Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

이 프로토콜의 전반적인 목표는 모양체 돌연변이 마우스 달팽이관에서 planar-cell-polarity 표현형을 검사하는 것입니다. 이러한 기술을 통해 달팽이관 표현형을 광범위하게 자세히 설명할 수 있으며, 이를 통해 척추동물 PCP 신호 전달을 확립하는 데 있어 섬모 관여를 보다 정확하게 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 일단 숙달되면 절개된 달팽이관 상피를 다양한 유형의 표현형 분석에 사용할 수 있다는 것입니다.

실험 동물의 시약과 조직을 준비한 후 E16.5에서 p3의 발달 단계에서 메스 날이나 작은 가위를 사용하여 코에서 시작하여 자엽을 뻗은 시상 정중선을 따라 머리를 절개합니다. 한 쌍의 집게로 두개골의 각 절반에서 뇌를 제거합니다. 그런 다음 내이의 발달 중인 뼈 미로를 포함하는 측두골을 식별합니다.

해부 현미경으로 샘플로 작업하는 동안 한 쌍의 집게를 사용하여 뼈 미로 아래를 부드럽게 움직여 두개골에서 뼈 미로를 소중히 여깁니다. 절개 후 해부 집게의 끝을 사용하여 타원형 및 원형 창을 청소하고 나선 달팽이관의 정점에 작은 구멍을 만듭니다. 다음으로, 뼈 미로를 1.5ml의 4% 파라포름알데히드로 얼음 위에서 5분 동안 고정하여 구조막을 쉽게 제거할 수 있도록 합니다.

이제 뼈가 있는 미로를 PBS가 들어 있는 검은색 실리콘 엘라스토머 코팅된 해부 접시에 넣어 해부를 용이하게 합니다. 5번 집게를 사용하여 바깥쪽 연골을 제거하고 달팽이관을 노출시킵니다. 타원형 창에서 시작하여 집게의 아래쪽 끝을 타원형 창에 삽입하고 연골을 부드럽게 들어 올려 정점을 향해 천천히 위로 움직입니다.

다음으로, 가느다란 집게를 사용하여 달팽이관 기저부에 있는 라이스너 막을 꼬집고 위쪽으로 떼어냅니다. 감각 상피를 포함한 달팽이관의 등쪽 측면을 시각화합니다. 그런 다음 55번 집게를 사용하여 달팽이관 기저부의 구조막을 꼬집고 정점을 향해 위쪽으로 벗겨냅니다.

면역조직화학으로 최상의 이미지를 얻으려면 구조막을 완전히 제거하는 것이 필요하며 이는 주사 전자 현미경에 필수적입니다. 코르티 기관을 노출시킨 후 조직을 추가로 고정하고 면역조직화학을 수행하거나 프로토콜의 서면 부분에 자세히 설명된 대로 주사 전자 현미경을 준비합니다. 조직을 염색한 후 PBS가 함유된 검은색 실리콘 엘라스토머 접시에 샘플을 넣습니다.

가는 집게를 사용하여 달팽이관 나선에서 전정 부위를 제거합니다. 그런 다음 달팽이관 나선에서 기저에 있는 연골과 중간엽을 매우 조심스럽게 제거합니다. 나머지 달팽이관 나선에는 내부 열구, 코르티 기관 및 외부 열구가 포함되어 있습니다.

달팽이관 나선을 현미경 슬라이드에 놓인 PBS 한 방울로 옮깁니다. 흡수성 티슈나 여과지 조각으로 PBS를 흡수하고, 상피가 이동하여 겹치는 경우 달팽이관 나선의 위치를 부드럽게 다시 잡습니다. 장착 매체 한 방울을 달팽이관 샘플에 직접 떨어뜨리고, 기포가 생기지 않도록 주의하면서 커버 슬립을 샘플에 직접 부드럽게 놓습니다.

고배율 및 높은 개구수 대물렌즈가 장착된 에피형광등 또는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 달팽이관 유모 세포의 정점 표면 이미지를 캡처합니다. 더 낮은 대물렌즈를 사용하여 달팽이관 나선의 겹치는 이미지를 촬영하여 달팽이관의 길이를 정량화합니다. 다음 이미지는 기저 회전, 산후 일별 1형 달팽이관의 면역형광 염색을 보여줍니다.

Phalloidin은 입체섬모(stereocilia)에서 필라멘트 액틴(filamentous actin)을 표지하고, 세포 주변부에서 피질 액틴(cortical actin)을 표지합니다. Myosin VIIA는 내부 및 외부 유모 세포를 나타내는 마커입니다. ZO_1는 세포 사이의 밀접한 접합부에 레이블을 지정하여 세포 경계를 구별하는 훌륭한 마커가 됩니다.

아세틸화된 알파-튜불린(Acetylated alpha-tubulin)은 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 다발의 꼭짓점에서 키노실리움(kinocilium)의 마커로 사용됩니다. 내부 미세소관은 또한 아세틸화된 알파-튜불린(acetylated alpha-tubulin)에 의해 표지되며, 이는 흰색 별표로 표시된 바와 같이 기둥 세포에 특히 풍부합니다. 아세틸화 튜불린으로 염색된 E18.5에서 절개된 달팽이관 이미지는 대조군에 비해 IFT20 조건부 녹아웃 달팽이관 관이 현저히 짧아졌음을 보여줍니다.

다음 이미지는 BBS8 녹아웃 마우스에서 출생 후 0일차에 기저 달팽이관 회전의 전체 마운트 준비입니다. BBS8 녹아웃 달팽이관의 입체 섬모 다발은 오른쪽 화살표로 표시된 대로 다양하게 회전하거나 중간 화살표로 표시된 것처럼 평평하고 잘못 국소화됩니다. kinocilia가 잘못 국소화되었거나 왼쪽 화살표로 표시된 것처럼 axonemes가 누락되었습니다.

분석을 위해 달팽이관 표현형을 준비할 때 유전적 배경의 차이가 달팽이관 표현형을 수정할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 분석을 위해 리터메이트 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 추가 분석에는 인공와우 외삽물의 청력 검사 및 배양이 포함되며, 이를 통해 다양한 신호 활성화제 또는 억제제로 치료할 수 있으므로 관련된 발달 과정에 대한 기계론적 이해에 기여

이 동영상을 시청한 후에는 섬모 구성 요소의 역할과 PCP 신호전달에 대한 뚜렷한 효과를 분석하기 위해 달팽이관 조직을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.