준비 및 시험 독성에 대한 신속한 평가 음주의 물 샘플에 대한 RTgill-W1 세포와 유체 바이오칩을 임피던스 기반

이 절차의 전반적인 목표는 바이오센서를 사용하여 음용수 샘플의 독성을 평가하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 무지개 송어 아가미 세포의 단층을 포함하는 바이오칩을 만든 다음 임피던스 기반 바이오 센서의 일부로 사용함으로써 수행됩니다. 이 절차는 인체 건강과 관련된 수준에서 식수 공급의 화학적 독성을 신속하게 감지할 수 있는 방법을 제공합니다.

이 기술의 주요 장점은 바이오칩을 현장 조건에서 사용할 수 있고, 세포를 관리하거나 유지 관리하지 않고도 최대 9개월 동안 차갑게 보관할 수 있으며, 테스트를 위한 준비 상태에 있고 냉장에서 제거한 후 언제든지 사용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 학부생인 Jordan McNairn입니다. 세포 파종 전날, 포장에서 바이오칩을 꺼내 멸균된 플라스틱 기구 케이스에 넣습니다.

튜브 어셈블리 중 하나를 주사기에 부착하고 20ml 주사기에 20% 표백제 용액을 추출합니다. 2ml의 용액을 바이오칩의 각 채널에 주입합니다. 완료되면 바이오칩을 표백제 용액과 함께 1시간 동안 그대로 두십시오.

1시간 후 진공 라인에 부착된 수 슬립 루어 어셈블리가 장착된 멸균 1ml 주사기를 사용하여 두 채널에서 표백제 용액을 흡입합니다. 바이오칩에서 표백제를 흡인한 후 양쪽 끝에 수 슬립 루어가 있는 멸균 튜브 어셈블리를 바이오칩에 부착하여 바이오칩을 헹구는 동안 배수구로 사용합니다. 그런 다음 멸균수를 20ml 주사기에 넣고 칩의 각 채널을 5ml의 물로 씻어냅니다.

진공 청소기로 이전과 같이 물을 흡입합니다. 그리고 바이오칩을 플라스틱 기구 케이스에 다시 넣습니다. 바이오칩은 다음날까지 생물 안전 후드에 그대로 두십시오.

바이오칩을 파종하기 1시간 전에 바이오칩의 각 채널에 밀리리터 피브로넥틴 용액당 10마이크로그램 2밀리리터를 주입합니다. 바이오 안전성 후드에서 바이오칩을 60분 동안 배양한 다음 피브로넥틴 용액을 진공 흡입합니다. 마지막으로, 두 개의 멸균 바이오칩 튜빙 어셈블리를 바이오칩의 포트에 놓고 세포가 파종할 준비가 될 때까지 바이오칩을 따로 보관합니다.

인큐베이터에서 무지개송어 아가미 상피 세포가 들어 있는 T-175 플라스크 하나를 꺼내 생물 안전 후드에 넣습니다. 하나의 합류 T-175 플라스크는 약 16개의 바이오칩을 파종할 수 있습니다. 세포에서 배지를 흡인합니다.

PBS로 헹구고 PBS를 흡인합니다. 그런 다음 6ml의 트립신-EDTA 용액을 세포층에 추가합니다. 플라스크를 실온에서 약 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 각 플라스크에 15ml의 완전한 L-15 세포 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 세포 현탁액에서 작은 부분 표본을 채취하고 혈구계를 사용하여 세포의 농도를 측정합니다. 10x 대물렌즈가 장착된 명시야 현미경을 사용하여 세포를 봅니다.

그런 다음 현재 세포 농도를 계산하고 세포 현탁액을 밀리리터당 1/4 백만 세포의 농도로 조정합니다. 다음으로, 멸균 20 밀리리터 주사기를 사용하여 2.5 밀리리터의 세포 현탁액을 바이오칩의 각 채널의 외부 포트에 주입합니다. 여분의 셀 현탁액이 튜브에서 폐기물 용기로 흘러 들어가도록 합니다.

그런 다음 각 채널의 외부 포트에 루어 피팅이 있는 호스의 자유 끝을 삽입하여 각 바이오칩 채널에 대한 밀폐 루프를 만듭니다. 다음으로, 종이 타월에 70% 에탄올을 적셔 닫힌 루프에서 여분의 매체를 닦아내는 데 사용합니다. 그런 다음 바이오칩을 플라스틱 상자에 다시 넣습니다.

4일차와 7일차에 인큐베이터에서 바이오칩을 꺼냅니다. 그리고 온도 평형 완전한 L-15 세포 배양 배지로 바이오칩의 배지를 변경합니다. 7일 수유 후 칩에서 호스를 제거하고 폐기하고 오토클레이브 배수 플러그를 바이오칩에 삽입합니다.

바이오칩을 테스트에 사용할 때까지 섭씨 6도의 인큐베이터에 있는 상자에 넣습니다. 휴대용 케이스에서 ECIS 테스트 리더와 소모품을 제거한 다음 리더를 켭니다. 또한 섭씨 6도의 인큐베이터에서 준비된 바이오칩 중 하나를 꺼내 종이 타월 위에 올려 놓습니다.

10ml 주사기를 사용하여 10ml의 대조수 0.5ml를 라벨이 붙은 0.5온스의 투명 플라스틱 제어 용기에 분배합니다. 정확한 측정을 위해 기포를 제거해야 합니다. 그런 다음 별도의 주사기를 사용하여 10ml의 테스트 샘플을 0.5온스의 투명한 플라스틱 테스트 용기에 분배합니다.

다음으로, 두 개의 분말 미디어 바이알을 제거합니다. 분말 매체 바이알 중 하나를 열고 한 바이알의 전체 내용물을 대조수와 함께 용기에 붓고 전체 바이알도 용액에 떨어뜨립니다. 테스트 jar에 대해 이 절차를 반복합니다.

그런 다음 병의 뚜껑을 닫고 흔들어 가루가 완전히 녹았는지 확인합니다. 파란색 10ml 주사기에 9ml의 대조 용액을 채웁니다. 그리고 빨간색 10ml 주사기와 각각의 바이알에서 9ml의 테스트 용액이 들어 있습니다.

주사기에서 기존 기포를 제거합니다. 그런 다음 바이오칩 포트에서 플러그를 제거하고 배수구를 부착합니다. 바이오칩을 ECIS 리더의 탈착식 플라스틱 트레이에 넣고 뚜껑을 닫은 다음 채워진 주사기를 외부 바이오칩 포트에 부착합니다.

마지막으로 주사기 플런저를 부착합니다. 리더의 기본 화면에서 Next를 선택하여 사전 테스트를 시작합니다. 그런 다음 소프트웨어는 초기 임피던스를 확인합니다.

임피던스가 범위 내에 있으면 화면에 Cartridge passed"가 등록되고 사용자에게 다음을 선택하도록 지시합니다. 그런 다음, 소프트 키보드를 사용하여 샘플 정보를 입력한 다음, 완료되면 수락을 선택합니다. 이 시점에서 삽입된 바이오칩에서 2분의 임피던스 데이터가 수집되고 화면 타이머가 카운트다운 시간을 카운트다운합니다.

2분 후 다음을 누릅니다. 깜박이는 녹색 상자에서 Inject samples now(지금 샘플을 주입하십시오)"라는 메시지가 표시되면 부착된 주사기의 대조군 및 테스트 매체를 동시에 바이오칩 채널에 주입합니다. 완료되면 바이오칩의 주사기를 제자리에 둡니다.

ECIS 리더 소프트웨어가 테스트 중 어느 시점에서든 처리 채널이 제어 채널과 통계적으로 다르다고 판단하면 화면 디스플레이에 샘플이 오염된 것으로 표시됩니다. 그렇지 않으면 모니터링 기간이 끝날 때 오염이 감지되지 않았음을 나타냅니다. 각 샘플에 대해 테스트 결과를 Contaminated(오염됨)" 또는 Not contaminated(오염되지 않음)로 기록합니다.

테스트 실행이 끝나면 바이오칩을 제거하고 폐기합니다. 주사기, 테스트 바이알 및 테스트 중에 바이오칩이 들어 있는 이동식 플라스틱 트레이를 헹구고 자연 건조합니다. 여기에 표시된 13가지 화학 물질은 식수 오염 물질이 될 수 있는 광범위한 독성 산업 화합물을 대표하는 것으로 테스트를 위해 선택되었습니다.

테스트 중에 13개 중 9개는 인체 건강과 관련된 농도에서 1시간 이내에 전기 전지 기판 임피던스 감지에 의해 감지되었습니다. 전기 전지 기판 임피던스 감지 테스트 후 볼 수 있는 일반적인 출력은 다음과 같습니다. 오염된 샘플은 대조군의 깨끗한 물 샘플과 비교할 때 임피던스 레벨이 현저히 낮습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 무지개 송어 아가미 상피 세포의 단층으로 바이오칩을 준비하는 방법과 이후에 음용수 독성 평가를 위한 임피던스 기반 독성 테스트에 해당 바이오칩을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 바이오칩을 준비할 때 무균 상태로 작업하고 사용할 때까지 바이오칩을 냉장 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 바이오칩은 한 번만 사용할 수 있으며 그 후에는 폐기해야 합니다.

일단 마스터하면 바이오칩 준비는 약 10분 안에 완료할 수 있습니다. 칩은 배치로 준비되기 때문에 이것은 추정치입니다. 샘플 준비를 포함한 샘플 임피던스 테스트는 제대로 수행될 경우 약 1시간 10분이 소요됩니다.

이 절차에 따라 의심되는 화학 물질을 식별하기 위해 오염된 결과를 생성한 샘플에 대해 분석 화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 물 독성 감지에 관심이 있는 연구자들이 무지개 송어, 아가미 상피 세포 및 임피던스 감지를 사용하는 기술을 활용할 수 있는 길을 열었습니다. 이 기술이 유용하다는 것을 알게 되기를 바라며 이러한 새로운 기능이 촉진하는 데 도움이 될 수 있는 미래의 혁신을 기대

감사하고 좋은 하루 보내세요.