Name: 의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반 초파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 학습하세요 Drosophila의 기계수용에 영향을 미치는 돌연변이를 MARCM 모자이크 방법으로 행동 분석하는 기법을. 이 방법은 치명적 돌연변이를 선별하여 감각 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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하고 싶은 저자는 블루밍턴 재고 센터, Liqun 루오, 찰스 Zuker, 그리고 릴리와 여운 Nung 월 플라이 주식의 관대 한 공유 및 자금 조달을 위해 다음과 감사 : 학사 포드 학부 여름 원정대 (JD 및 SW에) SOMAS-URM (SW에), 르네와 앤서니 M. 말론, MD (DL에) 63 여름 연구 활동 (CL과 DL에) BD 회사 여름 연구 활동 제임스 &#39;75 제인 Colihan 여름 연구 활동 (TO)를 통해 동창 / 홀리 크로스 대학의 부모 여름 연구 기금 (IMF)과 Stransky 재단 여름 연구 활동 (TO)이다. 실험실에서 모든 작업의​​ 지원을위한 거룩한 십자가의 대학에서 생물학과 및 학장의 사무실에 특별 감사합니다.

1. 십자가는 MARCM의 파리를 생성하려면 <ol><li> 22도 섭씨 또는 표준 초파리 미디어 옥수수 가루 당밀 미디어 (0.13 % Tegosept, 23.5 G / L 효모, 60g / L의 옥수수 가루 60 ㎖ / L 당밀, 4 ㎖ / L 산 믹스 6.5 g /의 L 한천)에 파리를 유지 12 시간 빛 / 어둠주기. 참고 : 표준 온도보다 낮은 건강 MARCM-주식을 유지하는 데 사용됩니다. 이 14 일에 계란과 성인 사이의 개발 시간을 연장한다. </li><li> 상류 활성화 서열 (UAS-GFP) Gal80 리프레 서 단백질, GAL4 전사 인자의 제어하에 (GFP를 필요한 유전자 요소를 함유 MARCM 준비 스톡에서 - (8 일 오래 대략 1) 버진 암컷을 사용 열충격 종동 네이즈 및 FRT 재조합 부위). 참고 : 우리의 MARCM 준비 주식은 다음과 같은 유전자형 포함 : elavGal4, UAS-CD8 - GFP, HS-flipase을; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb. 주 : 특정 FRT 부위가 돌연변이의 위치에 의존 할 것이다게놈. 예를 들어, FRT40A는 NOMPC (MARCM 프로토콜에 대한 자세한 내용은 10 참조)와 같은 염색체 2의 왼쪽 팔에 돌연변이를 테스트하는 데 사용됩니다. </li><li> 관심의 돌연변이와 해당 FRT 사이트가 포함되어 남성에 대한 상호 MARCM 준비 처녀 여성 (; NOMPC3, FRT40A / CYO 예를 들어, W-를 + / +). 효과적인 MARCM 유도 제어하기 위해, 동일한 FRT 부위를 포함하는 남성 초파리를 이용한 제 2 단면을 설정하지만, 돌연변이없이. 십자가에서 1 남성 : 5 여성의 대략적인 비율을 사용합니다. </li></ol> 레이아웃 2. 시간 제한 계란 <ol><li> 파리는 적어도 하룻밤 짝을 할 수 있도록 한 후, 새로운 미디어와 새로운 유리 병으로 성인 이동합니다. 파리 다시 새로운 유리 병에 십자가를 전송하기 전에 약 4 시간 동안 어두운 환경에서 알을 낳기하도록 허용합니다. 달걀 누워 기간의 시작 시간과 종료 시간을합니다. 참고 : 4 시간의 interva이 끝나기 전에 미디어에 계란의 높은 수있을 나타날 때 짧은 간격 허용엘. <ol><li> 열이 나중에 충격으로 섭씨 22도에서 12 시간의 빛 / 어둠주기에 충분한 계란의 수 (약보다 큰 20) 및 저장소와 튜브를 유지합니다. 참고 : 성인이 그들이 더 테스트를 유지하지 않는 것이 좋습니다 행동 테스트 및 효율성의 이익 파리의 미디어에 계란의 수가 적은 튜브를 (이하 20 정도 이상이) 충분한 숫자를 양보하지 않을 수 있습니다. 참고 : 우리의 파리는 오전 8시에서 오후 8시까지에 조명과 함께 발생합니다. 오후 8시 8 PM-자정 - 우리는 포인트 높은 계란 밀도로 이어질 저녁 시간, 따라서 보통 4 사이에 시간 제한 십자가를 수행을 발견했다. 인큐베이터에서 일반 명암주기를 방해하지 않도록 파리는 다음날 인큐베이터로 돌아갑니다 다음 어두운 캐비닛에 실온에서 알을 낳고. </li></ol></li></ol> 3. 유사 분열 재조합을 유도하는 열 충격을 수행 <ol><li> 약 85 - 달걀 누워 후 100 시간, 장소 V1 시간 동안 섭씨 37도에서 물 중탕으로 IALS. 수위가 유리 병에 미디어의 높이 이상에 도달 할 수 있지만 완전히 익사에서 유충을 방지하기 위해 튜브를 잠수함하지 않도록하십시오. </li><li> 수조에서 튜브를 제거하고 실온에서 1 시간의 회복 기간을 허용합니다. </li><li> 다시 37도 섭씨 물을 욕조에 1 시간 동안 장소 유리 병. </li><li> 우화까지 22 섭씨 온도에서 12 시간의 빛 / 어둠주기에 인큐베이터에서 물 목욕 및 저장소에서 튜브를 제거합니다. </li></ol> 행동 테스트 4. 준비 <ol><li> 우화 후, 얼음에 파리를 마취. MARCM에 대한 모든 유전 적 요소를 포함하고 GFP 발현 마크 클론 가능성이 상위 종목에 사용되는 관찰 표현형 마커를 기반으로 관찰됩니다 나타내는 유전자형과 파리를 선택합니다. 홍채 절제술 가위 파리 목을 벨. 참고 : 예를 들어, 우리는 유전자 마커없이 파리에 대한 CYO (곱슬 날개)와 Sb를 (그루터기 다름) 식별자로 선택모자이크 영역을 만드는 데 필요한 모든 유전 적 요소를 포함 할 것 년도 파리는 GFP 표시. 참고 : 목 베기 자극 할 때 날아에서 성인을 방지 할 필요가있다. </li><li> 폐쇄, 습한 환경에서 헤드리스 파리를 놓고 약 10 수 - 복구의 20 시간을. 만 사용 바로 자신하는 것은 더 테스트를 위해 교란 때 파리. 테스트 잘린 30 시간 내 날아간다. </li></ol> 5. 행동 테스트 <ol><li> 형광 해부 현미경으로 해고 파리를 관찰함으로써, 강모 외부 감각 기관에서 GFP 표시 동형 접합 클론을 식별합니다. 강모 이름과 왼쪽이나 오른쪽을 기록한다. 잠재적 인 편견을 제거하기 위해 강모 자극을 수행 랩 부재는 강모, 야생형 또는 돌연변이 체의 유전형을 블라인드이어야한다. </li><li> 뻣뻣한 머리카락이나 미세 집게로 비행 몸으로 모 GFP를 편향에 의해 손질 반사를 표시된 유도하고, 다리를 다시 관찰sponse. 자극과 자신의 다리를 움직이지 않는 파리에 0의 점수 강모에 대한 응답으로 자신의 다리를 들어 파리에 하나의 점수를 제공합니다. 주 : 이전 연구 6,7 특정 칫솔모를 자극하여 유발되어 다리 응답을 특징으로하고있다. 이 각각 다름에 응답하는 다리와 특정 강모의 자극에 반응 파리의 비율을 포함한다. 우리는 우리가 Vandervorst의 분류 (6)을 기반으로 대응할 것으로 예상되는 다리의 움직임습니다. </li><li> 떨어져 2 분 간격으로 다섯 시험을 실시한다. </li></ol>

<ol><li>Grünert, U., Gnatzy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+and+Ca%2B%2B+in+the+receptor+lymph+of+arthropod+cuticular+mechanoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).</li>
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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

돌연변이의 컬렉션 성인 선별 곤란할 것 치명적인 P 요소 돌연변이가 포함되어 있기 때문에이 프로토콜은이 프로토콜은 먼저 리와 루오 설명 복잡한 유전 적 기술을 사용한다. 초파리 mechanosensation에 영향을 미치는 돌연변이 선별 성인 행동 분석을 활용 (1999) 성인 치사를 회피 우와 루오로 프로토콜, (2006) 등의 상세한. MARCM은 동형 접합 세포의 클론 영역을 생성하는 상동 염색체 사이의 유사 분열 재조합을 유도한다. 이 영역은 때문에 유사 분열 재조합 동안 발생 리프레 서 단백질, 욕조 - GAL80의 손실 GFP로 표시되어 있습니다. 특정 유전자 유전자좌에서 동형 접합체 세포를 생성하는 MARCM를 사용함으로써, 유전자 기능은이 문서에서 설명 된 행동 분석 등 다양한 방법을 사용하여 날아 성인에서 연구 될 수있다. 숫자와 B 수 특정 유전자를 모두 제한 요인테스트 E는 파리의 게놈 내의 FRT 부위의 존재이다. 플라이 주식은 관심의 돌...

인간은 접촉, 압력, 진동 또는 음파와 같은 환경의 기계적 자극을 신경계에서 처리할 수 있는 감각 정보로 변환하는 능력에 의존합니다. 인간과 무척추동물 사이의 기계전달의 전반적인 기계론적 특징의 많은 부분이 동일하기 때문에1 초파리는 기계전달의 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용한 모델입니다. Drosophila melanogaster는 기계적 자극을 활동 전위로 변환할 수 있는 두 세트의 특수 감각 기관(유형 I 및 II)을 포함합니다. I형 기계수용체(mechanoreceptor)는 3개의 지지세포(support cell)로 둘러싸인 단일 수상돌기 또는 감각 돌기를 가진 뉴런을 가지고 있다2. I형 기계수용체(mechanoreceptor)는 강모 기계수용체(bristle mechanoreceptor), 민감한 청각 맥락막(chinstotonal organs, 존스턴 기관), 날개박동에 대한 정보를 전달하는 캄파니폼 센실라(campaniform sensilla)를 포함한다3. 파리의 등쪽을 덮고 있는 강모는 I형 기관 중 가장 풍부하고 쉽게 접근할 수 있습니다. 척추동물의 청력 및 균형과 관련된 유모 세포의 세포 외 환경과 유사하게, 파리 기계에 민감한 뉴런을 둘러싼 지지 세포는 칼륨1에 대한 비정상적인 농도 구배를 생성하는 높은 칼륨 내림프를 분비합니다. 포유류와 파리 시스템 모두의 기계민감성 뉴런은 이 높은 세포 외 칼륨을 활용하여 세포를 탈분극시킵니다. 체벽을 향한 대모의 기계적 자극에 대한 반응으로, 감각 뉴런은 세포막의 칼륨 탈분극(potassium depolarization)에 의해 주도되는 활동 전위의 폭발로 반응한다4. 강모를 신경 분포시키는 초파리 감각 뉴런은 구조와 기능 면에서 척추동물의 유모 세포를 포함한 다른 유기체의 기계민감성 세포와 유사합니다1,5. 초파리(Drosophila)의 외부 감각 기관이 실험적 조작에 쉽게 접근할 수 있고 연구자들이 이용할 수 있는 풍부한 유전 기술로 인해 초파리는 기계감각의 분자적 토대를 조사할 수 있는 훌륭한 모델 시스템이 되었습니다. 
즉석에서, 칫솔모를 신경 분포시키는 단일 감각 뉴런의 자극은 관찰 가능한 행동 반응으로 이어집니다. 다양한 칫솔모를 자극하면 자극되는 칫솔모에 따라 구체적이고 재현 가능한 행동 반응을 유발합니다. 촉각 자극에 따라, 목이 잘린 야생형 파리는 복잡한 그루밍 반사를 보이는데, 이 과정에서 자극받은 강모 근처의 부위를 패턴화된 다리 움직임5-7로 청소한다. 학습7 또는 협응 및 운동 활동5을 방해하는 알려진 단일 유전자 돌연변이에 대해 동형접합적일 때, 파리는 기계적 자극에 비정상적으로 반응한다. 따라서 이 그루밍 반사는 단일 유전자 돌연변이가 특이적이고 복제 가능한 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
단일 거대모의 자극에 대한 강력한 행동 반응은 기계 전달에 관여하는 새로운 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 돌연변이가 기계감각을 방해한다는 것을 나타내기 위해 행동 반응이 없는지 돌연변이 파리 무리를 테스트하는 데 사용됩니다. 스크리닝을 위해 선택된 돌연변이 컬렉션에서 돌연변이는 성인이 되기 전에 치사를 유발하므로 전통적인 성인 행동 스크리닝을 사용하여 테스트하는 것은 불가능합니다. 원래, 이 치명적인 p-원소 집합체는 클론의 세포 성장 결함을 테스트하기 위해 FRT 재조합 부위와 결합되었습니다. 클론은 성충 파리가 기능적 시각 없이 실험실 환경에서 생존할 수 있기 때문에 특별히 눈에 만들어졌습니다8. 그러나 모든 기계감각을 제거하면 성인이 심하게 조정되지 않거나 폐점 전에 사망할 수 있다5. 이 프로토콜은 모자이크 접근법을 사용하여 돌연변이의 치사율을 우회하고 성체 단계 테스트를 허용합니다. MARCM(Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)9이라는 유전 기술을 사용하여 제한된 수의 성체 파리 감각 기관에서 동형접합 돌연변이 세포를 생성하고 나머지 유기체는 이형접합적 상태로 유지합니다. 이 MARCM 파리는 성체가 될 때까지 쉽게 생존하지만, 칫솔모는 관심 있는 치명적인 유전자에 대해 동형접합적입니다.
MARCM은 동형접합 돌연변이 세포의 영역이 생성되고 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현에 의해 표시되는 반면, 나머지 유기체는 특정 위치에서 이형접합적 상태로 유지되고표시되지 않습니다 9. MARCM은 개별 p-요소 돌연변이를 5가지 일반적인 유전 요소와 결합합니다: 업스트림 활성화 서열(UAS-GFP)의 제어 하에 있는 GFP, 일반 프로모터의 제어 하에 있는 Gal80 억제 단백질(tub-Gal80), 일반 프로모터의 제어 하에 있는 Gal4 전사 인자(tub-Gal4), 열 충격 제어 프로모터를 통해 발현되는 FRT 재조합효소 및 FRT 재조합 부위10. 열 충격이 활성화된 재조합효소를 통해 유사분열 재조합을 유도함으로써 제한된 수의 세포가 돌연변이에 대해 동형접합체가 되고 GFP로 표시됩니다. GFP 발현은 염색체의 야생형 사본에 Gal80의 존재에 의해 이형접합 세포에서 억제됩니다. 
MARCM에 대한 열-충격 프로토콜은 대부분의 유기체가 이형접합성으로 남아 있어 GFP로 표시되지 않는 반면, 파리 강모 외부 감각 기관에서 재조합을 유도하도록 최적화되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 모자이크 파리는 노텀 표면의 꼬리 모양 또는 등쪽 중앙 강모에서 가장 빈번하게 동형접합 돌연변이를 포함했습니다. 
우리는 알려진 기계민감성 돌연변이인 NOMPC를 사용하여 MARCM과 그루밍 행동 화면의 이 조합의 유용성을 테스트했습니다. 이온 채널, no mechanoreceptor potential C(NOMPC)는 Drosophila5,11-13의 mechanotransduction pathway의 필수 구성 요소입니다. NOMPC는 양이온 채널5의 일시적 수용체 전위(TRP) 슈퍼패밀리에 속하며 초파리14,15에서 기계민감성 채널로 분류되기 위한 모든 기준을 충족합니다: 1) NOMPC는 초파리 13,16-18의 유형 1 감각 뉴런의 섬모 끝에서 발현되며, 2) NOMPC null 유충은 촉각 자극에 대한 전기적 반응을 가지고 있지 않습니다13, 3) 접촉에 둔감한 세포에서 NOMPC의 이소성 발현은 기계적 자극에 대한 민감성을 유도할 수 있습니다13, 4) Schneider 2 세포에서 NOMPC의 이종성 발현은 기계적 민감성 채널을 생성하며,13) NOMPC 성체 돌연변이는 기계적 자극에 대한 반응에 결함을 나타냅니다5. 이러한 증거를 감안할 때, 우리는 NOMPC 돌연변이 클론이 칫솔모의 기계적 자극에 대한 반응으로 변형되거나 억제된 그루밍 반응을 보일 것이라고 예측했습니다.
NOMPC 돌연변이를 포함하는 MARCM 스톡은 그루밍 분석의 원리 증명 실험에 사용하기 위해 개발되었습니다. 모자이크 파리는 동형접합 NOMPC 돌연변이 세포를 포함하는 거대모세포(macrochaete bristles)에서 자극되었습니다. 우리는 거대모털(macrochaete bristle)의 자극에 따른 그루밍 반응의 억제를 예상했다. 우리는 실험된 14마리의 돌연변이 강모 파리 중 2마리만이 반복적인 자극에 단일 반응을 보였다는 것을 발견했습니다. 대부분은 동형접합 돌연변이 강모의 자극에 반응하지 않았습니다. 이 MARCM 기반 행동 분석법이 알려진 기계민감성 모자이크 돌연변이에서 비정상적인 그루밍 반사를 생성한다는 것을 확인한 후, 이 기술은 추가적인 기계민감성 돌연변이에 대한 스크리닝에 사용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>맥주 효모 (25 lb)</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN90331225&nbsp;</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>옥수수 (25 lb)</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN90141125&nbsp;</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>한천 (1 lb)</td><td>MoorAgar Inc.</td><td>41004</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>Tegosept (5 kg)</td><td>Genesee</td><td>20-259</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>당밀 (1 갤런)</td><td>Sugarmill 브랜드 - Thomsen Food Service</td><td>02625</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>Fisher</td><td>A258-500</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>인산</td><td>Fisher</td><td>A260-500</td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>초파리 바이알, 내로우 (PS)</td><td>Genesee</td><td>32-109</td><td>비행 문화</td></tr><tr><td>6oz 정사각형 바닥 병(PP)</td> <td>Genesee</td><td>32-130</td><td>플라이 문화</td></tr><tr><td>슬러그 - 플라스틱 플라이 병</td><td>Genesee</td><td>49-100</td><td>플라이 문화</td></tr><tr><td>레이온 볼, 대형</td><td>Genesee</td><td>51-100</td><td>플라이 문화</td></tr><tr><td>드로소 필러, 좁은</td><td>Genesee</td><td>59-168</td><td>플라이 식품 준비</td></tr><tr><td>드로소 필러, 병</td><td>Genesee</td><td>59-170</td><td>플라이 푸드 준비</td></tr><tr><td>8A-C / 기어 구동 실험실 교반기 C-클램프 마운트&nbsp; 1/15 HP, 700 rpm 가변 속도, 115 V, 50/60 Hz</td><td>클리블랜드 믹서</td><td>8A-C</td><td>플라이 푸드 준비</td></tr><tr><td>물 재킷 주전자</td><td></td><td></td><td>플라이 푸드 준비</td></tr><tr><td>일주 성장 챔버</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td>온도 및 빛/어두운 주기 제어</td></tr><tr><td>수조</td><td>VWR</td><td></td><td>열용 쇼크</td></tr><tr><td>마이크로 가위&nbsp;</td><td>고급 과학 도구</td><td>&nbsp; 15000-08</td><td>머리 제거용</td></tr><tr><td>형광 해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery V8&nbsp;</td><td>GFP 큐브(KSC295-814D) 대역 통과 필터 포함</td></tr><tr><td>Fluroscence Light Source</td><td>Zeiss</td><td>X-Cite 120</td><td>광섬유 광 파이프는 이를 쉽게 구성할 수 있게 해줍니다&nbsp;</td></tr><tr><td>스코프 Zeiss</td><td></td><td>AxioCam ICc1</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td>용 카메라 <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td></td><td></td><td>차가운 앤테시아</td></tr><tr>용<td>수제 콜드 앤테시아 트레이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>습한 환경에서 탈락한 파리를 복구하기 위한</td> <td>플라스틱 상자</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 marcm은 기반<em&gt; 초파리</em

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

때문에 포유류 내이의 머리 셀 구조 및 기능의 상 동성, 초파리 외부 감각 기관을 뉴런에 분포 mechanosensation의 연구에 훌륭한 모델 시스템을 제공한다. 이 프로토콜은 mechanosensation 방해 변이를 식별하는데 사용될 수 초파리 간단한 터치 동작을 설명한다. 파리의 가슴이 중 첫 번째 또는 세 번째 다리에서 정리 반사를 이끌어에 macrochaete의 촉각 자극은 다름. mechanotransduction (예 : NOMPC 등)을 방해 돌연변이는, 또는 반사 아크의 다른 측면과 함께, 정리 반응을 억제 할 수 있습니다. 성인 행동의 전통적인 화면은 개발 과정에서 중요한 역할을 돌연변이를 놓친 것이다. 대신,이 프로토콜은 expr에 의해 생성 및 표시 할 동형 접합성 돌연변이 세포의 제한된 영역을 허용하도록 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석과 터치 스크린을 결합녹색 형광 단백질 (GFP)의 ession. 비정상적인 행동 반응을 위해 MARCM 클론을 시험함으로써,보다 전통적인 방법에 의해 누락되었을 mechanosensation 관련된 새로운 유전자를 검색 치명적인 P 요소 돌연변이 컬렉션 선별 할 수있다.

이 프로토콜의 성공은 크게 쓸만한 파리의 전체 수율에 따라, 열 쇼크의 효과는 유사 분열 재조합하고, 2 분 간격으로 자극 파리에서 강력한 행동 반응을 얻을 수있는 능력을 유발한다. 배아의 약 12​​.5 %가 필요 MARCM 요소 및 GFP 발현의 가능성이 eclose 성인의 약 16.67 %를 포함하는 것을 감안할 때, 그것은 시간 제한이 낳는 동안 계란의 높은 번호를 확인하는 것이 중요합니다. 성공적인 타임 드의 예는도 1a에 도시 된 프로토콜의 나머지 부분에서 사용되는 4 시간 간격을 걸치. 열 쇼크가 85 행하는 경우 - 알을 ​​낳는 후 100 시간을, 외부 감각 기관의 GFP 표지 수율은 가장 파리 표지 macrochaetae 하나 갖는, 가장 높다. 관심이 많은 지역은 testabl의 기지에서 동형 접합 세포를 포함...

기계감각에 영향을 미치는 새로운 돌연변이를 식별하기 위해 MARCM 방법에 의해 생성된 돌연변이 클론에서 파리 강모의 촉각 자극에 대한 행동 반응을 측정하는 분석을 설계했습니다. 이 기술의 결합을 통해 그렇지 않으면 치명적일 수 있는 기계민감성 돌연변이를 식별할 수 있습니다.

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반<em&gt; 초파리</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

본 절차의 전반적인 목표는 성체 초파리에서 Meno 감각에 영향을 미치는 돌연변이를 테스트하는 것입니다. 이 방법은 Meno 민감성 채널의 식별과 같이 Meno 감각 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모자이크 동물을 이용함으로써, 일반적인 경우 개체에 치명적일 수 있는 돌연변이를 스크리닝할 수 있다는 점입니다.모자이크 스크리닝을 통해 기존의 전통적인 행동 스크리닝에서는 놓쳤을 수 있는 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 행동 테스트 단계는 학습하기 어렵기 때문입니다.적절한 강모를 식별하기 위해서는 숙련된 손길과 연습이 필요합니다. 실험을 시작하려면 파리를 옥수수 가루 당밀 배지에서 유지하며 인큐베이터에 보관하십시오. 필요한 유전적 요소를 포함하고 있는 마쿰 준비 스톡(markum ready stock)에서 처녀 암컷을 확보하십시오.마커가 표시된 미교배 암컷을 관심 돌연변이와 그에 해당하는 FRT 사이트가 포함된 수컷과 교배시킵니다. 다음으로, 돌연변이는 없지만 동일한 FRT 사이트를 가진 수컷 파리를 사용하여 두 번째 대조군 교배를 설정합니다. 암컷 5마리 대 수컷 1마리의 비율로 배치하고, 파리를 최소 하룻밤 동안 교배시킨 후 성충을 신선한 배지가 들어 있는 새 바이알로 옮깁니다.초파리가 암실 보관함 내 상온에서 알을 낳도록 둡니다. 초파리가 알을 낳으면, 교배된 개체들을 새 바이알로 옮깁니다. 산란 기간의 시작 및 종료 시간을 기록하십시오.열충격을 위해 알이 20개 이상 생성된 바이알을 선별하여 인큐베이터로 되돌려 보냅니다. 산란 후 85~100시간이 지나면 바이알을 항온수조에 넣으며, 이때 수위가 배지의 높이보다 높되 바이알이 완전히 잠기지는 않도록 합니다. 1시간 후 바이알을 항온수조에서 꺼내 파리가 회복할 수 있는 시간을 줍니다.회복 후, 바이알을 다시 항온수조에 1시간 동안 둡니다. 바이알을 항온수조에서 꺼내어 마취 후 다시 배양기에 보관합니다. 초파리를 얼음 위에 둡니다.초파리가 움직이지 않게 되면, 원하는 형질을 모두 가진 개체들을 선택합니다. 다음으로, 이리덱토미 가위(iridectomy scissors)를 사용하여 선택한 초파리의 머리와 가슴 사이에 가위를 조심스럽게 위치시킨 후 머리를 절단합니다. 이때 가슴 부분에 상처가 나지 않도록 연결 부위를 절단하십시오.머리가 없는 초파리를 밀폐된 습한 환경에 두고 10에서 20시간 동안 회복시킵니다. 회복 후 초파리를 회수하여 검사합니다. 스스로 움직이는 초파리만 사용하십시오.자극을 가한 후, 형광 해부 현미경으로 머리가 제거된 초파리를 관찰하여 GFP로 표시된 동형접합 클론을 식별합니다. 강모 외부 감각 기관을 확인하십시오. 강모의 명칭과 초파리의 좌측 또는 우측 중 어느 쪽에 위치하는지를 기록하고, 뻣뻣한 털이나 미세 핀셋을 사용하여 GFP로 표시된 강모를 초파리 몸쪽으로 굴곡시켜 그루밍 반사를 유도한 다음 다리의 반응을 관찰합니다.강모 자극에 반응하여 다리를 들어 올리는 초파리에는 감각 점수(sinus score) 1점을 부여하고, 다리를 움직이지 않는 초파리에는 0점을 부여하였습니다. 가능한 경우, post AOR 강모에 모자이크 조직을 가진 초파리를 대상으로 post AOR 강모의 행동 분석법을 사용하여 자극 반응을 테스트하였습니다. 한편, 야생형(type) 초파리는 기지인 기계적 자극 민감성 돌연변이인 no mechano receptor potential C 또는 NMSI(그루밍 반응이 손상됨)와 비교되었으며, 대조군 초파리는 강모 자극의 34%에 반응하였습니다.대조적으로, NMSI 동형접합체 강모를 가진 동물들은 2%의 반응률을 보였습니다. 이러한 절차와 새로운 행동 반응 유전자의 식별 이후에는 전기생리학 및 단백질 국소화와 같은 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 이 유전자의 역할을 더욱 자세히 규명하기 위해, 해당 유전자가 meno 감각 전달이나 meno 감각 뉴런의 발달에 관여하는지에 대한 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Drosophila melanogaster은 한 세기 이상에서 많은 중요한 생물 학적 과정의 분자 및 세포 기초를 이해하기 위해 사용되었습니다 유전자와 behaviorally 다루기 쉬운 모델 시스템이다. Drosophila 잘 플라이 행동의 유전적 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 악용되었습니다.

분석의 방법 Drosophila 행동

이 비디오는 비행 이동을 정량화하는 간단한 방법을 설명하고 수행된 등반 분석을 보여줍니다. 비행 등반 분석은 음성 지오택시 반응에 의존하는 운동 기능의 일반적인 테스트입니다.

플라이 클라이밍 분석: Drosophila melanogaster에서 일반 운동을 테스트하는 방법

이 비디오 문서에서는, 우리는 초파리 비행 성인 과일의 후각에 의존 식품 검색 행동에 대한 배고픔이나 포만감의 효과를 측정 할 수있는 자동화 된 분석을 설명합니다.

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에 초파리

우리는 Y-미로 분석을 사용하여 초파리의 행동에 냄새 물질의 영향을 나타 내기 위해 선택 테스트를 제시한다.

테스트<em&gt; 초파리</emY-미로 분석과&gt; 후각

여기에서는 최대 100마리의 식초파리(Drosophila melanogaster)의 후각 반응을 분석하기 위한 행동 설정 및 데이터 분석 방법을 설명합니다. 이 시스템은 단일 또는 다중 후각 자극과 함께 사용할 수 있으며 신경 세포 하위 집합의 광유전학적 활성화 또는 침묵에 적응할 수 있습니다.

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동<em&gt; 초파리</em&gt; 네 사분면의 후각에

여기에서 우리는 초파리 유충의 차가운 통각을 연구하는 새로운 분석을 보여줍니다. 이 분석은 초점 유해 냉 자극을인가 할 수있는 맞춤식 펠티에 프로브를 이용하여 정량화하고 초기 특정 행동을 초래한다. 이 기술은 차가운 통각의 추가 세포 및 분자 해부를 허용합니다.

콜드 통각에 대한 소설 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.

드로소필라 애벌레의 기계적 고치절 측정을 위한 향상된 분석 및 도구

현재 프로토콜은 속도, 거리 등의 매개변수를 계산하기 위해 고화질 비디오 녹화를 기반으로 각 프레임의 픽셀을 분할하는 플러그인과 호환되는 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 손으로 만든 경기장에서 파리의 움직임을 추적 및 분석하여 초파리 의 운동 활동을 평가합니다.

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

이 논문은 CsChrimson 및 GtACR2를 활용하여 특정 뉴런을 활성화하고 침묵시키는 Drosophila melanogaster의 광유전학적 조작 방법을 제시합니다. 광유전학을 활용하여 열택 및 미각 행동을 탐구하고 이러한 과정을 제어하는 기본 신경 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 네 가지 실험이 설명됩니다.

Drosophila melanogaster에서 신경 회로의 광유전학적 조작을 위한 행동 분석

이 프로토콜은 전통적인 포유류 모델에 대한 대안으로 운동 기능 장애의 정량화를 통해 초파리의 신경 독성을 평가하기 위한 고처리량, 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 민감하고 재현 가능하며 윤리적으로 유리한 모델을 사용하여 제약 화합물, 환경 제제 또는 유전자 변형의 신경독성 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다.

신경독성에 대한 판독으로서의 Drosophila melanogaster 의 운동 기능 장애에 대한 행동 분석

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster에서 스트레스로 인한 행동 변화를 평가하는 틀을 제공합니다. 상호 보완적인 분석법을 결합하면 개별 파리의 활동, 탐구, 의사결정 능력을 정량화할 수 있습니다. 이 접근법은 유연하며 스트레스 생물학, 대사, 신경행동 기능을 조사하는 다양한 연구에 적용할 수 있습니다.

초파리 멜라노가스터에서 스트레스 유발 우울과 유사 상태의 다중 행동 표현형 분석

학습하세요 Drosophila의 기계수용에 영향을 미치는 돌연변이를 MARCM 모자이크 방법으로 행동 분석하는 기법을. 이 방법은 치명적 돌연변이를 선별하여 감각 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반

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