마우스 귀와 꼬리 조직에서 생성 차 섬유 아세포 배양

본 프로토콜의 전체적인 목적은 생쥐의 귀와 꼬리로부터 일차 섬유아세포 배양을 확립하는 것입니다. 이 방법은 건강한 세포와 암세포의 차이와 같은 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 연구의 주요 장점은 세포를 분리하기 전, 실온의 배지에서 최대 10일 동안 보관된 귀로부터 섬유아세포를 생성할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 마우스 생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 랫드 및 토끼와 같은 다른 포유류 동물 유기체에도 적용 가능합니다. 조직을 수집하기 전, 10 centimeter 배양 접시에 10 milliliters의 완전 배지를 채웁니다. 그 후, 마우스를 안락사시킨 다음 멸균된 도구를 사용하여 조직 샘플을 수집합니다.

반지름 약 1cm 크기의 귀 조직과 약 5cm 길이의 꼬리 조직을 채취합니다. 채취한 조직을 70% ethanol 40mL가 담긴 원추형 튜브로 옮깁니다. 5분 동안 담가둔 후, 배양 후드 내의 10cm 오픈 배양 접시에서 5분간 공기 건조시킵니다.

조직이 마르면 배지가 충전된 플레이트로 옮깁니다. 이제 가위로 모든 조직의 털을 잘라내고, 조직을 3 mm보다 작은 조각으로 자릅니다. 잘게 자른 조직을 크라이오튜브(cryotube) 바이알로 옮긴 후, 바이알의 1.8 mL 표시선까지 collagenase D pronase 용액을 채웁니다.

이제 조직을 37 °C에서 200 rpm으로 흔들어주며 90분 동안 배양합니다. 후드 내에서 배양 접시에 완전 배지 10 mL를 채웁니다. 접시 위에 70 µm 세포 스트레이너를 놓고, 배양이 끝나면 조직 소화물을 스트레이너에 넣습니다.

이제 플런저를 사용하여 스트레이너 내의 조직을 갈아줍니다. 이 과정을 최소 5분 동안 수행하십시오. 가끔 스트레이너를 배지에 흔들어 분리된 세포가 씻겨 나오게 합니다.

충분한 수의 세포를 얻기 위해서는 소화된 귀 및 꼬리 조직을 잘 갈아주는 것이 중요합니다. 또한 조직을 갈아낸 후에는 세포 스트레이너(cell strainer)를 반드시 흔들어 주십시오. 이렇게 하면 스트레이너에 남아 있는 추가 세포들을 씻어낼 수 있습니다.

다음으로, 15 milliliter 원추형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 그런 다음, 스트레이너를 10 milliliters의 배지로 헹구고, 헹굼액을 수집액에 추가합니다. 이제 세포를 세척합니다.

먼저, 냉장 원심분리기를 사용하여 세포를 침전시킵니다. 둘째로, 상층액을 제거합니다. 셋째로, 10 milliliters의 완전 배지에 세포를 현탁합니다.

세척 과정을 한 번 더 반복한 후, 배양이 가능하도록 세포를 완전 배지에 넣어 절차를 마무리합니다. 세포를 배양하려면, 먼저 세포 현탁액을 10 milliliter 배양 접시로 옮깁니다. 그런 다음, 각 배양액에 10 microliters의 amphotericin B 용액을 첨가합니다.

이제 세포를 3일 동안 배양합니다. 3일째 되는 날, 배지를 amphrotericin B가 포함된 신선한 완전 배지로 교체합니다. 곧 배양 세포가 70% 밀도(confluency)에 도달하게 됩니다. 이때 배지를 제거하고 5 mL의 1X PBS로 배양물을 헹굽니다.

그런 다음, PBS를 2 mL의 1X trypsin EDTA 용액으로 교체하고 세포를 5분 동안 배양합니다. 짧은 배양 후, 디쉬를 가볍게 두드리고 각 디쉬에 6 mL의 신선한 완전 배지를 첨가합니다. 이제 디쉬에서 떨어진 세포를 피펫으로 분주하여 두 개의 15 mL 원추형 튜브에 옮깁니다.

그다음, 냉장 원심분리기를 사용하여 450 Gs에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 펠렛을 5 mL의 완전 배지에 다시 현탁하고 현탁액의 세포 밀도를 측정합니다. 이제 10 cm 디쉬당 200,000개의 세포가 되도록 분주합니다.

이 세포들을 70% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 3~4일 동안 배양한 다음, 세포를 수집하고 특정 밀도로 다시 분주하는 과정을 반복합니다. 이러한 방식으로 최대 25일까지 배양할 수 있습니다. 세포 추출 3일 후, 배지를 교체하기 전 배양액 내에 상당한 양의 잔해물이 관찰되었습니다.

세포 잔해를 흰색 화살표로 표시하였습니다. 스케일 바는 100 microns를 나타냅니다. 새로운 배지를 사용함으로써 세포 잔해가 유의하게 감소하였습니다.

상온에서 10일 동안 보관된 조직으로 배양한 지 3일 된 배양물은 섬유아세포가 상당히 강인하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 조직으로부터 5~6일 후 70~80%의 섬유아세포 합생도(confluency)를 달성했습니다. 세포는 섬유아세포 마커인 vimentin으로 라벨링되었으며, 이는 빨간색으로 나타납니다.

핵을 표지하기 위해 DAPI를 사용하였으며, 이는 파란색으로 나타납니다. 스케일 바는 10 microns입니다. 균일한 염색 결과는 섬유아세포 배양이 순수함을 시사합니다.

설명된 프로토콜을 통해 통상적으로 이러한 결과를 얻었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 여러분은 일차 섬유아세포 배양을 빠르고 신뢰성 있게 구축하는 최종 단계에 도달했을 것입니다. 이 절차를 수행하는 동안 조직에서 섬유아세포를 추출할 때 각별한 주의를 기울여야 하며, 조직을 충분히 분쇄하지 않으면 세포 수가 감소하는 결과가 나타날 수 있습니다.