야 리알. 또한, 3 H - 함유 물질과 접촉을 만드는 모든 소모품 적절히 배치되어야하고, 방사성 폐기물로 지정. 주 : 성장 온도가 변경 될 수있는 한 모든 균주는 동일한 온도에서 성장된다 비교되는 바와 같이 필요에 따라. </li><li> 9 % 과염소산 500 μL 및 산 200 μL를 함유하는 미세 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 (500 μL)를 이동시켜 유리 비드를 세척 하였다. 반전에 의해 혼합하고 5 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 10 분 동안 최고 속도로 샘플을 와동과 유리 비드를 피할 겔 로딩 팁을 사용하여 새로운 마이크로 원심 튜브에 해물을 전송. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 펠렛과 뜨는을 대기음. </li><li> 빙냉 100 mM의 EDTA 1 ㎖ 목욕 초음파에 의해 펠렛을 재현 탁. 이전처럼 다시 펠렛. </li></ol></li><li> 탈아 실화 및 추출 <oL&gt; <li> 갓 2.3 ml의 메탄올, 40 % 메틸 아민 1.3 ㎖, 1- 부탄올 0.55 mL 및 물 0.80 mL를 조합함으로써 탈아 실화 시약 5.0 mL로 제조. 혼합 반전. </li><li> EDTA를 대기음 및 물 50 μL에 펠렛을 초음파 처리. </li><li> 탈아 실화 시약 500 μL를 추가하고 혼합 초음파 처리. 20 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 열 블록에 53 ° C에서 50 분 동안 열 지질. 3 시간 또는 O / N을 통해 진공 원심 분리하여 완전히 샘플을 건조시킵니다. <ol><li> 화학 트랩 진공 원심 분리기와 공기를 유입하여 증기의 발생을 방지하기 위해 진공 펌프 사이에 설치되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 욕조 초음파에 의해 물 300 μL와 펠렛을 재현 탁하고 20 분 동안 RT에서 배양한다. 3 시간 또는 O / N 진공 원심 분리하여 샘플을 건조시킵니다. 다시 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 물 450 μL와 펠렛을 sonicate하세요. 이는 추출 동안 성상이다. </li><li> 갓 extractio 10 ㎖를 준비8.0 에틸 에테르의 1- 부탄올 용액, 1.6 ㎖의 에틸 포르 메이트 0.40 ml를 첨가하여 N 시약. 혼합 반전. </li><li> 수성 단계로 추출 시약 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 5 분 최고 속도의 혼합물을 2 분 동안 최고 속도 (18,000 XG)에서 원심 분리하여 층을 분리한다. </li><li> 상부 유기 층, 인터페이스 및 펠렛을 회피하면서 새로운 미세 원심 분리 튜브에 하부 수성층을 모은다. 신선한 추출 시약 회 더 성상의 추출을 반복한다. </li><li> 완전 진공 원심 분리에 의해 수층을 회수 건조​​. 목욕 초음파로 물 50 μL에 펠렛을 분산. </li><li> 6 ml의 폴리에틸렌 섬광 유리 병에 섬광 유체의 4 ml의 각 샘플 2 μl를 추가합니다. 열려있는 창을 사용하여 액체 섬광하여 각 샘플 (CPM)에 카운트의 수를 결정합니다. </li><li> HPLC에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. </li></ol></li><li> 의 분리HPLC에 의해 3 H 글리세로 inositides <ol><li> 탈기 하였다 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터, 초순수로 1 L를 필터링하여 버퍼를 준비한다. </li><li> 물에 1 M 암모늄 인산 (APS, MW 132.06) 1 L의 용액을 완충액 B로 준비 및 인산으로 3.8까지 pH를 조정한다. 탈기 하였다 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터와 인산 암모늄 필터. </li><li> 스프링이 장착 된 250 μL 작은 볼륨 삽입과 유리 병 ㎖로 2 여비에 의해 주입 병을 조립합니다. 1000 만 노출 당 비용 (CPM)를 넣고 55 μL의 총 부피의 물을 추가합니다. 물 55 μL와 빈 유리 병을 준비합니다. </li><li> PTFE / 실리콘 격막이 장착 스크류 캡 바이알 (적색 측이 병의 내측에 접함) 모자. 빈 유리 병을 시작으로 HPLC의 자동 샘플링 트레이에 각각의 병을 놓습니다. </li><li> 버퍼 흐름을 제어 버퍼 및 제어 샘플 injecti을 degasses HPLC 및 관련 소프트웨어를 사용에. 섬광 유량을 조절하는 유량 온라인 신틸 레이터와 관련 소프트웨어를 사용하여 H-3 감쇠 신호를 모니터링. <ol><li> 250mm X 4.6 mm의 크기와 HPLC에 5 μm의 실리카 수지를 함유와 SAX 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용합니다. 오염 물질의 주입을 방지하기 위해 열 가드 컬럼을 갖추게. </li><li> 흐름 신틸 레이터에서 3 H 호환 500 μL 흐름 전지를 설치합니다. 참고 : 분별은 Chemstation 소프트웨어 또는 기타 상업적으로 이용 가능한 HPLC 시스템과 제어 애질런트 1200 무한 시리즈 HPLC 시스템으로 수행 할 수 있습니다. HPLC 용 출제의 흐름은 신틸레이션 로라 소프트웨어 또는 다른 시판 흐름 신틸 또는 호환 소프트웨어에 의해 제어 β-RAM 흐름 신틸으로 행해질 수있다. </li></ol></li><li> 100 % 완충액 A에 1.0 ㎖ / 분의 유속으로 펌프를 초기화 급 </li><li> HPLC에 평형 프로파일을 설정5 5 분간, 100-1%의 B 5 분 100 % B에서 5 분, 1-100 %의 B 1 % 완충액 B : 버퍼 A와 B의 구배 ( &quot;평형 프로토콜&quot;라고 부른다)를 제어하는 분, 20 분, 1 % B. 바 (400), 1.0 ㎖ / 분 유속, 30 분 실행 시간에 압력 한계를 설정한다. </li><li> 버퍼 A와 B의 구배 (이 &quot;프로토콜&quot;을 호출) 제어 HPLC에 용출 프로필 (도 2)를 설정 : 40 분 동안 5 분 내지 20 %의 B 1 % B를 20~100% 10 분, 20 분, 1 %의 B 5 분 100-1% B의 10 분, 100 % B를위한 B. 400 바, 1.0 ml / min 유속 및 90 분 실행 시간에 압력 한계를 설정한다. </li><li> 유동 신틸 레이터에 검출 프로토콜 2.5 ㎖ / 분의 신틸레이션 유체 유량 및 8.57 초의 지속 시간으로, 60 분 동안 실행 (이것은 &quot;프로토콜 검출&quot;전화)를 설정한다. </li><li> 전자 다음에 물을 비워 &quot;프로토콜 평형&quot;로 시작하는 HPLC에 자동 주입 순서를 프로그램ACH는 &quot;의정서&quot;에 샘플을 방사성 표지. 준비가되면 시퀀스를 초기화합니다. </li><li> 실행이 평형 프로토콜에있는 동안,와 모든 샘플 측정하는 흐름 신틸 레이터에 배치 만들기 &quot;프로토콜 탐지를.&quot; 시작 유동 신틸 트리거링 동안 각각의 새로운 샘플의 주입은 HPLC의 &quot;프로토콜&quot;를 초기화한다 &quot;검출 프로토콜.&quot; </li><li> 모든 실행의 완료시, HPLC 칼럼을 세척하고 1.0 ㎖ / 분의 유속으로 30 분 동안 100 % 완충액으로 신틸 흐름. </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 로라 소프트웨어 또는 크로마토 그래피의 스펙트럼을 정량화 할 수있는 다른 소프트웨어를 사용합니다. 이 절에서 설명하는 단계는 그림 3에 묘사되어있다. </li><li> &quot;파일&quot;, &quot;열기&quot;를 클릭하여 파일을 열고 각 샘플에 대한 원시 데이터 파일을 선택합니다. </li><li> &quot;크로마토 그램&quot;탭에서, ZO엄마의 작은 봉우리 (약 1000 카운트 [y 축]) 시간 해상도를 유지하면서 각각의 스트레칭. 필요한 경우 각 피크로 확대합니다. </li><li> &quot;투자 수익 (ROI)을 추가&quot;도구를 사용하여 분석을 위해 각 피크를 강조 표시합니다. (4,5을 29 분에서 20 분, 촉진제 - 인 (3,5) P 2시 18 분, 촉진제-Ins4P에서 10 분, 촉진제-Ins3P에서 부모의 촉진제-기능을하고 그로 - 인 : 용출의 시간에 피크를 확인 32 분에서) P 2. </li><li> &quot;지역 테이블&quot;탭에서 각 피크의 &quot;영역 (카운트)&quot;을 기록합니다. 시간과 &quot;끝 (MM : SS)&quot;각 피크의 시간 : &quot;(SS MM) 시작&quot;을합니다. </li><li> 배경 차감을 위해, 동일한 시간에 걸친 피크에 인접한 영역을 강조. 해당 피크에서 카운트의 수를 뺍니다. </li><li> ( &quot;총 PtdIns의 %&quot;로 표시) 부모의 촉진제 - 인에 대한 각 피크의 면적을 정상화. 그리고, &quot;N으로 표시 제어 조건에 대하여, 각 실험 조건 (상기 각 피크를 정상화-fold 증가) &quot;대조군에 비해. 참고 : 각 피크의 정상화는 총 개수에 대해 수행 할 수 있지만, 부모의 촉진제-기능이 훨씬 더 풍부 다른 모든 PtdInsPs보다 이후 결과는 유사한 경​​향이있다. </li><li> &quot;... 다른 이름으로 저장&quot;, &quot;파일&quot;을 눌러 크로마토 그래프에 대한 데이터를 내보내기를 선택 파일 형식 &quot;을 CSV (쉼표로 구분)&quot;. 스프레드 시트의 데이터를 플롯하고 필요에 따라 제시한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 문서에서는 효모에서 HPLC 결합 흐름 섬광에 의해 PtdnsPs의 세포 수준을 정량화하는 데 필요한 실험 프로토콜을 자세히 설명합니다. 방법론은 지질 처리 및 수용성 H-3-InsPs 촉진제, HPLC 분획의 추출 및 분석 하였다 3 H-의 미오의 -inositol와 PtdInsPs의 대사 라벨링을 가능하게한다. PtdIns (3,5) 야생형, vac14 D와 atg18의 D 효모 세포 (그림 4)에서 P 2 도시 된 바와 같이이 방법을 사용하여, 다양한 조건 하에서 세포에서 PtdInsPs의 상대적 수준은 정량화 할 수있다. 결과를 최적화 및 / 또는 문제를 해결하기 위해 수행 될 수있는 중요한 단계 및 변형들이있다. PtdInsPs 신뢰성 정량을 달성하기위한 가장 중요한 파라미터 중 하나는 총 방사능 신호 레벨이다. 일반적으로 HP...

Phosphoinositides (PtdInsPs)는 신호 전달, 막 수송 및 유전자 발현을 포함한 다양한 세포 기능을 조절하는 데 도움이 되는 중요한 신호 인지질이며, 이는 세포 분열, 세포 기관 정체성 및 대사 활동과 같은 고차 세포 행동을 조절합니다1-3. PtdInsP에는 모 인지질인 포스파티딜이노시톨(PtdIns)의 이노시톨 머리 그룹의 3, 4 및/또는 5개 위치의 인산화에서 파생된 7가지 종류가 있습니다. 중요한 것은 7개의 PtdInsP가 불균등하게 분포되어 있고 각 PtdInsP 종의 국소 농도는 특정 세포 내 부위에서 증가하거나 감소할 수 있으며, 여기서 이들은 별개의 단백질 효과기 세트에 결합하여 각 PtdInsP가 숙주 막의 정체성과 기능을 제어할 수 있도록 합니다3,4. 또한 PtdInsP에 의해 생성된 신호 강도에 큰 영향을 줄 수 있으므로 각 PtdInsP의 수준을 엄격하게 제어해야 합니다. 각 PtdInsP의 국소화 및 수준은 각 PtdInsP의 합성 및 회전을 매개하는 수많은 지질 키나아제, 인산가수분해효소 및 인산리파제의 표적화 및 활성에 따라 달라집니다3,4. 따라서 PtdInsP 조절 기전의 잘못된 조절은 세포 기능을 교란시켜 암 및 퇴행성 질환과 같은 질병을 유발할 수 있습니다2,5,6. PtdInsP의 역할과 기능 및 조절 기계를 완전히 이해하기 위해 현미경 기반 및 생화학 기반 기술을 모두 개발하여 PtdInsPs를 추적하고 정량화했습니다. 
많은 경우, PtdInsP는 특정 단백질 도메인7-9를 통해 단백질 효과기에 결합합니다. 이러한 단백질 모듈은 전체 단백질과 별도로 발현될 때 적절한 fold 및 lipid 인식 특성을 유지하는 경우가 많습니다. 이것은 현미경 검사에 의한 PtdInsP의 세포 내 검출을 위해 특정 PtdInsP 결합 단백질 도메인을 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질(FP)에 융합하여 PtdInsP 프로브를 생성했습니다. 실제로, 많은 연구에서 FP 융합 PtdInsP 결합 단백질 모듈을 사용하여 라이브 셀 이미징을 통해 특정 PtdInsP 종의 국소화 및 역학을 확인했습니다1,10. 예를 들어, GFP에 융합된 포스포리파제 C δ1(PLCδ1)의 Pleckstrin 상동성(PH) 도메인은 원형질막에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트[PtdIns(4,5)P2]를 특이적으로 인식하는 반면, 초기 엔도솜 항원 1(EEA1)의 FYVE 도메인의 탠덤 사본은 엔도솜10-13에서 포스파티딜이노시톨-3-포스페이트(PtdIns3P)를 추적하는 데 사용되었습니다. 전반적으로 현미경 기반 기술은 PtdInsP 국소화 및 역학을 시각화하는 데 유용하지만, PtdInsP 결합 도메인이 표적 PtdInsP 종 이외의 추가 요인과도 상호 작용할 수 있으며 FP 프로브의 세포질 형광 미만의 변화를 감지할 수 없다는 등 몇 가지 주의 사항이 있습니다.
박층 크로마토그래피, 질량 분석법 및 방사성 동위원소 라벨링을 포함한 생화학 기술을 사용하여 각 PtdInsP14-16의 수준을 특성화하고 정량화할 수도 있습니다. 이러한 방법은 PtdInsPs의 세포 수준을 검출하기 위해 지질을 분리해야 합니다. 질량 분석법은 지질 추출물의 인지질을 특성화하는 데 사용할 수 있으며 PtdInsPs14,17의 아실 사슬 조성을 결정하는 데 매우 중요합니다. 그러나 질량 분석법은 대부분 반 정량적이며 동일한 분자량14,17의 PtdInsP 종을 분석하고 동시에 정량화하는 것은 여전히 어렵습니다. 이에 비해 PtdInsPs의 방사성 동위원소 표지 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 결합 유동 섬광은 PtdInsPs18의 7개 종 모두의 분리 및 동시 정량화에 유용합니다. 강력한 음이온 교환(SAX) 컬럼과 함께 HPLC를 사용하면 분자량, 전하 및 모양에 따라 분리가 가능하므로 동일한 분자량과 전하에서도 탈아실화된 PtdInsPs(Gro-InsPs)를 분별할 수 있습니다. 그런 다음 HPLC 용리액을 유동 신틸레이터에 연결하면 원래 모체인 글리세롤-이노시톨(Gro-Ins)을 기준으로 각 Gro-InsPs 종에 대한 방사성 기반 신호 피크가 생성됩니다(18). 이것은 궁극적으로 세포 내 PtdInsPs의 상대적 수준에 해당합니다.
PtdInsP 및 HPLC 결합 유동 섬광의 방사성 표지는 PtdIns16,19,20의 ~0.1-0.3%만 구성하는 PtdInsP인 포스파티딜이노시톨 3,5-비스포스페이트[PtdIns(3,5)P2]의 조절 및 기능을 조사하는 데 유용한 도구입니다. PtdIns(3,5)P2 의 합성은 효모에서 Fab1 및 포유류21에서 PIKfyve 라고 하는 PtdIns3P 5-kinase에 의해 수행됩니다. 이 반응은 효모의 Fig4 또는 포유류22-24의 mFig4/Sac3이라고 하는 PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase에 의해 중화됩니다. 흥미롭게도, PIKfyve/Fab1 및 mFig4/Fig4/Sac3은 모두 단일 복합체에 존재하며 비계 어댑터 단백질, 효모의 Vac14 또는 포유류25,26의 mVac14/ArPIKfyve에 의해 조절됩니다. VAC14 결실 효모 세포에서 Fab1은 효율적으로 기능하지 않아 PtdIns(3,5)P2 수준27,28이 90% 감소합니다. 한편, Atg18은 액포 분열 29를 조절할 수 있는 PtdIns(3,5)P2 effector 단백질입니다. Atg18은 또한 유전자 ATG18의 결실로 인해 PtdIns(3,5)P2 수준29,30이 10-20배 증가하기 때문에 PtdIns(3,5)P2의 음성 조절자이기도 합니다. 전반적으로 PtdIns(3,5)P2 수준의 변화는 효모 액포와 포유류 리소좀의 기능에 심각한 영향을 미치며, 결과적으로 막 이동, 식체 성숙, 자가포식 및 이온 수송과 같은 과정에 영향을 미칩니다 6,19,21,31. 
이 기사에서는 야생형, vac14Δ 및 atg18Δ 효모 균주에서 PtdIns(3,5)P2의 상대적 수준을 검출하기 위해 효모에서 3H-myo-inositol로 PtdInsPs의 방사성 동위원소 표지 과정을 설명합니다. 이를 예로 들면, 개별 PtdInsP의 분리를 위한 HPLC의 분해능과 미량의 3 H-myo-inositol을 검출하기 위한 유동 섬광의 민감도를 보여줍니다. 또한 포유류 세포에서 3개의 H-표지된 PtdInsP를 표지하고 분리하는 방법론을 최적화할 수 있는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1-부탄올</td><td>바이오 베이직</td><td>BC1800</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>인산 암모늄 이염 기성</td><td>Bioshop</td><td>APD001</td><td>ACS 등급</td></tr><tr><td>황산 암모늄</td><td>바이오 염기성</td><td>ADB0060</td><td>울트라 퓨어 급</td></tr><tr><td>자동 샘플러</td><td>애질런트</td><td>G1329B</td><td>애질런트 1260 인피니티 시리즈</td></tr><tr><td>비오틴</td><td>시그마</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>생물 염기성</td><td>BB0044</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>염화 칼슘</td><td>생물 염기성</td><td>CT1330</td><td>무수, 산업 학년</td></tr><tr><td>판토텐산 칼슘</td><td>시그마</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염</td><td>시그마</td><td>451657</td><td>무수</td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>생물 염기성</td><td>GB0219</td><td>무수, 생명 공학 학년</td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 Eagle's Medium</td><td>Life</td><td>11995-065</td><td>4.5 g/L 포도당, 110 mg/L pyruate, L-글루타민</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Eagle's Medium</td><td>MP biomedicals</td><td>변형 0916429&nbsp;</td><td>4.5 g/L 포도당으로, L-글루아트민 없이, 이노시톨 없이</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biobasic</td><td>EB0107</td><td>무산, 초순수 등급</td></tr><tr><td>에틸 에테르</td><td>Caledon labs</td><td>1/10/4700</td><td>무수, 시약 등급</td></tr><tr><td>포름산 에</td><td>틸 시그마</td><td>112682</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td>US 원산지, 프리미엄 품질, 열 비활성화</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 투석</td><td>생활</td><td>26400044</td><td>미국 원산지</td></tr><tr><td>FlowLogic U</td><td>LabLogic Systems Ltd</td><td>SG-BXX-05</td><td>플로우 섬광용 섬광 유체&nbsp;</td></tr><tr><td>엽산</td><td>생물 염기성</td><td>FB0466</td><td>USP 등급</td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td>Life</td><td></td><td>15630080 1 M 용액</td></tr><tr><td>이노시톨, Myo-[2-3H(N)]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET114005MC</td><td>9:1 에탄올 to water</td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민</td><td>Life</td><td>51500056</td><td>100x 용액</td></tr><tr><td>Iron(III) chloride</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td>시약 </td></tr><tr><td>grade Laura - 크로마토그래피 데이터 수집 및 분석 소프트웨어</td><td>LabLogic Systems Ltd</td><td>버전 4.2.1.18</td><td>플로우 신틸레이터 소프트웨어</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G7513</td><td>200&nbsp; mM, 용액, 멸균 여과, BioXtra, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M8266</td><td>무수</td></tr><tr><td>황산 망간</td><td>생물 염기성</td><td>MB0334</td><td>일수화물, ACS 등급</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Caledon labs</td><td>6701-7-40</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>메틸 아민 용액</td><td>시그마</td><td>426466</td><td>40 % (v / v)</td></tr> <tr><td>인산</td> <td>일 칼륨바이오베이직</td><td>PB0445</td><td>무수, ACS 등급</td></tr><tr><td>니코틴산</td><td>바이오베이직</td><td>NB0660</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>OpenLAB CSD ChemStation&nbsp;</td><td>애질런트</td><td>개정판 C.01.03&nbsp;</td><td>HPLC 소프트웨어</td></tr><tr><td>p-aminobenzoic acid (PABA)</td> <td>Bioshop</td><td>PAB001.100</td><td>Free acid</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100X, 액체, 안정화, 멸균 여과, 세포 배양 테스트</td></tr><tr><td>과염소산</td><td>Sigma</td><td>244252</td><td>ACS 시약, 70 %</td></tr> <tr><td>PhenoSpher SAX 컬럼</td><td>Phenomenex</td><td>00G-315-E0</td><td>5 &micro; m, 80 &Aring;, 250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>인산</td><td>Caledon labs</td><td>1/29/8425</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>생물 염기성</td><td>PB0440</td><td>ACS 등급</td></tr><tr><td>요오드화 칼륨</td><td>생물 염기성</td><td>PB0443</td><td>ACS 등급</td></tr><tr><td>피리독신 염산염</td><td>시그마</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>Quaternary 펌프</td><td>애질런트</td><td>G1311C</td><td>애질런트 1260 인피니티 시리즈</td></tr><tr><td>리보플라빈</td><td>Bioshop</td><td>RIB333.100</td><td>USP 등급</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>생물 염기성</td><td>DB0483</td><td>생명 공학 등급</td></tr><tr><td>몰리브덴산 나트륨</td><td>시그마</td><td>243655</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 컬럼 구획</td><td>애질런트</td><td>G1316A</td><td>애질런트 1260 인피니티 시리즈</td></tr><tr><td>티아민 염산염</td><td>시그마</td><td>T4625</td><td>시약 등급; 0.02%(W/V)의 용액을 만들고 현탁액을 형성합니다. 혼합 및 동결 분취</td></tr>액 <tr><td>Ultima Gold</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013321</td><td>Scintillation coctail for liquid scintillation counting</td></tr><tr><td>Zinc sulfate</td><td>Biobasic</td><td>ZB2906</td><td>Heptahydrate, 시약 grade</td></tr><tr><td>&beta;-RAM 4</td><td>IN/US 시스템</td><td>모델 4</td><td>Flow scintillator - 500 &micro; l 플로우 셀; Perkin Elmer의 대체 방사선 흐름 신틸레이터 분석기&nbsp;</td></tr></tbody></table>

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs)는 특정 effector를 모집하고 분자 정체성과 기능을 가진 소기관을 부여하는 필수 신호 지질입니다. 7개의 PtdInsP는 각각 분포와 풍부도가 다르며, 이는 특정 키나아제와 인산가수분해효소에 의해 엄격하게 조절됩니다. PtdInsP의 풍부함은 다양한 신호 전달 이벤트 또는 조절 메커니즘의 교란에 대응하여 갑자기 변할 수 있습니다. 이러한 이벤트가 PtdInsP의 양과 그에 따른 영향의 변화로 이어지는 방법을 이해하려면 신호 이벤트 전후 또는 제어 상태와 비정상 상태 사이의 PtdInsP 수준을 정량화하는 것이 중요합니다. 그러나 풍부도와 유사성이 낮기 때문에 각 PtdInsP의 상대적인 양을 정량화하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 논문은 PtdInsPs에 통합된 3H-myo-inositol로 세포를 대사적으로 표지하여 PtdInsP 수준을 정량화하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 인지질이 침전되고 탈아실화됩니다. 생성된 용해성 3H-글리세로 이노시티드를 추가로 추출하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분리하고 유동 섬광으로 검출합니다. 효모 샘플의 라벨링 및 처리는 물론 HPLC 및 유동 신틸레이터의 기기 설정에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 아실 사슬 함량에 대한 구조적 정보가 손실되었음에도 불구하고 이 방법은 민감하며 세포에서 7개의 PtdInsP를 모두 동시에 정량화하도록 최적화할 수 있습니다.

이 방법을 사용, 효모 PtdInsPs는 대사 3 H-의 미오의 -inositol으로 표시했다. 표지 후, 인지질 및 인지질 탈아 실화 수용성 촉진제-InsPs (도 1)의 추출하여, 과염소산로 침전시켰다. 이 단계에서, 그것은 PtdIns 같은 매우 미량 PtdInsPs에 충분한 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 액체 섬광에 의해 추출 촉진제-InsPs와 관련된 총 방사능 신호를 정량화하는 것이 중요하다 (3,5) P (2); 5-10000000 CPM이 총 분사한다. 효모 세포에만 네 PtdInsPs을 나타내고 있기 때문에 (도 2) 한 바와 같이, 해상도가 1 시간 용출 방법으로 달성 될 수있다. Δ 및 vac14의 Δ 효모 ...

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

본 절차의 전반적인 목표는 다양한 유전적 및 환경적 조건 하의 세포 내 각 포스포이노시티드(phosphoinositide) 종의 양을 측정하여 포스포이노시티드의 기능과 조절을 이해하는 것입니다. 포스포이노시티드 지질은 이동, 복제 및 메모리 트래픽킹과 같은 세포 기능을 제어합니다. 이 방법은 포스포이노시티드에 영향을 미치는 유전적 및 환경적 조건을 식별하고, 이들의 조절과 기능에 대한 지식을 확장합니다.이 기술의 주요 장점은 세포 내의 모든 포스포이노시티드(phosphoinositide)를 정확하고 동시에 측정할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 효모의 포스포이노시티드 조절에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 배양된 포유류 세포에도 적용될 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 사용자는 표지, 처리 및 분석에 필요한 단계가 많기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.방사성 표지를 사용하기 전에 먼저 연습하는 것을 권장합니다. 우선, SEY6210 효모 균주 20 mL를 완전 합성 배지에서 30 °C로 일정하게 흔들어주며 대수 성장 중간 단계(mid-log phase)까지 액체 배양합니다. 그다음, 총 10~14 OD의 효모 세포를 12 mL 라운드 바텀 원심분리관에 옮기고 800 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.배지를 따라냅니다. 그리고 펠릿을 2 milliliters의 이노시톨이 없는 배지에 다시 현탁합니다. 세포를 다시 원심분리합니다.그런 다음 펠렛을 440 µL의 이노시톨 무첨가 배지에 다시 현탁합니다. 세포를 상온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, tritium으로 표지된 myo-inositol 60 µL를 첨가하고 30 °C에서 지속적으로 흔들어주며 1~3시간 동안 세포를 추가로 배양합니다.세포 현탁액을 500 µL의 9% 과염소산과 200 µL의 산 세척 유리 비즈가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 반복적으로 뒤집어 섞은 다음, 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 최대 속도로 10분 동안 튜브를 볼텍싱합니다.그 다음, 유리 비드가 흡입되는 것을 방지하기 위해 젤 로딩 팁을 사용하여 용해물을 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 이어서 튜브를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 1 mL의 얼음처럼 차가운 100 mM EDTA에서 펠렛이 완전히 분산될 때까지 초음파 처리한 후, 다시 원심분리합니다.원심분리 후, 방사성 표지된 펠릿이 포함된 튜브에서 EDTA를 흡입하여 제거합

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이 비디오에서는 정량적 유세포 분석을 사용하여 단백질과 인공 인지질 소포 간의 상호 작용을 보여줍니다. 형광 표지된 단백질이 형광 표지된 인지질 소포에 결합하면 평균 형광 강도가 증가하며, 이러한 증가는 유세포 분석기에 의해 감지됩니다.

표지된 단백질-인지질 소포 상호작용을 연구하기 위한 정량적 유세포 분석

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

여기서는식물에서이노시톨 폴리인산염을 검출하고 정량화하는 매우 민감한...

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

포유류 세포 추출물로부터 이노시톨 피로포스페이트의 절대 정량을 위한 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법을 위한 절차가 설명된다.

모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법에 의한 이노시톨 피로인산염의 절대 정량

여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

정량적 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지 단백질과 인공 인지질 마이크로베시클의 상호작용 분석

배우세요 HPLC와 흐름 섬광을 결합한 방사성 표지법으로 세포 내 phosphoinositide를 정량화하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 세포생물학 연구에서 정확한 지질 측정에 활용됩니다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

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