의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 성충 파리의 메노 감각에 영향을 미치는 돌연변이를 테스트하는 것입니다. 이 방법은 메노 민감 채널의 식별과 같은 메노 감각 분야의 핵심 질문을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 모자이크 동물을 사용함으로써 유기체에 치명적일 수 있는 돌연변이를 선별할 수 있다는 것입니다.

모자이크 스크린을 사용함으로써, 우리는 보다 전통적인 행동 스크린에서 놓쳤을 수 있는 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 행동 테스트 단계는 배우기 어렵습니다.

관련 칫솔모를 식별하기 위해서는 꾸준한 손과 연습이 필요합니다. 실험을 시작하려면 옥수수 가루 당밀 배지에 파리를 유지하고 인큐베이터에 보관하십시오. 필요한 유전 요소를 포함하는 마쿰 준비 스톡에서 처녀 암컷을 얻습니다.

마쿰 준비 처녀 암컷을 관심 돌연변이와 해당 FRT 부위를 포함하는 수컷으로 교차합니다. 다음으로, 동일한 FRT 부위를 포함하지만 돌연변이가 없는 수컷 파리를 사용하여 두 번째 제어 교배를 설정합니다. 암컷 5마리 대 수컷 1마리의 비율로, 파리가 적어도 하룻밤 동안 짝짓기를 할 수 있도록 한 후, 성체를 새로운 배지가 있는 새 유리병으로 옮깁니다.

파리가 어두운 캐비닛에 실온에서 알을 낳도록 하십시오. 파리가 알을 낳으면 십자가를 새 유리병으로 옮깁니다. 알을 낳는 기간의 시작 시간과 종료 시간을 문서화합니다.

열 충격을 위해 20개 이상의 알이 나오는 바이알을 보관하고 인큐베이터에 다시 넣습니다.알을 낳은 후 85시간에서 100시간 후에 바이알을 수조에 넣고 수위가 매체 높이보다 높지만 바이알이 완전히 잠기지 않는지 확인합니다. 1시간 후 수조에서 바이알을 꺼내고 파리가 회복할 수 있도록 합니다.

회수 후 바이알을 다시 수조에 1시간 동안 넣습니다. 수조에서 바이알을 꺼내 마취 후 인큐베이터에 다시 보관하십시오. 얼음 위의 파리.

파리가 움직이지 않으면 원하는 모든 특성을 포함하는 개체를 선택하십시오. 다음으로, 홍채 절제술 가위로 선택한 파리의 목을 조심스럽게 자르고 가위를 머리와 흉부 사이에 조심스럽게 놓습니다. 흉부에 흠집을 내지 않고 연결을 끊습니다.

머리 없는 파리를 폐쇄적이고 습한 환경에 놓고 회복 후 10-20시간 동안 회복할 수 있도록 합니다. 검사를 위해 파리를 회수하십시오. 스스로 쓰는 파리만 사용하십시오.

교란되었을 때, 형광 해부 현미경으로 목이 잘린 파리를 관찰하여 GFP로 표시된 동형접합 클론을 식별합니다. 강모 외부 감각 기관에서. 강모 이름을 기록하고 파리의 왼쪽인지 오른쪽에 있는지 여부에 관계없이 뻣뻣한 머리나 가는 집게로 GFP로 표시된 강모를 파리 몸통 쪽으로 편향시켜 그루밍 반사를 이끌어내고 다리 반응을 관찰합니다.

강모 자극에 반응하여 다리를 들어 올리는 파리에 대한 부비동 점수는 1이고 다리를 움직이지 않는 파리에 대한 부비동 점수는 0입니다. 가능한 경우. 우리는 AOR 강모 후 행동 분석을 사용하여 자극에 잘 반응하는 AOR 강모에 모자이크 조직이 있는 파리를 테스트했으며, 유형 파리를 알려진 메카노 민감 돌연변이체와 비교했으며, 메카노 수용체 전위 C 또는 NMSI가 그루밍 반응을 방해하지 않았으며 대조 파리는 강모 자극의 34%에 반응했습니다.

대조적으로, NMSI에 대해 동형접합적인 강모를 가진 동물은 2%의 반응을 보였습니다. 이 절차와 새로운 행동 반응 유전자의 확인에 따라 전기 생리학 및 단백질 국소화와 같은 추가 실험을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 유전자의 역할을 더 자세히 규명하기 위해 유전자가 메노 감각 전달에 관여하는지 아니면 메노스 감각 뉴런의 발달에 관여하는지에 대한 질문에 답할 수 있습니다.