고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화
January 6th, 2016
Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.
이 절차의 전반적인 목표는 포스포이노시티드의 기능 및 조절을 이해하기 위해 다양한 유전적 및 환경적 조건에서 세포 내 각 포스포이노시티드 종의 양을 측정하는 것입니다. 포스포이노시티드 지질은 이동, 복제 및 메모리 트래피킹과 같은 세포 기능을 제어합니다. 이 방법은 포스포이노시티드에 영향을 미치는 유전적 및 환경적 조건을 식별하고 그 조절 및 기능에 대한 지식을 증가시킵니다.
이 기술의 주요 장점은 세포 내부의 모든 포스포이노시티드를 동시에 정확하게 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 효모의 포스포이노시티드 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 배양된 포유류 세포에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 라벨링, 처리 및 분석에 필요한 많은 단계로 인해 어려움을 겪을 것입니다.
먼저 방사성 라벨 없이 연습하는 것이 좋습니다. 먼저 효모 균주 SEY6210의 20ml 액체 배양액을 섭씨 30도의 완전한 합성 배지에서 중간 로그 단계까지 지속적으로 흔들어 성장시킵니다. 다음으로, 총 10-14 OD의 효모 세포를 12 밀리리터 원형 바닥 원심 분리 튜브로 옮기고 800 배 G로 5 분 동안 원심 분리합니다.
매체를 디캔팅합니다. 그리고 펠릿을 2 밀리리터의 이노시톨이 없는 배지에 다시 현탁시킵니다. 세포를 다시 원심분리하십시오.
그런 다음 펠릿을 440 마이크로 리터의 이노시톨이없는 배지에 다시 현탁시킵니다. 세포를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 60마이크로리터의 트리튬으로 표시된 myo-inositol을 추가하고 지속적인 흔들림으로 섭씨 30도에서 추가로 1-3시간 동안 세포를 성장시킵니다.
세포 현탁액을 500마이크로리터의 9% 과염소산과 200마이크로리터의 산 세척 유리 구슬이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 반복적으로 뒤집어 섞은 다음 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 그 후 10분 동안 최대 속도로 튜브를 소용돌이칩니다.
그런 다음 유리 구슬 흡입을 방지하기 위해 겔 로딩 팁을 사용하여 용해물을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿이 완전히 분산될 때까지 100밀리몰의 EDTA를 얼음처럼 차갑게 1밀리리터에 넣고 초음파 처리한 다음 다시 원심분리합니다.
원심분리 후 방사성 표지된 펠릿이 들어 있는 튜브에서 EDTA를 흡인합니다. 50마이크로리터의 물을 넣고 초음파 처리하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 새로운 탈아실화 시약을 준비합니다.
그런 다음 500 마이크로 리터의 탈아실화 시약을 튜브에 넣고 초음파 처리하여 혼합합니다. 샘플을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 샘플을 섭씨 53도의 가열 블록에 50분 동안 옮깁니다.
그런 다음 샘플을 진공 원심 분리기에 넣고 최소 3시간 동안 건조시킵니다. 300 마이크로 리터의 물에서 초음파 처리하여 펠릿을 다시 현탁시키고 실온에서 20 분 동안 배양합니다. 그런 다음 진공 원심 분리기에서 최소 3시간 동안 샘플을 완전히 건조시킵니다.
건조 후 튜브에 450마이크로리터의 물을 추가하고 펠릿이 완전히 분산될 때까지 초음파 처리하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 새로운 추출 시약을 준비합니다. 300마이크로리터의 추출 시약을 첨가하고 5분 동안 최대 속도로 와류를 일으킵니다.
18000회 G로 튜브를 2분 동안 원심분리하고 바닥 수성층을 새 튜브에 조심스럽게 피펫으로 넣습니다. 다음으로, 진공 원심분리로 최종 수성 분획을 최소 3시간 동안 건조합니다. 그 후, 50 마이크로 리터의 물에서 초음파 처리하여 펠릿을 완전히 분산시키고 샘플을 섭씨 20도에서 보관하십시오.
마지막으로, 6 밀리리터 폴리에틸렌 섬광 바이알에 4 밀리리터의 섬광 유체에 2 마이크로 리터를 첨가하여 샘플의 방사능을 측정합니다. 창문이 열린 액체 섬광 계수기를 사용하여 바이알의 CPM을 기록합니다. 트리튬으로 표지된 글리세로-이노시타이드의 분리를 위해 HPLC 시스템을 설정하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 완충액 A 및 B와 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다.
다음으로, 스프링이 장착된 250마이크로리터 인서트가 장착된 2밀리리터 주입 바이알에 샘플 1,000만 CPM을 로드하고 총 55마이크로리터의 물을 추가합니다. PTFE 실리콘 격막이 장착된 나사 캡으로 바이알을 덮고 유사한 바이알의 물 블랭크와 함께 HPLC 시스템의 자동 샘플링 트레이에 넣습니다. HPLC 시스템의 소프트웨어를 사용하여 용리 프로토콜을 프로그래밍합니다.
1%의 버퍼 B는 5분, 1-20%의 B는 40분, 20-100%의 B는 10분, 100%B는 5분, 100-1%의 B는 20분, 1%의 B는 10분, 10%의 B는 10분이다. 펌프 유량을 90분 동안 분당 1.0밀리리터로 설정하고 압력 한계를 400bar로 설정합니다. 이를 따라 유동 신틸레이터에 감지 프로토콜을 설정하여 60분 동안 작동하고 섬광 유체 유속은 분당 2.5회, 체류 시간은 8.57초입니다.
다음으로, 평형 프로토콜을 실행하는 워터 블랭크로 시작하여 용리 프로토콜에서 무선 라벨링된 샘플이 이어지도록 HPLC에 자동 주입 시퀀스를 프로그래밍합니다. 평형 프로토콜이 완료되기 전에 유동 신틸레이터에 배치 시퀀스를 생성하여 용리 프로토콜에 의해 트리거되는 검출 프로토콜을 사용하여 모든 샘플을 측정합니다. HPLC 데이터를 분석하려면 먼저 크로마토그래프 정량 분석 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 대한 원시 데이터 파일을 엽니다.
Chromatograms 탭에서 확대하여 시간 분해능을 유지하면서 더 작은 피크를 늘립니다. add ROI 도구를 사용하여 분석을 위해 각 피크를 강조 표시한 다음 용리 시간을 기준으로 피크를 식별합니다. regions table 탭을 사용하여 각 피크의 면적을 찾고 기록합니다.
동시에 각 피크의 시작 시간과 종료 시간을 기록해 둡니다. 다음으로, 동일한 시간에 걸쳐 피크에 인접한 영역을 강조 표시하여 각 피크에 대한 배경 빼기를 수행합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 해당 피크의 카운트에서 해당 영역에 대한 카운트 수를 뺍니다.
모체 글리세레이트 이노시톨 피크에 대해 각 피크의 면적을 정규화하고 모체 포스파티딜이노시톨의 백분율로 기록합니다. 그런 다음 제어 조건에 대해 각 실험 조건의 각 피크를 정규화하고 제어 조건에 비해 끝 폴드 증가로 표현합니다. File(파일)과 Save As(다른 이름으로 저장)를 클릭하고 CSV 형식을 선택하여 파일을 내보냅니다.
마지막으로 스프레드시트 프로그램에서 CSV 파일을 열어 데이터를 플롯합니다. 방사선 표지된 효모 포스포이노시티드의 분석은 HPLC에 의해 수행되었습니다. 효모 세포는 포스포이노시티드를 4개만 생성하기 때문에 1시간 이중 그래디언트 용리 방법으로 분리능을 달성할 수 있습니다.
8-9분을 암시하는 글리세레이트된 이노시톨 피크는 다른 모든 인산화된 종의 신호를 무색하게 만들었습니다. 따라서 방사성 신호를 통합하기 전에 다른 피크를 포함하는 트레이스 부분을 확대해야 합니다. 이 HPLC 방법을 사용하여 포스파티딜이노시톨 3, 5-비스포스페이트의 변화에 대해 Wild-type, ATG18 deleted 및 VAC14 deleted yeast strain을 분석했습니다.
ATG18 결실 돌연변이가 포스파티딜이노시톨 3, 5-비스포스페이트를 가장 많이 생성하는 것으로 나타났고, VAC14 결실 돌연변이가 가장 적게 생성되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 특정 효모 균주 또는 세포 유형에 따라 성장 및 라벨링 조건을 최적화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 GFP 융합 바이오센서와 같은 다른 방법을 사용하여 포스포이노시티드 검출을 위한 HPLC 유동 섬광을 보완할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 HPLC 결합 유동 섬광으로 포스포이노시티드를 무선 라벨링, 추출 및 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사능 및 유기 용제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용 및 적절한 교육과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 기사는 3 H-myo-inositol로 세포를 대사적으로 표지하여 세포 내 포스포이노시타이드 풍부도를 측정하는 방법을 제시합니다. 이 기술에는 추출, 탈아실화, 정량화를 위한 고성능 액체 크로마토그래피가 포함됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 생화학
배경
- 포스포이노시타이드는 중요한 신호전달 지질입니다.
- 다양한 자극에 반응하여 그 양이 변합니다.
- 세포 이동 및 메모리 트래피킹 등의 세포 기능에 역할을 합니다.
- 세포 과정에 대한 통찰을 위해서는 그 조절을 이해하는 것이 필수적입니다.
연구 목적
- 다양한 조건에서 포스포이노시타이드 종류를 측정합니다.
- 포스포이노시타이드에 영향을 미치는 유전적 및 환경적 요인을 식별합니다.
- 포스포이노시타이드의 기능 및 조절에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 3 H-myo-inositol로 세포의 대사적 표지.
- 글리세로-이노시타이드의 추출 및 탈아실화.
- 고성능 액체 크로마토그래피를 통한 추출된 지질의 분리.
- 플로우 신틸레이션을 이용한 정량화.
주요 결과
- 세포 내 모든 포스포이노시타이드 종류의 정확한 측정.
- 포스포이노시타이드 수준에 영향을 미치는 조건의 식별.
- 효모 및 포유동물 세포에서 포스포이노시타이드 조절에 대한 통찰.
- 방법의 복잡성 때문에 새로운 사용자에게 잠재적인 어려움.
결론
- 이 방법은 포스포이노시타이드 조절에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.
- 다양한 세포 유형에 적용할 수 있어 그 유용성을 높입니다.
- 추가 연구는 이 기술을 바탕으로 세포 신호전달을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of phosphoinositide species enables mechanistic de-risking in early discovery by linking lipid signaling dynamics to cellular phenotypes such as migration and replication. This method supports target validation by providing quantitative, condition-dependent readouts that clarify pathway involvement and regulatory mechanisms. Concurrent measurement of all seven phosphoinositides enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying how genetic or environmental perturbations affect specific phosphoinositide pools.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for assessing lipid-mediated target engagement across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying conditions that significantly alter phosphoinositide signaling linked to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, HPLC-resolved readouts that enable assay standardization for compound screening in lipid signaling pathways.
- Operational Value: Produces reproducible extraction and deacylation steps suitable for adaptation to high-throughput formats.
- Assay Readiness: Delivers normalized, background-subtracted peak areas that allow direct comparison of phosphoinositide levels between control and treated samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by connecting changes in phosphoinositide abundance to cellular functions like memory trafficking and replication.
- Translational Continuity: Enables cross-species application from yeast to mammalian cells, supporting extrapolation of target validation data.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by quantifying lipid signaling changes that correlate with phenotypic outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis screening to lead optimization, where quantitative lipid signaling data informs target confidence and pathway selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic knockouts or chemical treatments alter specific phosphoinositide species.
- Screening: Enables assay development through standardized extraction, HPLC separation, and flow scintillation detection of radiolabeled glycero-inositides.
- Analytics: Generates peak area data that, after background subtraction and normalization, allows comparison of lipid levels across conditions.
- Translational Research: Connects lipid signaling changes to phenotypic outcomes in disease models, supporting biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for quantifying phosphoinositide dynamics in diverse cell types under varying experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing ambiguity in lipid signaling mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized precipitation, deacylation, extraction, and HPLC-flow scintillation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in phosphoinositide-regulated pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking lipid signaling changes to functional readouts in preclinical systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling, lipid extraction, and HPLC operation.
- Depends on access to scintillation counters, vacuum centrifuges, and HPLC systems with flow scintillation detection.
- Necessitates standardization of labeling duration, cell density, and deacylation conditions across experiments.
- Involves adaptation considerations when transferring from yeast to mammalian cell systems due to differences in lipid metabolism.
- Involves practical limitations including radioactivity safety protocols, multi-day processing time, and loss of acyl chain structural information.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Yeast Cell Culture and Radiolabeling of Phosphoinositides
2:58
Deacylation and Extraction of the Radiolabeled Phosphoinositides
5:14
Separation of Tritium-labeled Glycero-inositides by High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
7:15
Data Analysis
8:55
Results: HPLC Analysis of Radiolabeled Phosphoinositides
9:55
Conclusion
