전자 분무 이온화 질량 분석에 의해 Dicysteinyl Tetrapeptides와 수은 (II)의 복합체 형성에 관한 연구

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 반응 화학량론에서 수은 및 디시스테닐 펩타이드 복합체를 준비하고 전기 분무 이온화 및 오리비트랩 질량 분석법에 의해 형성된 다양한 복합체를 특성화하는 것입니다. 이 방법은 수은 및 티올 화합물의 복잡 경향에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 수은 이온을 격리하기 위한 킬레이트제의 합리적인 설계를 향상시킬 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 단편화가 무시할 수 있는 금속 이온 복합체의 분석을 용이하게 한다는 것입니다.

다른 것들은 뚜렷한 수은 동위원소 분포 패턴을 포함합니다. 전하를 쉽게 할당하고 탠덤 질량 분석법(tandem mass spectrometry)을 통해 중첩되는 피크를 분석할 수 있습니다. 이 방법은 수은 펩타이드 복합체에 대한 통찰력을 제공하지만, 특히 다른 동위원소 형태로 존재하는 금속 이온과 함께 다른 복합체에도 적용할 수 있습니다.

진공 시스템에서 10분 동안 5밀리몰 포름산암모늄 완충액을 가스를 제거하고 아르곤으로 퍼지합니다. 두 번 반복하고 용액을 아르곤 아래에 보관하십시오. 사용 당일에는 사용하기 전에 0.2 미크론 필터를 통해 완충 용액을 여과하십시오.

염화수은 용액을 준비하려면 염화수은 0.2375g의 무게를 잰다. 25 밀리리터의 5 밀리몰 포름산암모늄 완충액에 용해시켜 0.035 몰 수은 용액을 생성합니다. 0.214 밀리리터의 염화수은 용액을 9.785 밀리리터의 5 밀리몰 포름산암모늄 완충액에 첨가하여 0.75 밀리몰 용액을 만듭니다.

생성된 용액을 아르곤 가스로 덮습니다. 다음으로, 225마이크로리터의 5밀리몰 CGGC 원액을 1.275밀리리터의 5밀리몰 포름산암모늄 pH 7.5 완충액에 첨가하여 0.75밀리몰 CGGC 용액을 생성합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 255 마이크로리터의 5 밀리몰라 포름산암모늄 pH 7.5 버퍼를 배치하여 수은과 CGGC 용액의 1 대 0.5 비율을 준비합니다.

그런 다음 30마이크로리터의 0.75밀리몰 염화수은 용액을 튜브에 추가합니다. 10초 동안 용액을 소용돌이치십시오. 그런 다음 15마이크로리터의 0.75밀리몰 CGGC 용액을 튜브에 추가합니다.

용액을 10초 더 소용돌이친 다음 질량 분석기에 주입하기 전에 용액을 10분 동안 그대로 두십시오. ESI 질량분석기(MS)를 준비하려면 100마이크로리터의 보정 표준물질을 500마이크로리터 유리 주사기에 추출합니다. MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓습니다.

튜브를 부착하고 질량 분석기에 주입합니다. 파일 아이콘을 선택하고 파일 이름을 입력하여 실행에 대한 파일 이름을 설정합니다. 데이터 수집 모듈에서 데이터 획득 버튼을 선택하고 150개의 스캔을 수집합니다.

크로마토그램을 분석하여 소프트웨어의 데이터 처리 모듈을 열어 보정 표준을 확인합니다. 그런 다음 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택한 다음 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 크로마토그램의 피크가 표준물질의 질량 대 전하 비율과 상관관계가 있는지 확인합니다.

500마이크로리터의 HPLC 등급 메탄올을 500마이크로리터로 추출한 다음 비커에 분배하여 500마이크로리터 유리 주사기를 세척합니다. 500마이크로리터의 HPLC 등급 메탄올을 유리 주사기에 주입하고 시스템을 세척합니다. 매개 변수를 설정할 소프트웨어의 방법 설정 모듈을 선택하십시오.

스캔 모드 메뉴를 선택하고 분석기 FTMS를 식별한 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 실시간 보기 스펙트럼 페이지의 다양한 아이콘을 클릭하여 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 매개변수를 설정합니다. 버퍼를 실행하려면 500마이크로리터의 500마이크로몰 포름산암모늄 버퍼를 500마이크로리터 유리 주사기에 넣습니다.

MS 펌프의 주사기 크래들에 넣고 튜브를 분리합니다. 튜브를 통해 버퍼를 1-2분 동안 실행합니다. 파일 아이콘을 선택하고 파일 이름을 입력하여 실행에 대한 파일 이름을 설정합니다.

모듈에서 데이터 획득 버튼을 선택하고 150개의 스캔을 수집합니다. 실행 중지 버튼을 클릭하여 150개의 스캔이 수집된 후 수집을 중지합니다. 그런 다음 데이터 브라우저 모듈을 열고 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택한 다음 대화 상자에서 파일을 선택합니다.

483, 683, 1163 및 1363 질량 과충전에서 펩타이드 또는 수은 이온 펩타이드 복합체와 유사한 피크가 없는지 확인합니다. 250마이크로리터의 시료를 주사기에 넣어 1-0.5 수은과 CGGC 비율 용액을 실행합니다. 주사기를 MS 펌프의 주사기 크래들에 놓습니다.

튜브를 부착하고 장치를 프라이밍합니다. 150개의 데이터 스캔을 획득하고 브라우저 모듈을 열고 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택합니다. 그런 다음 대화 상자에서 파일을 선택합니다.

크로마토그램에 CGGC 펩타이드 단독에 대한 피크를 포함하여 피크가 포함되어 있는지 확인합니다. 이 절차의 중요한 측면은 각 반응 혼합물 분석 전에 이전 실행의 분석물을 완전히 제거하는 것입니다. 캐리오버 분석물질로 인한 시료 오염을 최소화하려면 주입 라인을 철저히 세척할 수 있습니다.

500마이크로리터의 포름산암모늄 완충액으로 흡입하여 주사기를 세척한 다음 완충액을 비커에 분배합니다. 그런 다음 MS의 waste 버튼을 선택하고 500마이크로리터의 포름산암모늄 완충액으로 튜브를 세 번 세척합니다. 500마이크로리터의 메탄올을 흡입하고 비커에 분배하여 주사기를 추가로 세척합니다.

튜브를 500마이크로리터의 메탄올로 한 번 세척합니다. 그런 다음 MS에서 부하 감지기 버튼을 선택합니다. 주사기에 500마이크로리터의 포름산암모늄 완충액을 첨가한 후 주사기를 MS 펌프의 주사기 크래들에 놓습니다. 튜브를 부착하고 장치를 프라이밍합니다.

이전과 같이 버퍼 실행의 파일 이름을 선택하고 실행 중지 버튼을 클릭하기 전에 150개의 스캔을 획득합니다. 데이터 브라우저 모듈을 열어 크로마토그램에 이전 mercury to CGGC 실행의 피크가 없는지 확인합니다. 나머지 CGGC 샘플에 대해 분석 절차를 반복합니다.

CEEC 용액에 대한 수은을 1 대 0.5 비율로 준비하려면 255마이크로리터의 5밀리몰 포름산암모늄 pH 7.5 완충액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 30마이크로리터의 0.75밀리몰 염화수은 용액을 튜브에 추가합니다. 용액을 10초 동안 볼텍싱한 후 15마이크로리터의 0.75밀리몰 CEEC 용액을 튜브에 추가합니다.

용액을 10초 더 소용돌이치십시오. 그리고 질량 분석기를 주입하기 전에 용액을 10분 동안 그대로 두십시오. CEEC 샘플과 수은 이온 및 CEEC의 반응 혼합물을 사용하여 분석 절차를 반복합니다.

대표적인 질량 스펙트럼이 표시됩니다. 10분 후, 1 내지 0.5 수은과 CGGC 반응 혼합물에서 다양한 유형의 수은 펩타이드 복합체를 볼 수 있으며, 펩타이드 피크는 339.08, 펩타이드 이량체는 677.15입니다. 이전 스펙트럼에서 관찰된 바와 같이, 일대일 수은과 CGGC 반응 혼합물에는 몇 가지 유사한 피크가 포함되어 있습니다.

예를 들어, 피크 539.03은 수은과 펩타이드의 일대일 복합체를 나타냅니다. 확대된 보기는 자연적으로 발생하는 7개의 주요 수은 동위원소에 해당하는 시그니처 수은 동위원소 패턴을 보여줍니다. 또한 수은 디시스테닐 트리펩타이드에 대해 이전에 보고된 바와 같이 CGGC 복합체에 대한 1-2개의 수은이 관찰되었습니다.

이 복합체는 수은과 CGGC의 세 가지 반응 혼합물 모두에서 나타납니다. 그것은 877에서 단일 동위원소 피크를 가진 뚜렷한 수은 동위원소 패턴에 의해 쉽게 분석되었습니다. 그러나, 수은이 과잉인 경우, 1 내지 0.5 수은 대 CGGC 반응 혼합물에서와 같이, 추가로 2 내지 2 수은 대 CGGC 복합체가 검출된다.

이 수은 동위원소 서명은 chem cal 프로그램을 사용하여 계산된 두 개의 수은 복합체에 해당합니다. 이론적으로 양성자화된 단동위원소 질량은 관측된 동위원소 클러스터의 9번째 피크인 질량 과충전 값 1077에 해당합니다. CEEC 복합체에 대한 다양한 수은을 보여주는 대표적인 스펙트럼이 도시되어 있습니다.

흥미로운 것은 수은과 CEEC 부가물과 관련된 중첩 피크가 883에서 단일 동위원소 피크를 보여주는 플러스 1 전하입니다. 그리고 플러스 2 전하에서 계산 된 단일 동위 원소 피크 값은 1765입니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행한다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 캐리오버 분석물을 방지하기 위해 버퍼의 가스를 제거하고 라인을 철저히 헹구는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 양성자, 탄소-13 및 수은-199 핵 자기 공명 분광법 또는 전위차 측정법과 같은 다른 방법을 사용하여 용액 단계에서 내용물 복합체를 보다 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전기 분무 이온화와 함께 orbitrap 질량 분석법을 사용하여 다양한 수은 복합체와 고유한 수은 동위원소 분포 패턴 및 전하 형성을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 탠덤 MS 분석을 통해 중첩된 피크를 구별할 수 있습니다.

수은 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.