Name: DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 전기천공법을 이용한 생쥐 근섬유 분리 및 형광 단백질 발현 기술. 성숙 근섬유에서 단백질 기능과 국소화를 연구하고 고해상도 공촛점 현미경으로 근육 구조를 시각화하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 NS047726, NS072027 및 AR052646은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.

본 연구의 방법은 가이드 라인을 승인 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 노스 웨스턴 대학 파인 버그 학교 (IACUC)와 윤리에 따라 수행되었다. 모든 노력이 고통을 최소화 하였다. 마우스의 굴근 심지 브레비스의 생체 내의 Electroporation (FDB) 근육 번들 1. 실험 절차 <ol><li> 포유 동물 세포에서 발현하는 것으로 알려져 프로모터를 사용하여 생체 내 발현을위한 디자인 플라스미드 (예를 들어, 거대 세포 바이러스, CMV) 또는 근육 (예를 들어, 근육 크레아틴 키나제, MCK) 6,7. 큰 플라스미드는 낮은 수준에서 표현 할 수 있습니다. CMV 프로모터 광범위 6,7 사용되어왔다. </li><li> E.로부터 플라스미드를 정화 대장균은 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 조건을 사용하여. 5 μg의 플라스미드 / μL - 2에서 무균, 내 독소 무료 TE 버퍼에 플라스미드를 녹인다. </li><li> 희석 및 concentratio에 플라스미드 나누어지는멸균 독소 무료 TE (2 μg의 / μL) 10 μL에서 DNA의 20 μg의의 n은 멸균 microcentrifuge 관에 주입 당 버퍼. 주입 당 하나의 나누어지는을 준비합니다. </li><li> 8 단위의 최종 농도를 제공하는 칼슘 및 마그네슘없이 멸균 인산 완충 식염수에 1 배인 히알루로의 콘텐츠 - (- / PBS)에 희석한다. 나누어지는 멸균 microcentrifuge 관에 주입 당 희석 히알루 10 μL. </li><li> 진정 및 꼬리 또는 발가락 핀치에 응답 할 때까지 2.5 % 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취. 정상 체온을 유지하기 위해 가열 패드 또는 가열 테이블에 앙와위에 동물을 놓는다. </li><li> 사전 기술 바늘 사이트 유래 바깥쪽으로 방사를 사용 포비돈 요오드 스크럽 알코올 교류 응용 3 회 마우스 발바닥을 청소한다. 이 기술은 병원균 도입을 최소화 무균 상태에서 바늘 위치를 유지한다. </li><li> 번째의 발바닥 주사피부와 멸균 1 ML의 주사기를 사용하여 근육 사이의 1 배의 히알루 용액 (2 ㎎ / ㎖ = 8 대)의 10 μL와 전자 마우스. 히알루는 근섬유로 플라스미드를보다 효율적으로 진입을 허용하는 세포 외 기질 성분의 소화. 발 뒤꿈치의 바닥에 입력하고 발가락쪽으로 바늘을 진행합니다. 바늘이 후진으로 천천히 액체를 놓습니다. 피부 아래에 주사 부위의 확장과 분홍색을 설정하기 시작합니다. </li><li> 반복 1.6 반대쪽 발에 1.7 단계를 반복합니다. </li><li> 마취를 분리하고 다시 새장에 마우스를 놓습니다. 마우스가 완전히 마취에서 복구 할 수 있습니다. </li><li> 2 시간을 기다립니다. </li><li> , 마취 및 발 소독 절차를 반복 1.5 및 1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 히알루로니다 제와 같은 방식으로 발바닥 내로 희석 플라스미드 DNA를 주입. 최대 볼륨 20 μL 이하인지 확인합니다. 이중 발현 플라스미드 20의 최대 음량 각 플라스미드 20 μg의 주입# 181; L 이하이다. </li><li> 반대쪽 발바닥에 플라스미드 주입을 반복하거나 제어 주사에 대한 반대측 발을 사용합니다. </li><li> 처음에 주입 한 발에서 떨어져 미세 집게로 밑줄 근육으로부터 피부를 들어 올려 다리의 치유 발가락 라인에 수직 위치에 발가락 근처 피부의 공을 통해 하나 27 G 바늘을 놓습니다. 두 번째 멸균 27 G 바늘을 가지고 발 뒤꿈치에서 피부를 통해 수평으로 배치합니다. 장소 바늘 떨어져 각 ~ 다른 1cm 평행. </li><li> 바늘이 서로 접촉하지 않도록하고 병렬 바늘에 악어 클램프, 클램프 전극을 사용. 점토의 사용 장소에 클램프를 확보 할 수있다. </li><li> 전기 자극기에 전극을 연결합니다. </li><li> 100 V / cm에서, 1 Hz에서 20 펄스 지속 시간이 20 밀리 초 / 각을인가함으로써 근육 Electroporate. 발가락 자극하여 경련 수 있습니다. </li><li> 필요한 경우 반대쪽 발에 자극 절차를 반복합니다. </li><li>바늘을 제거합니다. 포비돈 요오드 스크럽과 발바닥을 닦습니다. </li><li> 마취를 끕니다. 복구 케이지와 모니터 활동에 마우스를 돌려줍니다. 예상대로 절차가 수행 된 경우, 동물을 30 분 내에 정상 보행을 회복 및 사전 주입 동작과 보행 또는 활성 수준에 차이를 나타내지 않는다한다. 따라서, 시술 후 진통제는 필요하지 않습니다. 복구시, 동식물 사육장에 동물을 반환합니다. 참고 : 단백질 발현은 전기 후 빠르면 48 시간을 분석 할 수 있습니다. 14 일 전기 (10) 후 - 그러나, 전기 후 더 완벽한 복구를 할 수 있도록, 우리는 7 고립과 근섬유의 연구를 선호한다. 식 4 주 후 일렉트로만큼 분석 될 수있다. </li></ol> 굴근 심지 브레비스 (FDB) 섬유의 분리 2. 실험 절차 <ol><li> 해동 콜라게나. 각 FDB 번들 12 웰 조직 배양 플레이트에 웰 두 준비. 하나에서 잘 1m를 추가미리 예열 둘 베코의 수정 이글스 미디어 플러스 소 혈청 알부민 (DMEM + BSA)의와 다른 난 잘 미리 예열 링거 액 1ml를 추가합니다. 또한, 요리를 실 가드 35mm에 1 배 링거 용액의 신선한 10ml를 추가합니다. </li><li> 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 또는 다른 방법으로 다음, CO 2 마취 가스의 흡입을 통해 동물을 희생. </li><li> 깨끗한 면도날을 사용하여 발목 관절 위의 뒷다리를 제거하고 접시를 실 가드 35mm의 1 배 링거 용액에 잠수함. </li><li> 한 발 꽉 핀, 5 발가락 끝의 각 통해 발목에서 30 G 바늘과 실 가드 접시에, 발바닥이 위로 향하게. </li><li> 발목에서 시작, 조심하지 닉, 바로 발가락쪽으로 헤어 라인을 따라 피트의 측면을 피부 아래의 근육을 피부를 싹둑. 다리의 반대편에 반복합니다. </li><li> 미세 집게로 발목의 기지에서 피부를 잡고 발 뒤꿈치에서 피부를 잘라. </li><li> 피부를 리프팅피부로하지 닉 근육으로 가위를 가리, 집게와 플랩. 효과적으로 피부를 제거한 하부의 결합 조직이 잘린. </li><li> FDB 근육 다발이 뼈의 힘줄을 확보하기 위해 발 뒤꿈치에있는 큰 힘줄을 잘라 제거하십시오. 집게와 힘줄을 잡고 조심스럽게 가위로 FDB에 연결된 모든 결합 조직을 제거하는 큰 흰색 건에서 FDB 번들을 해부하다. 제대로하면 번들은 쉽게 개인의 자리로 이어지는 밝은 흰색 힘줄을 드러내는 기본 힘줄의 들어 올려됩니다. 발에서 번들을 확보 발가락 근처의 힘줄에서 FDB를 잘라. </li><li> 잘 포함하는 DMEM + BSA의 전체 근육 번들을 놓습니다. </li><li> 반대쪽 발에 반복합니다. </li><li> 일단 모든 FDB 근육은 각 웰에 포함 된 DMEM + BSA와 근육에 콜라겐의 100 μl를 추가, 격리됩니다. </li><li> 소화 이전에 거꾸로 형광 현미경에 전기의 성공을 확인합니다. 수행 properl 경우Y, 90 %의 형질 전환 효율은 위쪽으로 달성 될 수있다. </li><li> 약 1 시간 동안 10 %의 CO 2에 가습, 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 시간은 질병 모델과 배경과 콜라겐의 많은에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 1 시간 후, 조심스럽게 잘 포함 만 링거 용액에 FDB 번들을 전송합니다. </li><li> 1 ml의 피펫을 사용하여 링거 용액 웰 FDB 번들 씹다. 번들 쉽게 피펫 팁을 통과 할 수 있도록 깨끗한​​ 면도날 피펫 팁의 끝을 잘라. 조심스럽게 번들가 통과 팁과 평행 다운 할 수 있도록 근육 (~ 15 배)를 씹다. 본래 섬유는 링거 용액에 떨어질 것입니다. 섬유가 쉽게 번들을 떨어지지 않는 경우, 콜라겐 용액에 다시 근육을 놓습니다. </li><li> 판 당 접시 ~ 500 μL에 고립 된 섬유 플레이트. </li><li> 근육은 15 분 동안 잘에서 소화 할 수 있습니다. </li><li> 반복 2.15 단계2.17로 다발의 크기가 감소 될 때까지 섬유의 대부분은 번들 (통상 2-3 회 전체)로부터 해리된다. 일단 근육 용이 1 ml의 피펫 팁을 통과 해리. </li><li> 섬유가 15 분 이상 동안 접시에 부착하자. 신선한 링거 용액 시간 제약에 따라 잔여게나 희석 플레이트에 추가되거나 변경 될 수있다. 참고 : 섬유 이제 이미징을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 공 초점 현미경을 사용하여 레이저 유도 멤브레인 손상의 시각화 3. 실험 절차 <ol><li> 로드 섬유 2.5 μm의 300 μL 링거 용액 FM 4-64 염료 FM 1-43으로 이미징 직전. 일반적으로, 분리 후 이미지 섬유 15 분까지 2 시간. 그러나, 섬유는 24 시간 후 분리까지 영상화 할 수있다. </li><li> UV 레이저 및 60X / 63X 대물 렌즈가 장착 된 공 초점 현미경에 유리 바닥 접시를 놓습니다. </li><li> 섬유를 찾습니다. 섬유가 단단히 연결되어 있는지 확인합니다현미경 기반을 눌러 접시에. 해리 과정에서 손상되었다 섬유를 제외합니다. 손상된 섬유 컬 막 소포, FM 염료의 흡수 높은 수준을 포함​​하거나 강렬하게 구부리 수 있습니다. </li><li> 섬유 막에 손상을 유도하는, 핵의 클리어 필드 촬상 창의 중심에 위치 sarcolemma. sarcolemma 매우 날카로운되도록 FM 염료 채널을 사용 sarcolemma에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> FM 4-64 채널을 활용 sarcolemma에 투자 수익 (ROI) 크로스 헤어를 놓습니다. </li><li> 3 초 (~ X 350 nm의 영역 350 ㎚) 80 %의 전력에서 1 픽셀 지점을 조사. FM 염료는 부상의 사이트에서 셀을 입력합니다. 전력 및 시간을 증가 시키거나 모독의 영역을 감소하도록 조정될 수있다. </li><li> 손상시 손상하기 전에 매 2 초 후 손상, 최대 5 분 후 매 10 초 섬유의 이미지를 캡처합니다. 타이밍은 필요에 따라 조정될 수있다. 개별 이미지는 이미지 J.에서 시간 경과 영화로 변환 할 수 있습니다 </li><li> 단계를 반복합니다접시 당 최대 3 섬유에 3.7을 통해 3.3. </li></ol>

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</ol>

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생체 내 형광 태그로 단백질을 연구하는 전기의 사용은 이상적으로 충실히 근육 전체 셀 구조를 복제 적합한 세포주 모델의 부재 주어진 근육의 연구를 위해 적합하다. 이 프로토콜은 레이저 상처 후 단백질 지역화 및 전좌의 상세한 화상을 제공하는 일렉트로 고해상도 공 초점 현미경의 사용률을 설명한다. 이 방법은 세포 골격 재구성, 인신 매매 및 융합을 포함한 다른 세포 과정을 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다. FDB 근육 다발 익스프레스 플라스미드 내의 근섬유의 90 %까지,이​​ 프로토콜을 사용하고, 이것은 이전과 이후 모두 분해 근섬유 형광 현미경에 의해 용이하게 알 수있다. 주사 부위에 가깝게 관찰 높은 식 표현의 경사는 일반적으로 존재한다. 때문에 발현 그라디언트, 다양한 단백질 발현의 효과를 모니터링 할 수 아프로엄마 하나의 실험. 모든 형질 전환 방법과 마찬가지로이 방법은 과잉 발현과 관련된 문제에 의해 제한된다. 특히, 높은 수준의 표현으로, 단백질...

각각의 근섬유가 큰, 매우 조직 세포 융합 세포이다. 근육에 대한 몇 가지 세포 배양 모델이 있습니다; 그러나,이 모델은 완전히 성숙한 근섬유로 분화하지 않는 전공 제한으로있다. 예를 들어, L6 및 C2C12 세포주는 마우스 및 래트 각각 1-4로부터 유도된다. 혈청 기아 조건 하에서, 단핵 &quot;근육 모세포 같은&quot;세포 증식을 중단 세포주기 회수를 받아야하고 sarcomeres과 다핵 세포를 형성하는 근육 조직 프로그램에 입력 myotubes라고 함. 장기간 배양 조건으로, myotubes는 수축 특성을 나타낼 수 있으며, 문화의 &quot;트&quot;. 인간 세포주는 이제 5 확립되었다. 이들 불멸화 세포주 이외에, 단핵구는 근육 아세포로부터 myotubes을 형성 할 것이다 혈청 기아 유사한 조건 하에서 분리 될 수있다. 이들 세포주 및 일차 근원 세포 배양 물은 높은 사용 아르FUL들은 플라스미드로 형질 감염 또는 바이러스 형질 도입 및 염기성 세포 생물학적 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있기 때문이다. myotubes를 형성하도록 유도 된 경우에는, 이들 세포는 심지어, 성숙한 근육 조직의 많은 두드러진 특징이 부족하다. 구체적 myotubes 개별 성숙한 근섬유보다 훨씬 작고 근섬유의 정상적인 형상이 부족하다. 비판적으로, myotubes는 가로 (T-) 세관 부족, myoplasm에 걸쳐 효율적으로 칼슘 2 + 릴리스에 필요한 멤브레인 네트워크. 차 근원 세포 또는 근육 조직 세포 라인에 다른 방법은 성숙한 근섬유를 사용하여 수반한다. 형질 전환은 태그 된 단백질의 발현을 확립하기 위해 사용될 수 있지만,이 방법은 비용과 시간이 소요된다. 마우스 근육의 생체 전기는 속도 및 신뢰성 6-10위한 바람직한 방법으로서 떠오르고있다. 생체 전기와 근섬유 하를 효율적으로 분리하는 방법마우스 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 (6)에 최적화되어했습니다. 방법은 쉽게 완료 플라스미드에서 생체 내 발현 유도하는 최소 침습 있습니다 할 수 있습니다. 이 방법은 현재의 sarcolemma -6,7- 레이저 파쇄 촬상 비롯한 고해상도 영상화 방법과 결합된다. 형광 염료 및 형광 표지 된 단백질의 발현이 결합 성숙한 근섬유 세포에서 생물학적 과정을 모니터링하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>해부 매체 희석: 50 ml +100 g BSA</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>섬유 소화 희석: 160 mg / 4 ml DMEM (재고 40 mg/ml 분취)</td></tr><tr><td>Falcon 12-well 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>877229</td><td>섬유 소화</td></tr><tr><td>링거 솔루션</td><td></td><td></td><td>섬유 소화 및 이미징 희석: 146 mM NaCl 5 mM&nbsp; &nbsp; KCl 2 mM&nbsp; &nbsp; CaCl2 1 mM&nbsp; &nbsp; MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O</td></tr><tr><td>1 ml 피펫</td><td>Axygen</td><td>T-1000-C-R</td><td>소화</td></tr><tr><td>면도날</td><td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>소화</td></tr><tr><td>정밀 글라이드 30 G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>해부</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>해부</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td><td>해부</td></tr><tr><td>집게</td><td>FST by Dumont</td><td>#5/45</td><td>해부</td></tr><tr><td>집게</td><td>Roboz</td><td>RS-4913</td><td>해부</td></tr><tr><td>가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500260</td><td>해부</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td>해부 매체 희석: 100 mg/50 ml DMEM</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772B</td><td>Dissection- 실가드</td></tr><tr><td>클레이</td><td></td><td></td><td>전기자극</td></tr>기를 보관하는 데 사용됨<tr><td>&nbsp;</td><td>잔디</td><td>s88x</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>클램프</td><td>라디오 판잣집</td><td>270-356</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Triadine</td><td>Aplicare</td><td>82-220</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Precision Glide 27 G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>시뮬레이터</td><td>잔디</td><td>SIU-V</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>거즈</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>전기충격법</td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td><td>시그마</td><td>H4272</td><td>주입 희석: 160 ul PBS (1x)를 40 &마이크로에 첨가; l 5x 재고</td></tr><tr><td>1cc U-100 인슐린 주사기 (28G1/2)&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>주입</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>주입</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 Microwell 접시</td><td>MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>현미경</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>현미경 희석 : 최종 2.5 ug / ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Life Technologies</td><td>T-35356</td><td>현미경 희석: 최종 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>내독소가 없는 플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>플라스미드 정제</td></tr></tbody></table>

dna 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

성숙한 근육은 살아있는 세포 이미징에 적합한 독특한 구조를 가지고 있습니다. 여기에서는 FDB(flexor digitorum brevis) 근육에서 형광 표지된 단백질을 발현하기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 근육 손상을 최소화하면서 전기천공된 플라스미드를 발현하는 고품질 근섬유를 다수 제공할 수 있도록 조건이 최적화되었습니다. 이 방법은 다양한 단백질에 형광 태그를 사용합니다. 이 발현 방법을 고해상도 컨포칼 현미경과 결합하면 레이저로 인한 손상 후의 이미징을 포함하여 라이브 셀 이미징이 가능합니다. 형광 표지된 단백질의 이미징과 결합된 형광 염료는 근육의 기본 구조와 자극에 대한 근육의 반응에 관한 정보를 제공합니다.

전기 효율적으로 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 번들 (그림 1A)로 정제 된 플라스미드 DNA를 소개하는 최소 침습 기술이다. 이레는 형질 전환 형광 태그 단백질은 고립 된 근섬유 (그림 1B)에 가시화 게시 할 수 있습니다. 고립 된 섬유는 도금 공 초점 현미경 이미징에 대 한 준비가되어 있습니다. 섬유 레이저 유도 부상으로 실시 할 수있다. FM 염료 막 손상의 위치를 식별하는 데 사용될 수있다 (도 1C) 소화 과정 중에, 근섬유의 소수 (흰색 화살표) (도 2A)를 손상 될 수있다. 손상된 근섬유는 sarcolemma (검은 색 화살표)에서 막에 blebbing 존재로 식별 할 수 있습니다. 섬유 손상은 또한 실험에 적합하지 않...

이 프로토콜은 전기천공법을 사용하여 마우스 근육 섬유에 형광 표지된 단백질을 도입하고 발현합니다. 전기천공법 후 회복 후 섬유가 분리됩니다. 그런 다음 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 섬유를 이미지화하여 근육 구조를 시각화합니다.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스의 단지굴근(flexor digitorum brevis)에서 근섬유를 분리하여, 이후 레이저 상처 유발을 통해 근초(sarcolemma)에 손상을 입히는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 형질전환 마우스를 생성할 필요 없이 성숙한 근섬유에서 단백질의 기능과 국소화를 연구할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 약물 제제 및 기타 세포 손상 방법을 테스트하는 데 응용될 수 있습니다.먼저 콜라게나제(collagenase) 용액을 해동합니다. 다음으로, 12-웰 플레이트에서 두 개의 웰을 준비합니다. 한 웰에는 분리할 섬유 하나당 1 mL의 예열된 DMEM 및 BSA를 첨가하고, 다른 웰에는 1 mL의 예열된 1x 링거액(ringers)을 채웁니다.또한 10 mL의 신선한 1x Ringer액이 담긴 35 mm 페트리 접시를 준비합니다. 형질전환된 동물로부터 발을 분리한 후, 30 gauge 바늘을 다섯 개의 발가락 끝에 각각 통과시켜 발바닥이 위를 향하도록 페트리 접시에 발 하나를 단단히 고정합니다. 그리고 발목 부위에서 각 발을 다음과 같이 준비합니다.먼저 피부를 절개합니다. 발목에서 시작하여 발가락 방향의 헤어라인을 따라 절개하십시오. 피부 아래의 근육이 손상되지 않도록 주의하십시오.다음으로, 발목 기저부의 피부를 잡고 뒤꿈치를 가로질러 절개합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 피부 플랩을 들어 올리고, 가위를 근육이 아닌 피부 쪽으로 향하게 한 뒤 결합 조직을 조심스럽게 잘라내어 피부를 제거합니다. 이제 FDB 근육을 제거하기 위해, 뒤꿈치 부분의 큰 힘줄을 절단하여 뼈에서 분리하는 것부터 시작합니다.그런 다음 커다란 흰색 힘줄에서 FDB 다발을 박리합니다. 이 과정에서 부착된 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 완료되면, 하단 힘줄에서 다발을 들어 올려 손가락으로 이어지는 밝은 흰색 힘줄들이 드러나게 합니다.다발이 쉽게 들어 올려져야 합니다. 그런 다음 발가락 근처의 흰색 힘줄을 절단하여 발에서 다발을 분리하십시오. 근육 다발을 BSA가 포함된 DMEM 웰로 옮기고, 다음 단계로 넘어가기 전 반대편 발에도 동일한 과정을 반복하십시오.이제 텍스트 프로토콜에서 다룬 전기천공법(electroporation)의 성공 여부를 확인할 수 있습니다. 도립 형광 현미경을 사용하여 이 진단 확인을 수행하십시오. 성공적일 경우, 형질전환 효율은 최대 90%까지 도달할 수 있습니다. 모든 FDB 다발을

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

이 비디오는 수확된 쥐 EDL(Extensor Digitorum Longus) 근육에서 단일 근섬유를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 근섬유는 근섬유와 관련된 근육 줄기세포 활성을 연구하기 위해 배양할 수 있습니다.

근섬유 분리: 수확된 쥐 EDL(Extensor Digitorum Longus) 근육에서 단일 근섬유를 얻는 기술

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

우리는 우리가 전화 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME), 골격 근육 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis로 이식 때 용이 하 게 수 있는 가능한 조직적 셀을 포함 하는 증거에 근거 하는 소설 실험 기법을 설명 호스트 근육입니다.

최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

이 프로토콜에서 근육 줄기 세포에 대한 체외 배양 및 기능 분석 방법이 설명되어 있어 내인성 틈새 시장을 통해 대부분의 상호 작용을 보존합니다.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

이 프로토콜은 산화성 가자형상근에서 온전한 단일 근섬유를 분리하고, 이 섬유에서 유래한 고정제된 근모아 배양을 구축하는 과정을 설명합니다. 최적화된 절차는 마우스당 약 300–500개의 온전한 근섬유를 신뢰성 있게 얻어 하위 분자 및 세포 분석을 가능하게 합니다.

산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

배우세요 전기천공법을 이용한 생쥐 근섬유 분리 및 형광 단백질 발현 기술. 성숙 근섬유에서 단백질 기능과 국소화를 연구하고 고해상도 공촛점 현미경으로 근육 구조를 시각화하는 방법을 익히세요.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

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